基因工程酵母基因工程
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA着丝粒区，与染色体均匀分配有关 的序列。
将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp。 YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个。
含有TEL的YAC质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS) 酵母菌是最简单的真核模式生物
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热 休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极少发生
酵母菌电击转化法
优点： ➢不依赖于受体细胞的遗传特征 ➢培养容易 ➢转化率可高达105 / mg DNA。
能导致酿酒酵母中重组蛋白c1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖
基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核
心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白质
能抑制超糖基化的突变类型
的糖基化系统，但野生型酿 突变类型
生物效应
酒酵母对异源蛋白的糖基化 反应很难控制，呈超糖基化 倾向，因此选择超糖基化缺 陷株非常重要。
mnn alg och
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型
营养缺陷型的互补基因
用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基 因和显性基因两大类
B 酵母菌的宿主系统
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3
靶蛋白 Lys
ubiquitin ligase E3
靶蛋白 Lys
蛋白酶体
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统
E 酵母菌的表达系统
F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的 单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲 （担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500 多个种组成。酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记 基因、克隆位点、大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp。 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp。
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个， 但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分 配不均匀所致。
毕赤酵母属 裂殖酵母属
如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕 赤酵母表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 Ubc4 - ubc5 双突变型： 泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链环状质粒，拷贝数达50至100个。
转化质粒在酵母细胞中的命运
单链的转化率是双链的10-30倍
含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合
克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体DNA 的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的 50-80%
用于转化子筛选的标记基因
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基 因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体 DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染 色体DNA区域。
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因
第十五章--酵母基因工程
2
15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
4
15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
5
② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
酵母菌作为模型生物在研究中的应用
酵母菌作为模型生物在研究中的应用酵母菌是一种单细胞真菌，广泛应用于科学研究中。
作为一种模型生物，他们的简单结构和基因组使得他们成为了基因工程、生物学和医学的理想标准。
今天，我们将探讨一下酵母菌作为模型生物在研究中的应用。
