第三章基因工程的酶学基础_PPT幻灯片
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基因工程ppt
粘粒载体有更大的容量
cosmid：由质粒与噬菌体 COS 末端组成，可克 隆 29-4组序列的克隆 包装后通过感染途径进入细胞 在细胞内可形成环状质粒，并作为质粒复制
缺陷： 外源 DNA 不稳定，易发生重排并丢失 插入片段长度对扩增效率影响极大
RNase H DNA polymerase
目前常用的逆转录酶 RNase H 均缺失 逆转录酶需要引物，一般用 Oligo-dT
五、末端脱氧核苷酸转移酶
Terminal deoxynucleotidyl transferase 催化脱氧核糖核苷酸依次添加到 DNA 3,羟基端 聚合反应没有特异性，无需模板 用途：
常用λ噬菌体有哪些种类？
EMBL 3：置换型载体 克隆片段长度：7－22 kb Spi 筛选，野生型在含 P2 噬菌体的宿主中受限
λgt 10：插入型载体， 克隆片段长度： 0－7.6 kb 片段 CI 筛选，野生型载体易进入溶源生长状态
λgt 11：插入型载体 克隆片段长度： 0－7.2 kb 片段 LacZ基因插入失活
一、什么是质粒载体？
质粒(Plasmid) 细菌染色体外的遗传单位 小分子环状 DNA
具有自身的复制起点 具有抗药性基因 人工构建的多克隆位点
复制子决定了质粒拷贝数
复制起点与调节序列共同组成复制子 严紧型复制子：
复制需 pol III，与细菌基因组复制同步 拷贝数：1－5 质粒/细胞 松弛型复制子： 复制需 pol I，独立复制 拷贝数：10－200 质粒/细胞 Rop 基因突变使质粒达到数千拷贝
一、限制性内切酶是切割 DNA 的工具
Restriction enzyme or restriction endonuclease 细菌产生的酶，能特异性识别 DNA 序列，水解 磷酸二酯键，切开 DNA 双链 它是细菌的一种防御机制
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
《基因工程讲稿》PPT课件
ＣＣＴＴＣＡ
探针
１、核酸分子杂交的基本原理
① 基本原理： 碱基互补原则 ② DNA 的变性与复性
变性 导致 DNA 两条链之间的氢键 断裂，而核酸分子中的所有共 价键不受影响，称为DNA变性。
复性 去除DNA变性因素，两条DNA 链
重新结合成DNA双螺旋结构， 称
２、核酸分子杂交的基本方法
类型
待测核酸片段 探针
基因工程的优越性
1、可在亲缘关系极远的生物之间 进行，能大幅度地改变生物遗 传特性
2、能定向地改变生物遗传特性 3、能快速和稳定地获得新品种
二、基因工程的主要工作
（一）工具酶 （二）载体 （三）主要工作
（一）工具酶
类型
限制酶 修饰酶
1、限制酶
（restriction enzyme）
全称： 限制性内切核酸酶 功能： 识别双链 DNA 内部特异部位
杂交
X底片
Southern 杂交法
（二）核酸的体外扩增
（polymerase chain reaction , PCR）
聚合酶链反应技术
1、目的 在体外快速精确扩增基因组 DNA 2、原理 碱基互补原则， DNA复制 3、优点 ：
① 反应体系相对简单 ② 准确性高 ③ 时间短
4、基本过程
通过改变温度引起的重复进行 DNA 复制 的过程 ① 变性： 95ºC 左右 ② 退火： 引物 Tm 值 ③ 延伸： 70ºC 左右
裂解磷酸二酯键 来源： 原核生物细胞中分离
限制酶特点：
① 具有识别专一性和特异性（4—6个 bp ） 如：EcoRⅠ 5´-- G A A T T C -- 3´
BamHⅠ 5´-- G G A T C C -- 3´ HindⅢ 5´-- A A G C T T -- 3´ ② 具有特定的酶切位点 ③ 切交割错方切式割
第三章基因工程的工具酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶作用的特点： （1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA； （2）接受模板指导； （3）需要有引物（3’羟基）的存在； （4）不能起始合成新的DNA链； （5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端； （6）催化DNA的合成方向是5’—3’。
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRⅠ 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G …
33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
5’
Klenow
P-A-A-T-T-C-G-A-G … OH-G-C-T-C …
dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子， 通常是Mg2+ 。
缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的 pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内 。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下 ，其功能最佳。
巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有 用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的 稳定性。
基因工程的酶学基础课件
第六章 基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
30
六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
32
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
35
6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
45
6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
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六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
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2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
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6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
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6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
3第三章基因工程的工具酶
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修 复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷 酸二酯键。
三、核酸酶
作用：降解磷酸二酯键 分为：外切酶 内切酶
（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana)
单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
ห้องสมุดไป่ตู้
（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可 以降解单链也可以降解双链，没有特异 性，产生单核苷酸或短链
（五）RNase H： 切割DNA—RNA杂交双链中的RNA
序列，使杂交双链变成单链DNA结构
（一）
四、聚合酶
（二） Klenow酶
该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性 及3‘-5’外切活性。
建立酶切图谱需要的酶类 确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目 进行双酶切 比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱 含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间 的酶切或者在4℃条件下进行）
六、 限制性内切酶的star活性
在pH不合适，或甘油浓度过高≥10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因 此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+SAM
Mg2+
ATP Mg2+SAM
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
GAGCC
AACN6GTGC
CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
三、核酸酶
作用：降解磷酸二酯键 分为：外切酶 内切酶
（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana)
单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
ห้องสมุดไป่ตู้
（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可 以降解单链也可以降解双链，没有特异 性，产生单核苷酸或短链
（五）RNase H： 切割DNA—RNA杂交双链中的RNA
序列，使杂交双链变成单链DNA结构
（一）
四、聚合酶
（二） Klenow酶
该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性 及3‘-5’外切活性。
建立酶切图谱需要的酶类 确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目 进行双酶切 比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱 含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间 的酶切或者在4℃条件下进行）
六、 限制性内切酶的star活性
在pH不合适，或甘油浓度过高≥10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因 此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+SAM
Mg2+
ATP Mg2+SAM
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
GAGCC
AACN6GTGC
CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处