分子生物学第9章解析

第九章聚合酶链反应第一节PCR基本原理适温延伸•高温变性：94°C左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板；•低温复性：55~60°C,—对特异性引物分另U与模板3'端互补结合;•适温延伸: 72°C,延伸反应;•每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后, 理论上DNA分子可扩增为2"。

聚合酶链反应的原理高轟性低論火适蟲申彳曰(°C)95-72 -50DNA变性形成2条程链\ /字链延伸\ ______ / DNA加倍DNA单链与引物复性_________ ＞重复1 3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋1 2 3 4 5时间(min)惑吞葩傩氏血wanted gener =4 copies些===========Exponential amplification► J5tlicycle36 .. .2 billinn copies第二节PCR特点■特异性强■灵敏度高皮克(pg=io-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU,细菌为3个细菌•简便.快速一次性加好反应液，1~4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析•对标本的纯度要求低血液.体腔液.洗嗽液.毛发.细胞.活组织等组织的粗提DNA第三节PCR体系组成和反应条件优化一、体系组成・DNA聚合酶•引物（Primer）・dNTP （原料）•目的DNA模板•缓冲液（Buffer ）（一）DNA聚合酶表9-1 PCR常用DNA聚合酶DNA聚合酶来源校对活性加接3'dAMP Taq DNA聚合酶Thermus aquaticus■+Tth DNA聚合酶Thermus thermophilus-+KOD DNA聚合酶■Thermococcus kodakaraensis+—Tli/Vent DNA 聚合酶Thermococcus litoralis+-Pfu DNA聚合酶Pyrococcus furiosus+—Pwo DNA聚合酶Pyrococcus woesii+—AmpliTaq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶修饰-+ KlenTaq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶修饰—+（二）引物引物设计原则:1•引物长度15-30nt2 •引物组成G/C含量以40%-60%为宜3•引物结构•碱基随机分布.二级结构.引物二聚体，于端不应有三个连续的G/C，5,端可以修饰4•引物特异性与其他序列的同源性一般＜70%5•引物浓度非特异性扩增，引物二聚体6•引物质量纯化启动子序列 定点突变 探针标记引物设计3y55限制性内切酶的识别序列!1!引物设计常用软件主要有: •Primer Premier 5.0•Oligo 6•primer 3•The Primer Generator •Net Primer（三）dNTP• 1 •应当根据目的DNA的长度和组成确定dNTP的浓度2-四种dNTP要等摩尔浓度配• 3-dNTP的履量也与扩增效率有密切关系㈣模板• DNA或RNA （先逆转录合成cDNA）•来源:根据科学研究或临床检验的需要,可以是临床标本（血液.尿液.羊水、分泌物等）.药物标本（动植物细胞.组织等八法医标本（犯罪现场的血渍.精斑.毛发等八病原体标本（病毒.细菌.真菌.支原体.衣原体.立克次体等八考古标本（骨骸.毛发等）•无论何种来源的标本，都应该进行预鱼理（五）缓冲溶液•维持DNA 聚合酶的活性和稳定性 苍D H=7・250mmol/L 型可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶• 25mmol/L _0也［虑2，SO4对金属离子有一定的结合力。

3.小牛血清白蛋白或明胶可以维持酶活性,能保证PCR 的稳定性 4＞甲酰胺或二甲基亚枫有利于松解发夹结构等二级结构,促进引物退火吐L 影响酶活性及变性解链.引物退火.扩增效率.扩增特异性等I 、 5、:、条件优化（一）反应温度和反应时间• 2•迟火温度和时间 退火温度应当低于引物Tm 值3-5 °C ，通常为50- 65 °C , 20-40秒钟 TaqDNA 聚合酶的最适温度为75-80 °C , 72 °C,lmin（二）循环次数•循环次数决定PCR 扩增效率 • 一般控制在30-40次•酶活性下降.dNTP 浓度下降等，会使反应进入平台期• 1 •变性温度和时间95°C30秒或97 °C15秒■ 3 •延伸温度和时间:、产物分析（一）电泳分析（二）酶切分析•既能对PCR产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型（三）杂交分析•检测PCR产物特异性，是否存在变异（四）序列分析•检测PCR产物特异性最可靠的方法第四节常用PCR技术・、逆转录PCR (RT-PCR)・二±法:逆转录和PCR在同一个反应体系中进行两步法:逆转录和PCR在两个反应体系中分开进行・引物很关键。

