第四章 生物化学与分子生物学技术实践 课件 苏教版选修一
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高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术 第2节 分子生物学技术素材 苏教版选修1
第四章生物化学与分子生物学技术第2节分子生物学技术1．DNA片段的PCR扩增（1）准备器材(2）在0.2 mL PCR薄壁离心管中加入5_μL10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2，29_μL双蒸水。
(3）煮沸5_min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/μL加入Taq聚合酶。
(4)扩增DNA片断的反应程序:将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。
在94_℃的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ℃,30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上过程循环30次）。
最后一次延伸条件为72_℃,1_min。
运行反应程序。
2．DNA分子的测定［合作探讨]探讨1：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？提示：在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水都要在使用前进行高压灭菌.探讨2：为什么要将微量离心管放在离心机上进行离心？提示:离心的目的是使反应液集中在离心管底部。
探讨3：PCR需要耐高温的Taq DNA聚合酶、引物等条件,如何通过设置对照实验进行验证？提示：在对照组中不加入Taq DNA聚合酶或引物，与实验组形成对照，就可以证明PCR 需要耐高温的Taq DNA聚合酶和引物。
［思维升华]1．PCR实验操作的注意事项（1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。
(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量,用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等,均有可能导致DNA片段扩增的失败。
（5） PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。
攀上山峰，见识险峰，你的人生中,也许你就会有苍松不惧风吹和不惧雨打的大无畏精神，也许就会有腊梅的凌寒独自开的气魄,也许就会有春天的百花争艳的画卷，也许就会有钢铁般的意志。
高考生物大一轮复习第四部分生物化学与分子生物学技术实践课件-苏教版选修1
定时检测
1.2008年5月20日民政部等制订汶川大地震遇难人 员遗体处理意见指出，无法确认遇难者身份的， 由公安部门提取可供DNA检验的检材以便事后身 份辨认。事后的遗体辨认可借助于DNA杂交技 术，即从遗体细胞与死者家属提供的死者生前生 活用品中分别提取DNA，然后借助DNA杂交技术对 遗体进行确认。据此回答： （1）为了确保辨认的准确性，需要克隆出较多 的 DNA样品。这需借助PCR技术。使用PCR技术的具 体实验操作顺序是：
优点
简单易行，便于 分离
局限 性
水中蒸馏会导致 原料焦糊和有效 成分水解等问题
压榨法
通过机械加压，压榨出 果皮中的芳香油
（1）石灰水浸泡、漂洗 （2）压榨、过滤、静置 （3）再次过滤
适用于柑橘、柠檬等易 焦糊原料的提取
生产成本低，易保持原 料原有的结构和功能
分离较为困难，出油率 相对较低
有机溶剂萃取
，
原料在加入前，一般要进行
、 处理。
（3）该萃取过程采用的是水浴加热，其目的是
。
（4）为了取得最佳萃取效果，萃取的时间应该
。
解析 图示装置为萃取装置，其中⑤为冷凝管，其 作用在于降温，以防止加热时有机溶剂挥发，④是 烧瓶，其内装有萃取剂，胡萝卜素的适宜萃取剂是 石油醚，为防止有机溶剂明火加热时引起燃烧、爆 炸，萃取时有必要采用水浴加热，而不用明火 加热。 答案 （1）冷凝管 降温，防止加热时有机溶剂 挥发 （2）烧瓶 石油醚 粉碎 干燥 （3）避 免使用明火加热引起燃烧、爆炸 （4）长
2.玫瑰精油的提取流程 鲜玫瑰花+清水→水蒸气蒸馏→油水混合物 加入NaCl 分离油层 加入无水Na2SO4 除水 过滤 玫瑰油
3.玫瑰精油提取操作的关键 （1）安装装置顺序：从左到右，自下而上。 （2）温度计位置：温度计水银球的上限与蒸馏瓶 侧管的下限处在同一水平线上。 （3）冷凝管中的水流向：从下方进水，上方出 水，与蒸气流向相反。
高中生物(苏教版)选修1课件：专题归纳课4第4章 生物化学与分子生物学技术实践(共42张PPT)
及电场强度等有关。
【答案】 C
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蒸馏装置及各部分的作用
如图所示，整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其 中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边 的部分用来接收冷凝后的蒸馏物。安装仪器一般都按照自下 而上、自左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具 体安装顺序和方法如下：
