基因工程 酵母菌基因工程(2)
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用
酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用酵母菌是一类在酒类、面包、酸奶等食品加工中被广泛应用的微生物，同时也是生物学研究中的重要模式生物。
近年来，随着生命科学领域的不断发展，酵母菌在遗传工程领域中的应用越来越受到关注，尤其在药物研发中有广阔的应用前景。
一、酵母菌的基本特点及其在基因工程中的优势1、酵母菌的基本特点酵母菌是一类单细胞真菌，其独特的生物学特性，使之在遗传工程及其他研究中得到广泛关注。
酵母菌具有生长快、培养简单、生产糖酵解酒精等方面的优点。
在酵母菌的基因表达及调控方面，其遗传学研究已经得到较为深入的探究，所以在基因工程领域中具有较高的应用价值。
2、酵母菌在基因工程中的优势酵母菌在基因工程领域的应用优势主要表现在以下几个方面：(1)基因操作方便：酵母菌够单细胞生物，体积较小，生长速度较快，培养操作简单。
同时，在酵母菌基因操作方面也相对简单，为学者的研究提供了较为良好的条件。
(2) 基因转化效率高：酵母菌的基因转化效率较高，且在基因转录、译码等方面的表达也较为稳定可靠。
因此，酵母菌是一种理想的表达载体。
(3)多样化的基因表达系统：在酵母菌中，拥有多样化的蛋白表达系统，包括表达外源蛋白、表达重组蛋白等。
同时，酵母菌具有多种诱导基因表达的方法。
二、酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用1、酵母菌在药物研发中的应用酵母菌在药物研发中的应用主要是通过基因操作，将模式生物转化成重要的药物分子表达体，在产生药物的过程中取得重要突破，为医学研究提供了强有力的支持。
酵母菌可以分泌酶类、激素和重组蛋白等，广泛应用于肿瘤治疗、抗体制作和激素治疗等领域。
2、酵母菌表达体在药物研发中的应用酵母菌表达体在药物研发及生产中，具有节约时间、费用，高效易行等优点。
酵母表达体已经在很多领域被广泛应用，其中较为重要的应用领域包括肿瘤治疗药物的研究和生产、激素药物的研发、安全、有效性及毒性试验。
3、酵母菌受体研究在药物研发中的应用酵母菌受体研究在药物研发中的应用，主要是通过基因操作，模拟人体受体，研究受体与药物之间的相互作用，探索受体的构造和药物的结构。
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
第八章酵母基因工程详解
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：
*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱
衡水中学2021届高三生物一轮复习-专题37 基因工程(二)
变式训练-5
（2016·江苏高考）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图 2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。 请回答下列问题：
变式训练-5
(1)若 BamHⅠ酶切的DNA末端与 BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部 位的6个碱基对序列为_______，对于该部位，这两种酶________(填“都 能”“都不能”或“只有一种能”)切开。 (2)若用 Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片 段。
。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，
其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是
。
答案
（1）Sau3AⅠ；两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端； （2）甲和丙；甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在 终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录； （3）E·coliDNA连接酶；T4DNA连接酶；T4DNA连接酶。 解析： （1）分析图解可知，限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端 相同，因此经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被 Sau3AⅠ酶切后的产物连接； （2）在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子应位于目 的基因的尾端，这样的基因才能表达，图中甲和丙均不符合，所以不能 在宿主细胞中表达目的基因产物； （3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性 末端又能连接平末端。
答案
D
解析：
用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因的两端将形成不同的粘性末 端，若用BglⅡ和Sau3AⅠ切割图乙所示质粒，质粒的两端也将形成这样 两种相同的粘性末端，它们可构成重组DNA分子，A正确；
2022版高考生物一轮复习第十单元现代生物科技专题专题二十五基因工程2试题含解析
专题二十五基因工程考点1 基因工程的基本工具与操作程序1.[2021某某某某阶段训练,12分]超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。
研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。
结合下图回答下列问题。
注:Hin d Ⅲ和Apa LⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
(1)将图中的重组DNA分子用Hin d Ⅲ和Apa L Ⅰ完全酶切后,可得到种DNA片段。
(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶,理由是。
(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为。
为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的作探针与从受体细胞中提取的RNA进行分子杂交检测,分子杂交的原理是。
(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其氨基酸序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经获得所需的基因。
2.[2020某某示X高中联考,15分]南极某种鱼含有抗冻基因,如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。
请回答下列相关问题:(1)利用①过程的方法获取目的基因需要用到酶。
②过程中常需要用到的工具酶是。
(2)通过①、②过程成功构建的重组质粒,除目的基因外,还应该具备等。
(3)将目的基因导入番茄体细胞的方法是利用农杆菌的作用,其原理是。
(4)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中表达出相应的蛋白质,可以采用方法,除进行分子检测外,有时还需要进行的鉴定。
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程3.[2021某某某某质量检测,12分]植物基因工程技术的发展为人类更好地利用盐碱地提供了可能。
请回答下列问题:(1)欲培育转基因耐盐水稻,需要完成的基因工程的核心步骤是,一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还必须有、以及标记基因。
(2)用PCR技术扩增耐盐基因的原理是,目前将耐盐基因导入双子叶植物最常用的方法是。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
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对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能
正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因 此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体；
mnn alg och
倾向，因此超糖基化缺陷株
非常重要。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
蛋白酶体
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖 的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子 菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个
1. 酿酒酵母中的2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 环状质粒，拷贝数达50至100个。 IRs 反向重复序列，600 bp，重组
RAF REP1 FLP
IR
A ori IR 同源重组 REP2
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质 粒类似。
STB
B
2. 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL2 拷贝数为50-100个，分别携带K1
反向重复序列 pGKL1 8.9 kb DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基
K2两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工
ssc1 ssc2
rgr1
ose1 ssc11 rho-
提高重组蛋白表达
提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
转录水平
转录水平 羧肽酶Y 转录水平
酵母菌克隆表达质粒的构建
1. 含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb
就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原
核生物表达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
2. 含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个
3. 含有TEL的YAC质粒的构建
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧 糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白质 的糖基化系统，但野生型酿 酒酵母对异源蛋白的糖基化 反应很难控制，呈超糖基化
突变类型 生物效应
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型 能抑制超糖基化的突变类型
毕赤酵母属
裂殖酵母属
如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
汉逊酵母属
如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵
母表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
UBA 1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解；
Ubc4 - ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体