①oligo(dT)引物②特异性引③随机引物•逆转录PCR可以与DNA印迹法联合，分析扩增产物，从而分析样品中的RNA含量，研究基因表达•逆转录PCR灵敏度较低，属于半定量分析二、实时定量PCR (Q-PCR)•对荧光信号的实时检测来跟踪PCR进程，标准曲线定量分析起始模板水平1•实时定量PCR探针•特异性荧光探针:荧光报告/淬灭基团• EB或SG作为荧光探针2•实时定量PCR应用・与逆转录联合可以定量分析mRNA以研究基因表达・基础研究与临床诊断3•实时定量PCR特点• PCR高效性.核酸分子杂交特异性.荧来技术高灵敏度和可计量性.TaqDNA聚合酶的外切酶活性•封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应5min inn iiii mu mi i ii in UH i ii in ii iiiiiiiiiTn- 33,端的荧光Q分子吸收亍端荧光R分子的荧光信号5 nil HI i in II II iii i II IIII ii ii i in IIII mull ion i! in mi 3探针亍端连接的荧光R分子被TaqW切割下来■・llll II5’3”荧光R分子发岀荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例图5J1 T aqMan技术原理示意图不掺入双链中的S YBR染料分子不会发出任何荧光信号SYBR荧光染料特异性地掺入DN A双链,发岀荧光信号图5-10 SYBR-Green I荧光染料原理示意图定量原理确定初始模板的浓度•初始DNA量越多，荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）・Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算岀样品中所含白如*莫板量controlContro e-susu-auuapsa」noizCycle NumberLog Concentration图9 -3引物2 5f --------- 3f 3f ------------------------------------------ ②I延仲35*了5f51了51JI*35f5f5f5’31图9 -3实时定量PCR荧光定量实时PCR与普通PCR的比较•灵敏度高灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高•特异性高使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性•定量准确全程监控，准确的算法进行定量•无需跑胶，自动化程度高荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。

_____二修饰引物PCR・对特定DNA序列进行定向克隆、定点诱变、体外转录等研究时，需要其末端带有限制位点、突变序列、启动子等DNA元件，为业可以在PCR引物的5,端加接这些元件进行扩增，这就是修饰引物PCR・例如:在引物5,端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体DNA重组,这就是克隆PCR・克隆PCR克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的限制位点，可以进行定向克隆5f GGGGAA FTC：9 一4克隆PCR四、等位基因特异性PCR•等位基因特异性PCR (AS-PCR)用于检测点突变•原理：同时设计一个正常引物对和一个突变引物对■下游引物完全一样，上游引物歹末端的碱基不同•两个PCR体系,各加入一个引物对•等位基因特异性PCR用于鉴定单核昔酸多态性(SNP)C 3・A 3’------------------- T --------------------------------- ---------------------------------- T ---------------------------------图9 -5 等位基因特异性PCR厭变基因AS-PCR黠分析正常引物对突变引物对①严格祀对扩W ②銷配不扩増五、PCR-RFLP■聚合酶错反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR- 睡）是PCR技术与RF分析的联合，即先用PCR将包含待测多态性位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶切割，电泳分析其RFLP,判断是否存在突变・PCR-RFLP可以极大地提高RFLP分析的灵敏度和特异性,是检测突变的较为简便的方法六、PCR-单链构象多态性(SSCP) 七、随机扩增多态性DNA ( RAPD)八、扩增片段长度多态性(AFLP)九、长距离PCR (LD-PCR)思考题•1、PCR基本原理•2、PCR反应体系及反应条件的优化。