酵母菌的基因工程
第十五章--酵母基因工程
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15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
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15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
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② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
酵母菌作为模型生物在研究中的应用
酵母菌作为模型生物在研究中的应用酵母菌是一种单细胞真菌，广泛应用于科学研究中。
作为一种模型生物，他们的简单结构和基因组使得他们成为了基因工程、生物学和医学的理想标准。
今天，我们将探讨一下酵母菌作为模型生物在研究中的应用。
1. 酵母菌的简介酵母菌是真菌界的一种单细胞生物，其名字来源于其在酿造过程中的作用。
它们可以通过无性和有性生殖繁殖，生长极其迅速，只需要十几小时就能分裂，因此酵母菌也被称为毒酒菌。
2. 酵母菌在基因工程中的应用酵母菌的基因组十分简单，只包含6000个左右的基因，而人类基因组则包含3亿多个基因，因此人类的基因研究需要花费大量的时间和精力，而酵母菌则成为了基因工程领域的重要工具。
科学家可以通过人为调整酵母菌基因组，研究基因在细胞生长和发育过程中的作用。
研究表明，酵母菌中的一些基因与健康和疾病相关，因此可以通过对酵母菌的研究来寻找人类疾病的治疗方法。
3. 酵母菌在生物学研究中的应用酵母菌也被广泛用于生物学研究。
在细胞分裂、DNA复制、细胞凋亡等领域中，酵母菌是研究者经常使用的模型生物之一。
他们的分裂周期短，因此可以更容易地观察研究对象。
通过对酵母细胞的观察，科学家可以更好地了解细胞分裂、细胞衰老等基本细胞活动的发生和机制。
4. 酵母菌在医学研究中的应用除了基因工程和生物学外，酵母菌也在医学研究中起着重要的作用。
酵母菌能够模拟许多人类疾病，如癌症、帕金森病和阿尔茨海默病等。
科学家可以通过对酵母菌进行基因改造，将与人类疾病相关的基因注入进去，然后观察研究其对酵母菌的影响和机制。
这种方法被称为“酵母菌疾病模型”，已经被广泛应用于研究许多疾病的治疗方法。
5. 酵母菌在深度学习中的应用近年来，酵母菌还被应用于计算机领域，特别是在深度学习算法中的应用。
科学家通过对酵母菌的生长过程进行监控和分析，建立了酵母菌生长的数值模型，提高了深度学习训练模型的精度和速度。
总之，作为一种模型生物，酵母菌在科学研究中发挥着举足轻重的作用。
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
酵母菌基因组学研究和应用
酵母菌基因组学研究和应用酵母菌是一类单细胞真核生物，广泛存在于自然界中的许多环境中，包括自然发酵的果汁、发酵酒类食品、发酵面包等。
自20世纪初期以来，酵母菌被广泛应用于生物学研究和微生物技术产业中。
随着生物技术的飞速发展，酵母菌基因组学的研究有了长足的进步，对于深入探索酵母菌的生命特性及应用前景有着深远的影响。
I. 酵母菌基因组及其分子特性酵母菌基因组大小一般为12～15Mb，重复序列少且样本具有代表性。
经过多年的研究，人们从酵母菌中发现了许多重要的分子功能，如DNA复制、RNA转录、蛋白质合成和细胞分裂等，这为酵母菌成为分子生物学研究的模式生物提供了坚实基础。
同时，酵母菌基因组也是微生物基因组学研究重要的研究对象，其具有以下特点：1. 基因易于鉴定和定位酵母菌基因在基因组中数量极少，约2-3万个，大多已经被鉴定和定位。
从而将酵母菌生物系统作为研究模板，有利于快速且准确地确定细胞重要功能相关基因的定位和作用。
2. 基因可被显性改造酵母菌非常适合基因工程技术，其基因组可接受外源DNA，实现易于实现转化和改造。
此外，许多酵母菌遗传突变的同时保持菌体可生長（生存能力），从而实现适应自然界的特定条件。
II. 酵母菌在生物研究中的应用1. 酵母菌遗传学酵母菌遗传学研究从早期的生理和形态学遗传学一直发展到现代分子遗传学。
遗传学实验广泛应用于遗传变异的分析、过表达、基因敲除、基因结构和功能分析等领域。
遗传变异分析是酵母菌基因组研究的重点和核心，基本原理是通过构建遗传突变株系，利用突变表型特征鉴定与细胞生理生物学和分子生物学相关的基因、信号阶段等。
2. 酵母菌的系统生物学研究系统生物学是细胞分子行为研究的有力工具，同时也是对生命基础物理化学本质、分子演化、生命交流和植物与动物生态适应等多样性和复杂性的全面理解。
酵母菌是已知物种中的最简单系统之一，通过在酵母菌基因组及其调控层次上的研究，人们已经尝试建立符合自然进化基础系统演化发展菌体模型等，从而推动生物学研究发展。
酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用
酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用酵母菌是一类在酒类、面包、酸奶等食品加工中被广泛应用的微生物，同时也是生物学研究中的重要模式生物。
近年来，随着生命科学领域的不断发展，酵母菌在遗传工程领域中的应用越来越受到关注，尤其在药物研发中有广阔的应用前景。
一、酵母菌的基本特点及其在基因工程中的优势1、酵母菌的基本特点酵母菌是一类单细胞真菌，其独特的生物学特性，使之在遗传工程及其他研究中得到广泛关注。
酵母菌具有生长快、培养简单、生产糖酵解酒精等方面的优点。
在酵母菌的基因表达及调控方面，其遗传学研究已经得到较为深入的探究，所以在基因工程领域中具有较高的应用价值。
2、酵母菌在基因工程中的优势酵母菌在基因工程领域的应用优势主要表现在以下几个方面：(1)基因操作方便：酵母菌够单细胞生物，体积较小，生长速度较快，培养操作简单。
同时，在酵母菌基因操作方面也相对简单，为学者的研究提供了较为良好的条件。
(2) 基因转化效率高：酵母菌的基因转化效率较高，且在基因转录、译码等方面的表达也较为稳定可靠。
因此，酵母菌是一种理想的表达载体。
(3)多样化的基因表达系统：在酵母菌中，拥有多样化的蛋白表达系统，包括表达外源蛋白、表达重组蛋白等。
同时，酵母菌具有多种诱导基因表达的方法。
二、酵母菌遗传工程及其在药物研发中的应用1、酵母菌在药物研发中的应用酵母菌在药物研发中的应用主要是通过基因操作，将模式生物转化成重要的药物分子表达体，在产生药物的过程中取得重要突破，为医学研究提供了强有力的支持。
酵母菌可以分泌酶类、激素和重组蛋白等，广泛应用于肿瘤治疗、抗体制作和激素治疗等领域。
2、酵母菌表达体在药物研发中的应用酵母菌表达体在药物研发及生产中，具有节约时间、费用，高效易行等优点。
酵母表达体已经在很多领域被广泛应用，其中较为重要的应用领域包括肿瘤治疗药物的研究和生产、激素药物的研发、安全、有效性及毒性试验。