A．纯化蛋白质的方法有透析法、萃取法和电泳法 B．利用透析法可将蛋白质与小分子物质完全分离开 C．离心沉降法主要利用了分子大小和密度不同 D．电泳速度的大小只与粒子所带电荷的多少有关
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【解析】
萃取法是提取植物芳香油的方法；透析法可
使小分子物质透过半透膜与蛋白质分离，但分离不完全；电 泳速度除与粒子带电荷多少有关外，还与粒子大小、形状以
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生物技术实践
【解析】
PCR 过 程 与 细 胞 内 的 DNA 复 制 过 程 相 比
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【解析】
(1) 水蒸气蒸馏装置中①表示温度计，②表
示出水口，③表示进水口。(2)水从进水口进入，从出水口流
出，起到冷凝作用。(3)水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将
挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却 后，混合物又会重新分出油层和水层，从而将芳香油分离出 来。 (4) 过滤得到的油层中含有少量的水分，可以用无水 Na2SO4 除 去 。 (5) 出 油 率 ＝ 芳 香 油 质 量 / 原 料 质 量 ＝
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芳香油质量 出油率＝ × 100%。如果出油率高，说明实验 原料质量 方案设计合理；如果出油率低，可以从实验方法的选择、实 验过程的操作等各方面分析原因，改进后再作尝试。
2019_2020学年高中生物第4章生物化学与分子生物学技术实践第1节生物成分的分离与测定技术课件苏教版选修1
么安装在进水口的上端？ 提示：目的是为了使产生的蒸气充分冷却。
[思维升华] 1．提取方法 基本方法有三种：蒸馏法、压榨法和萃取法。具体采用哪种方 法要根据植物原料的特点来决定。 最常用的方法——水蒸气蒸馏法 (1)原理：水和芳香油的沸点不同，利用水蒸气将挥发性较强的 植物芳香油携带出来，形成油水混合物，再冷却分离。
(2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前， 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不 宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分 离效果。
(3)结果及其分析 ①结果：
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱示意图
②结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出： a．血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其 他依次是：γ球蛋白＞α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β球蛋白。 b．由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球 蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为 α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β 球蛋白＞γ球蛋白。
[解析] 水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植 物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物又会重新分出 油层和水层。用水蒸气蒸馏法提取芳香油时，原料放入 B 瓶中，通 入水蒸气的玻璃管到达瓶底，让水蒸气自下而上进行蒸馏。A 瓶中 水量不能加满，约占 2/3 就行，为防止水暴沸，可向 A 瓶内放入几 粒沸石或碎玻璃、碎砖瓦等。薄荷油具有挥发性，因此在接收瓶口 上盖一小块铝箔或牛皮纸。
提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破 裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能 使血红蛋白质与杂质血浆蛋白混在一起加大了分离的难度。
[思维升华] 1．蛋白质的分离方法 (1)薄膜透析法 ①原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。 ②目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。 ③常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。 ④步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析 液中即可。
[思维升华] 1．提取方法 基本方法有三种：蒸馏法、压榨法和萃取法。具体采用哪种方 法要根据植物原料的特点来决定。 最常用的方法——水蒸气蒸馏法 (1)原理：水和芳香油的沸点不同，利用水蒸气将挥发性较强的 植物芳香油携带出来，形成油水混合物，再冷却分离。