1. 酵母菌的简介酵母菌是真菌界的一种单细胞生物，其名字来源于其在酿造过程中的作用。
它们可以通过无性和有性生殖繁殖，生长极其迅速，只需要十几小时就能分裂，因此酵母菌也被称为毒酒菌。
2. 酵母菌在基因工程中的应用酵母菌的基因组十分简单，只包含6000个左右的基因，而人类基因组则包含3亿多个基因，因此人类的基因研究需要花费大量的时间和精力，而酵母菌则成为了基因工程领域的重要工具。
科学家可以通过人为调整酵母菌基因组，研究基因在细胞生长和发育过程中的作用。
研究表明，酵母菌中的一些基因与健康和疾病相关，因此可以通过对酵母菌的研究来寻找人类疾病的治疗方法。
3. 酵母菌在生物学研究中的应用酵母菌也被广泛用于生物学研究。
在细胞分裂、DNA复制、细胞凋亡等领域中，酵母菌是研究者经常使用的模型生物之一。
他们的分裂周期短，因此可以更容易地观察研究对象。
通过对酵母细胞的观察，科学家可以更好地了解细胞分裂、细胞衰老等基本细胞活动的发生和机制。
4. 酵母菌在医学研究中的应用除了基因工程和生物学外，酵母菌也在医学研究中起着重要的作用。
酵母菌能够模拟许多人类疾病，如癌症、帕金森病和阿尔茨海默病等。
科学家可以通过对酵母菌进行基因改造，将与人类疾病相关的基因注入进去，然后观察研究其对酵母菌的影响和机制。
这种方法被称为“酵母菌疾病模型”，已经被广泛应用于研究许多疾病的治疗方法。
5. 酵母菌在深度学习中的应用近年来，酵母菌还被应用于计算机领域，特别是在深度学习算法中的应用。
科学家通过对酵母菌的生长过程进行监控和分析，建立了酵母菌生长的数值模型，提高了深度学习训练模型的精度和速度。
总之，作为一种模型生物，酵母菌在科学研究中发挥着举足轻重的作用。
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
酵母基因工程技术的综述与进展展望
酵母基因工程技术的综述与进展展望引言:酵母是一类常见的真核生物，广泛存在于自然界中。
由于酵母具有独特的细胞结构和代谢特性，成为许多科学研究的理想模型生物。
基因工程技术的发展使得研究者们能够通过编辑和改造酵母的基因组，来实现多种生物学和应用学的目标。
本文将对酵母基因工程技术的现状进行综述，并展望未来的发展前景。
一、酵母基因工程技术的发展历程酵母基因工程技术的研究始于20世纪70年代。
最早的酵母基因工程是通过改变酵母细胞的遗传背景，来研究基因功能。
而后，随着重组DNA技术的引入，酵母基因工程迅速发展起来。
1981年，科学家们成功地将人类基因插入到酵母细胞中，这是一个重大突破。
随后的几十年间，酵母基因组测序的完成以及基因敲除和基因重组技术的发展进一步推动了酵母基因工程技术的成熟。
二、酵母基因工程技术的应用领域1. 功能基因组学研究：通过酵母基因组的全面敲除和突变，可以研究基因的功能和相互作用。
这有助于更好地理解酵母细胞的生物学过程，也有助于揭示生物学中的一些基本原理。
2. 药物筛选和开发：酵母作为模型生物，在药物筛选和开发领域具有重要地位。
通过构建酵母表达外源蛋白的系统，可以进行大规模的化合物筛选，以寻找新的药物靶点和治疗方法。
3. 工业应用：酵母在生物技术和食品工业中具有广泛的应用。
例如，酵母可以被用于生产酒精、酵母提取物和酵母蛋白等。
通过基因工程技术改造酵母菌株，可以增加产量和改良产品的品质。
三、酵母基因工程技术的挑战与限制尽管酵母基因工程技术在许多领域中取得了显著进展，但仍然面临一些挑战和限制。
1. 基因组稳定性：酵母细胞往往会发生基因组重排和位点突变等现象，这导致基因敲除和基因重组等操作的结果不一致。
因此，在酵母基因工程中，确保基因组的稳定性仍然是一个关键问题。
2. 效率和选择性：目前的酵母基因工程技术中，基因敲除和基因重组等操作的效率相对较低，并且选择性也较差，这限制了其在实际应用中的广泛推广。
酵母生物学的重要性与应用
酵母生物学的重要性与应用酵母一直被人们视为生物学研究的重要模型生物，它有着独特而重要的生物学特征。
尽管酵母看起来很小，但是它们具有复杂的代谢路径和细胞信号传递系统，因此在生物学、医学、农业和食品科学领域中具有重要的应用价值。
一、酵母生物学的重要性酵母在生物学研究中具有广泛的应用，其重要性主要体现在以下几个方面：1.基础生物学研究中的应用酵母是真核生物的重要模式生物，在分子生物学、生物化学、细胞生物学等领域中具有广泛的应用价值。
许多基因结构和生物化学过程的研究都是在酵母中完成的，如DNA重复、下游信号传递机制、激活转录、细胞分裂、细胞凋亡等重要生物学过程。
2.疾病生物学研究中的应用許多疾病像肝癌、白血病和类风湿性关节炎等都是由细胞信号传递异常引起的，研究酵母的信号传递通路可以为疾病形成和治疗提供有价值的信息。
3.食品科学与药学中的应用酵母被广泛应用于生产酸奶、酸面包、啤酒、葡萄酒等发酵食品和药物制剂中，因为它们具有高度的可控性、适应性和生产能力。
二、酵母的应用1.酵母在基础生物学研究中的应用作为研究生物信息学、遗传学、细胞生物学、分子生物学和生化学等学科的模型生物，酵母在基础生物学研究中具有广泛的应用。
酵母在基因研究中的应用：酵母是一种简单、易于操作的模型生物，基因组已经被完全测序，其基因组中有5,800个基因，与人类基因的6,000~8,000个数量相当。
因此，酵母被广泛应用于基因结构和功能研究中，如基因的定位、识别和表达控制等。
酵母在生物化学和分子生物学中的应用：许多生物化学与分子生物学方面的探索都是以酵母为模型生物进行的，如酵母中的RNA和DNA代谢、蛋白质合成等生化过程。
2.酵母在基因工程中的应用酵母也被广泛应用于基因工程中，以开发药物、制备新的化学品和生产传统食品和饮料。
酵母在药物开发中的应用：酿酒酵母被广泛应用于药物生产中，特别是在抗癌药物的开发中。
酵母生产的可人纤维蛋白原能够用于生产人胰岛素等药物。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导