3、酵母菌受体研究在药物研发中的应用酵母菌受体研究在药物研发中的应用，主要是通过基因操作，模拟人体受体，研究受体与药物之间的相互作用，探索受体的构造和药物的结构。
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
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酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1～5个
含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10～30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 数的50%～80%
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1%～ 2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重 制约。 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
显性标记基因
显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 遗传表型 抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺
aph cat dhfr
cup1
suc2 ilv2
铜离子螯合物
蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
耐受铜离子
耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
GAL10 Promoter GAL80 GAL4 UAS GAL1 GAL7 GAL10
半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
外源基因稳态mRNA的浓度 外源基因mRNA的翻译活性 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子
a – a 型启动子：
酿酒酵母有a和a两种单倍 体，分别由MATa和MATa hmla2-102 35℃ Sir3-8TS a2 a1 a 型启动子 MATa 25℃ 受体细胞基因组 Sir3-8TS a1 a 型启动子 重组质粒
两个等位基因决定。
a1因子决定a细胞特征表达 a2因子阻遏a细胞特征表达
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因， 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区 域。
7 酵母菌的基因工程
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%
以上的氨基酸是由25个密码子编码的
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征
酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）
a 型启动子
a1-a2阻遏a细胞特征表达
编码a2因子的基因突变型 hmla2-102能产生a2变体，
hmla2-102
MATa
a 型启动子
它能灭活a1，同时阻遏a型
a1
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
酿酒酵母 的半乳糖 利用酶系
由GAL1 GAL7和 GAL10 基因编码 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
毕赤酵母属
裂殖酵母属
如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
汉逊酵母属
如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想。
7 酵母菌的基因工程
E 酵母菌的表达系统
酵母菌启动子的可控性 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子
pho4TS-PHO5启动子：
酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开 PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子 PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活 因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭 23℃诱导表达
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
7 酵母菌的基因工程
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
能抑制超糖基化的突变类型 突变类型 生物效应 甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型
mnn alg och
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys
HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
STB
B
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携带K1
反向重复序列 pGKL1 8.9 kb DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基
K2两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被
转录水平
羧肽酶Y 转录水平
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能
大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb
就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平
ssc1 ssc2 rgr1
ose1
ssc11 rho-
提高重组蛋白表达
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：