(2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前， 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不 宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分 离效果。
(3)结果及其分析 ①结果：
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱示意图
②结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出： a．血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其 他依次是：γ球蛋白＞α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β球蛋白。 b．由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球 蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为 α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β 球蛋白＞γ球蛋白。
[解析] 水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植 物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物又会重新分出 油层和水层。用水蒸气蒸馏法提取芳香油时，原料放入 B 瓶中，通 入水蒸气的玻璃管到达瓶底，让水蒸气自下而上进行蒸馏。A 瓶中 水量不能加满，约占 2/3 就行，为防止水暴沸，可向 A 瓶内放入几 粒沸石或碎玻璃、碎砖瓦等。薄荷油具有挥发性，因此在接收瓶口 上盖一小块铝箔或牛皮纸。
提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破 裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能 使血红蛋白质与杂质血浆蛋白混在一起加大了分离的难度。
[思维升华] 1．蛋白质的分离方法 (1)薄膜透析法 ①原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。 ②目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。 ③常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。 ④步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析 液中即可。
《金版新学案》2018-2019高中生物(苏教版)选修1课件：第四章 生物化学与分子生物学技术实践 第4章 第1节
分离出不同种类的蛋白质。 支持物 电泳。 ③常用方法：__________
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
自主学习·新知突破 合作探究·课堂互动 高效测评·知能提升
[思考探讨] 提示：
1．分离蛋白质的过程是怎样的？
蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分
子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
自主学习·新知突破 合作探究·课堂互动 高效测评·知能提升
一、蛋白质的分离与纯化
1．蛋白质的提取
(1)将生物组织进行机械破碎，获得细胞。
(2) 选用合适的方法如研磨法、超声波法、酶解法破碎细 胞，使各种蛋白质释放出来。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
2．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？ 提示： 胀破。 不能，若用蒸馏水洗涤红细胞，红细胞渗透吸水
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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3． 在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是 什么？
提示：
加入蒸馏水使红细胞吸水胀破，细胞膜的主要成
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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第 四 章 生物化学与分子生物学技术实践
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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第一节
生物成分的分离与测定技术
生物化学与分子生物学技术实践
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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[思考探讨] 提示：
1．分离蛋白质的过程是怎样的？
蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分
子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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一、蛋白质的分离与纯化
1．蛋白质的提取
(1)将生物组织进行机械破碎，获得细胞。
(2) 选用合适的方法如研磨法、超声波法、酶解法破碎细 胞，使各种蛋白质释放出来。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
2．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？ 提示： 胀破。 不能，若用蒸馏水洗涤红细胞，红细胞渗透吸水
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3． 在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是 什么？
提示：
加入蒸馏水使红细胞吸水胀破，细胞膜的主要成
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第 四 章 生物化学与分子生物学技术实践
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第一节
生物成分的分离与测定技术
生物化学与分子生物学技术实践
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【课堂新坐标】2016-2017学年高中生物苏教版选修一课件：第4章 生物化学与分子生物学技术实践 第2节
【解析】 变性后的DNA在缓慢降温后才会退火；变性与在生物体内解旋过 程的条件不同，实质相同；任一DNA片段都有2个游离的磷酸基(5′端)和2个3′ 端。
②TaqDNA聚合酶的功能是_________________________。 ③TaqDNA聚合酶的化学本质为蛋白质，可用________________法和 ________________法进行分离。 (3)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________中才能进行，并且要严格 控制________条件。 (4)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是________________。
【解析】 PCR技术是利用热变性原理让模板DNA分子解旋的而不是通过解 旋酶的作用。 【答案】 B
2．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究 的问题，从而被广泛应用，此过程需要TaqDNA聚合酶。请回答有关问题： (1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用 ____________________________________________________________ ____________________________________________________________。
3．PCR反应的过程
在 94 变性— 解旋为
℃高温下，作为模板的双链DNA 单链DNA
↓ 反应体系的温度降至 55 ℃，使得 退火(复性)— 引物 与作为模板的单链DNA上的 特定部位相互配对、结合 ↓ 反应体系的温度回升到 72 ℃左右， 脱氧核苷酸 按照碱 在单链上4种 延伸— 基互补配对的原则连接在引物之后， 使引物链延伸，形成互补的DNA双链
【答案】 (1)高温使DNA分子热变性 汰了绝大多数微生物 ②催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
苏教版生物选修1全册精品课件 第四章第一节
想一想
人们常说的血清蛋白是一种蛋白质吗？说说你了
解的情况。
提示：不是一种蛋白质，而是包含多种蛋白质： 清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球
蛋白。
三、从生物材料中提取某些特定成分 挥发性 ，能与水蒸气一 芳香油特点：具有__________ 有机溶剂 ，如石油醚、乙 起蒸发，易溶于___________ 醚或________ 酒精 等。 橘皮芳香油的特点：橘皮芳香油存在于
度越快；反之，则越慢。
判一判
1．(1)常用吸水涨破的方法释放哺乳动物成 熟的红细胞中的蛋白质。(√) (2)通过透析可以去除样品中分子质量较大的
杂质。(×)
(3)电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电 性相同的电极移动的现象。(×)
二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作 1.原理
血清蛋白包含一组蛋白质，其大小、形状、所
特别提醒 第一步中缓冲液要用容量瓶准确配制，试剂要
多配一些备用。第二步中要驱除气泡，贴紧贴
实，避免影响电泳速度和分离效果。第三、四 步中作有记号的醋酸纤维薄膜光泽面朝下。第
七步中染色时间要适中(5～10 min)，不宜过长
或过短。第八步中漂洗要彻底，防止遮盖蛋白 质色带颜色。
2.响电泳泳动速度的因素 影响电泳泳动速度的因素很多，其中主要因素
带净电荷各不相同，在电场作用下会发生 __________ 。 电泳
2.操作流程
架滤纸桥 →浸泡薄膜→细心点样 配制试剂→__________ 染色 →漂洗 平悬薄膜 →实施电泳→_________ →__________ →脱色。
3.实验结果分析 呈现5条蛋白质色素带，从点样处一侧开始， β-球 依次是：γ-球蛋白、___________ 蛋白、α2-球 蛋白、α1-球蛋白和__________ 。 清蛋白
苏教版高中生物选修1 第四章章末复习：《生物化学与分子生物学技术实践》章末复习课件
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【例1】试回答下列“蛋白质提取与分离实验”的有关问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以 去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水 的原因是 防止红细胞吸水破裂 。
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出不同种类蛋白质的目的。
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3.醋酸纤维薄膜电泳法 (1)原理：不同的物质在同一电场中的泳动速度不同。 (2)影响因素：泳动速度主要取决于带电颗粒的性质，即 颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少。一般来说，带 电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则 在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。此外，电场 强度、溶液的pH等因素对泳动速度也有影响。 (3)优点：简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量 少、没有吸附现象、电泳后区带界限清晰等优点。
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知识点三
PCR技术
自主预习·自我领悟
1.PCR的原理 (1)变性：当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单 链(如下图)。
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(2)退火：系统温度下降至55 ℃左右时，两种引物通过碱基 互补配对原则与两条单链DNA结合(如下图)。
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知识点二 提取芳香油的方法
自主预习·自我领悟
1.植物芳香油的提取方法有 原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出 来。
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细胞内 ATP提供能量 解旋酶、DNA聚合酶 伴有转录,产生引物 边解旋边复制, 半保留复制
PCR扩增
细胞外 不需ATP提供能量 耐高温的TaqDNA聚合酶 无转录,需加入两种引物
体外迅速扩增
30多次
受生物体自身控制
项目 不 同 点 缓冲液 设备
DNA复制
不需要 无
PCR扩增
需要人为控制 严格控制温度变化 的温控设备 四种脱氧核苷酸
【点拨】(1)蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他物质之间的差异主
要表现在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方
面。 (2)电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。
二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
1.原理 泳动速度 不同，泳动速度主要取 不同的物质在同一电场中的__________
带电颗粒的性质 。一般来说，带电颗粒直径______ 越小 ， 决于__________________ 越多 ，在电场中的泳动速度越 越接近于球形，所带净电荷_______ 快。
大小不同来分离蛋白 质
酒精
实验 过程 选取材料→破碎细 胞释放DNA→除杂
变性→复性→延 样品处理→凝胶色谱 伸 操作
→DNA析出与鉴定
分离DNA
PCR技术 获得大量DNA 解决了DNA研究
分离蛋白质
实验
结果 实验 意义
获得较纯净的DNA
相对分子质量不同的
蛋白质得以分离 为蛋白质的研究和利 用提供了原材料
分离 结果 是否需要 缓冲液
将蛋白质沉降分层
将蛋白质分离开来
不需要
需要
【高考警示钟】
提取蛋白质后，只采用一种方法可能无法将蛋白质纯化，可以 采用多种分离与纯化方法结合使用的措施将蛋白质进行分离、
纯化。
【典例训练1】(2010·江苏高考)某种蛋白酶是由129个氨基酸 脱水缩合形成的蛋白质。下列叙述正确的是( )
三、PCR扩增DNA的过程 1.参与的组分及作用
参与的组分
模板DNA 4 种脱氧核苷酸 ______________ Taq聚合酶
在DNA扩增中的作用
提供DNA扩增的模板 ____________________ 合成子链的原料 催化合成DNA子链 ___________________ 使Taq聚合酶能够从引物的3′端开始连接 脱氧核苷酸 提供DNA聚合反应的离子条件 ____________________________
A.该蛋白酶分子结构中至少含有129个氨基和129个羧基 B.该蛋白酶溶液与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应
C.利用透析法纯化该蛋白酶时，应以蒸馏水作为透析液
D.用含该蛋白酶的洗衣粉去除油渍，效果比其他类型加酶洗衣 粉好
【解题指南】 1.考查实质：本题考查蛋白酶的化学本质、组成、结构及鉴定
等。
2.解题关键：(1)缓冲液能保持蛋白质的活性；(2)蛋白酶的本 质是蛋白质，具有专一性，只能水解蛋白质。
2.步骤
细心点样 配制试剂→架滤纸桥→浸泡薄膜→__________→平悬薄膜→ 实施电泳 脱色 __________→染色→漂洗→ ________
【点拨】(1)醋酸纤维薄膜上的缓冲液有利于维持蛋白质的正常 形态和电泳时蛋白质分子的泳动，在吸取薄膜表面的缓冲液时 不宜吸得太干。 (2)点样的整齐与否直接影响电泳结果蛋白质条带的区分。
【解析】选B。该蛋白酶只有一条链时，所含有的氨基和羧基数 目最少，都至少含有一个，Ａ项错误。因其本质为蛋白质，故 可与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，Ｂ项正确。用透析法 纯化蛋白酶时，应用缓冲液做透析液以保持蛋白酶的活性， C项 错误。因酶具有专一性，油渍为脂肪，故利用含蛋白酶的洗衣 粉去油渍比用含脂肪酶的效果差。
引物 ________
Mg2+
2.PCR扩增过程 94 ℃→双链DNA解旋成单链DNA 变性：________________________________ ↓ 40 ℃～ 60 ℃→引物与作为模板的单链DNA特定 退火：_______________________________________________ ↓ 部位相互配对、结合 _________________________ 延伸 ：72 ℃左右→在Taq聚合酶作用下，4种脱氧核苷酸按碱 _____ 基互补配对原则合成新DNA双链
DNA 和蛋白质技术 1.DNA与蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度不同
2 mol/L NaCl溶液 0.14mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生
盐析沉淀
溶解
NaCl溶液从2 mol/L降低过程
中，溶解度逐渐增大
2.比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)
项目 场所 能量 不 同 点 酶 是否有 转录 特点 循环次数 DNA复制
原料 相 同 点
复制原理
严格遵循碱基互补配对原则 DNA为模板 都需要与模板相结合的引物
模板
引物
3.分离DNA、PCR技术、分离蛋白质三者比较
分离DNA DNA在不同浓度 实验 原理 NaCl溶液中溶解度 不同，且不溶于冷 PCR技术 分离蛋白质
利用DNA热变性
原理体外扩增 DNA
依据相对分子质量的
第四章 生物化学与分子生物学
技术实践
一、蛋白质的分离与纯化 1.实验原理 蛋白 依据蛋白质的不同特性，将不同种类蛋白质分开，再依据_____ 质之间以及蛋白质与其他物质之间 的差异进行纯化。 _______________________________
2.步骤
破碎细胞 ——研磨法、超声波法、酶解法 ↓ 释放蛋白质 ↓ 酸性蛋白质(稀碱性溶液) 抽提蛋白质 水溶性蛋白质(透析液) 脂溶性蛋白质(有机溶剂) ↓ 离心去除固体杂质 ↓ 蛋白质粗制品 ↓ 纯化： 可采用透析法、离心沉降法、电泳法 ↓ 纯度鉴定：可采用醋酸纤维薄膜电泳法
为DNA研究打下基 础
中材料不足的问
题
【高考Байду номын сангаас示钟】
【点拨】解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合 酶和DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键。
蛋白质的分离与纯化方法的比较
方法 项目 透析法 离心沉降法 控制离心速率，使分 子大小、密度不同的 蛋白质沉降分层 电泳法 不同带电颗粒在同一 电场中的泳动速度不 同
原理
蛋白质分子不
能透过半透膜 将蛋白质和小 分子化合物分 开 需要
PCR扩增
细胞外 不需ATP提供能量 耐高温的TaqDNA聚合酶 无转录,需加入两种引物
体外迅速扩增
30多次
受生物体自身控制
项目 不 同 点 缓冲液 设备
DNA复制
不需要 无
PCR扩增
需要人为控制 严格控制温度变化 的温控设备 四种脱氧核苷酸
【点拨】(1)蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他物质之间的差异主
要表现在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方
面。 (2)电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。
二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
1.原理 泳动速度 不同，泳动速度主要取 不同的物质在同一电场中的__________
带电颗粒的性质 。一般来说，带电颗粒直径______ 越小 ， 决于__________________ 越多 ，在电场中的泳动速度越 越接近于球形，所带净电荷_______ 快。
大小不同来分离蛋白 质
酒精
实验 过程 选取材料→破碎细 胞释放DNA→除杂
变性→复性→延 样品处理→凝胶色谱 伸 操作
→DNA析出与鉴定
分离DNA
PCR技术 获得大量DNA 解决了DNA研究
分离蛋白质
实验
结果 实验 意义
获得较纯净的DNA
相对分子质量不同的
蛋白质得以分离 为蛋白质的研究和利 用提供了原材料
分离 结果 是否需要 缓冲液
将蛋白质沉降分层
将蛋白质分离开来
不需要
需要
【高考警示钟】
提取蛋白质后，只采用一种方法可能无法将蛋白质纯化，可以 采用多种分离与纯化方法结合使用的措施将蛋白质进行分离、
纯化。
【典例训练1】(2010·江苏高考)某种蛋白酶是由129个氨基酸 脱水缩合形成的蛋白质。下列叙述正确的是( )
三、PCR扩增DNA的过程 1.参与的组分及作用
参与的组分
模板DNA 4 种脱氧核苷酸 ______________ Taq聚合酶
在DNA扩增中的作用
提供DNA扩增的模板 ____________________ 合成子链的原料 催化合成DNA子链 ___________________ 使Taq聚合酶能够从引物的3′端开始连接 脱氧核苷酸 提供DNA聚合反应的离子条件 ____________________________
A.该蛋白酶分子结构中至少含有129个氨基和129个羧基 B.该蛋白酶溶液与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应
C.利用透析法纯化该蛋白酶时，应以蒸馏水作为透析液
D.用含该蛋白酶的洗衣粉去除油渍，效果比其他类型加酶洗衣 粉好
【解题指南】 1.考查实质：本题考查蛋白酶的化学本质、组成、结构及鉴定
等。
2.解题关键：(1)缓冲液能保持蛋白质的活性；(2)蛋白酶的本 质是蛋白质，具有专一性，只能水解蛋白质。
2.步骤
细心点样 配制试剂→架滤纸桥→浸泡薄膜→__________→平悬薄膜→ 实施电泳 脱色 __________→染色→漂洗→ ________
【点拨】(1)醋酸纤维薄膜上的缓冲液有利于维持蛋白质的正常 形态和电泳时蛋白质分子的泳动，在吸取薄膜表面的缓冲液时 不宜吸得太干。 (2)点样的整齐与否直接影响电泳结果蛋白质条带的区分。
【解析】选B。该蛋白酶只有一条链时，所含有的氨基和羧基数 目最少，都至少含有一个，Ａ项错误。因其本质为蛋白质，故 可与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，Ｂ项正确。用透析法 纯化蛋白酶时，应用缓冲液做透析液以保持蛋白酶的活性， C项 错误。因酶具有专一性，油渍为脂肪，故利用含蛋白酶的洗衣 粉去油渍比用含脂肪酶的效果差。
引物 ________
Mg2+
2.PCR扩增过程 94 ℃→双链DNA解旋成单链DNA 变性：________________________________ ↓ 40 ℃～ 60 ℃→引物与作为模板的单链DNA特定 退火：_______________________________________________ ↓ 部位相互配对、结合 _________________________ 延伸 ：72 ℃左右→在Taq聚合酶作用下，4种脱氧核苷酸按碱 _____ 基互补配对原则合成新DNA双链
DNA 和蛋白质技术 1.DNA与蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度不同
2 mol/L NaCl溶液 0.14mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生
盐析沉淀
溶解
NaCl溶液从2 mol/L降低过程
中，溶解度逐渐增大
2.比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)
项目 场所 能量 不 同 点 酶 是否有 转录 特点 循环次数 DNA复制
原料 相 同 点
复制原理
严格遵循碱基互补配对原则 DNA为模板 都需要与模板相结合的引物
模板
引物
3.分离DNA、PCR技术、分离蛋白质三者比较
分离DNA DNA在不同浓度 实验 原理 NaCl溶液中溶解度 不同，且不溶于冷 PCR技术 分离蛋白质
利用DNA热变性
原理体外扩增 DNA
依据相对分子质量的
第四章 生物化学与分子生物学
技术实践
一、蛋白质的分离与纯化 1.实验原理 蛋白 依据蛋白质的不同特性，将不同种类蛋白质分开，再依据_____ 质之间以及蛋白质与其他物质之间 的差异进行纯化。 _______________________________
2.步骤
破碎细胞 ——研磨法、超声波法、酶解法 ↓ 释放蛋白质 ↓ 酸性蛋白质(稀碱性溶液) 抽提蛋白质 水溶性蛋白质(透析液) 脂溶性蛋白质(有机溶剂) ↓ 离心去除固体杂质 ↓ 蛋白质粗制品 ↓ 纯化： 可采用透析法、离心沉降法、电泳法 ↓ 纯度鉴定：可采用醋酸纤维薄膜电泳法
为DNA研究打下基 础
中材料不足的问
题
【高考Байду номын сангаас示钟】
【点拨】解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合 酶和DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键。
蛋白质的分离与纯化方法的比较
方法 项目 透析法 离心沉降法 控制离心速率，使分 子大小、密度不同的 蛋白质沉降分层 电泳法 不同带电颗粒在同一 电场中的泳动速度不 同
原理
蛋白质分子不
能透过半透膜 将蛋白质和小 分子化合物分 开 需要