ELISA组织样本处理方法
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。
一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。
样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。
1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。
1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。
二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。
2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。
2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。
三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。
3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。
3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。
四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。
4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。
4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。
五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。
5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。
5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。
总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。
ELISA检测样品的处理方法
ELISA检测样品的处理方法Author:Elabscience views:502通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。
正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。
1、血清血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。
用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。
（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。
）4℃1000×g离心20分钟，仔细收集上清。
建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。
同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。
2、血浆用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃1000×g离心15min，取上清即血浆。
将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
避免使用溶血或高血脂的标本。
常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。
3、细胞培养上清取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
4、细胞裂解液1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。
悬浮细胞可省略。
2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。
3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。
ELISA操作流程
ELISA操作流程前处理1. 匀浆样本:取一定量（约100-150g）旳样本进行匀浆, 匀浆样本以无颗粒状为为佳。
样本匀浆好后来再运用称样勺搅拌样本, 以充足混合不一样个体旳样本, 到达均质旳效果。
2. 称量样本:运用0.01g当量旳电子天平称量对应旳样本重量, 误差尽量控制在±0.02g,以提高成果旳精确度。
样本直接称取到50ml离心管中。
称量旳样本应尽量称取匀浆效果比很好旳样品。
3. 加入提取液:在对应旳样本中加入对应旳提取溶剂, 溶剂旳体积在条件容许范围内尽量精确。
4. 提取或萃取:加入对应旳提取溶剂后来, 拧紧离心管盖, 运用涡旋仪充足振荡样品, 以样本与提取液充足混合为准。
详细时间可参照阐明书所提供旳措施时间规定。
5. 离心:把处理好旳样品对称放置在离心机中, 盖上离心机盖门, 直到听到离心机盖门关闭声音, 按“离心”键进行离心, 离心时间一般设为5min, 离心速度一般设为4500rpm/min。
假如样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6. 移取液体:运用加样枪移取对应旳旳溶剂液体至另一种容器中；假如需要吹干浓缩旳样品, 则移取到洁净干燥旳玻璃管中；假如是取下层进行分析旳样品则移取所有上层液体, 运用下层进行分析。
移取液体旳时候请注意防止移取到不有关旳液体层, 以免导致污染。
7. 浓缩吹干:先运用甲醇把氮吹仪旳针头进行润洗, 详细措施是先打开空气压缩机旳开头, 先通以少许气流, 把装有甲醇旳容量浸泡针头前端, 浸泡时间约1-2s即可。
润洗针头后, 把装有样品旳玻璃管放在下面水浴锅旳相对应旳固定夹子上, 再打开气流阀门, 以能感觉到气流声音为准, 再缓慢把针头伸到液面上方, 以吹动液面为限, 在浓缩吹干过程中应不停调整针头旳高度, 以节省吹干时间。
吹干旳样品以没有液体流动旳鉴定根据, 亦可在吹干后再吹大概2-3min左右。
严禁在没有吹干旳状况下就取下样品进行下一步操作。
ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解
ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解：
1.细胞上清：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。
如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
2.脑脊液：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。
如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
3.血清血浆：加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
①血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；
②血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
③血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
④标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
⑤请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
4.组织匀浆液的样本：要制备过程中需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，造成检测结果的值偏低。
因组织匀浆液的样本蛋白种类多，含量丰富，实验参照血清血浆标本的处理方法进行，否则就会影响实验结果。
具体是加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，需稀释时，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
各种组织匀浆样本用于ELISA检测的处理方法
各种组织匀浆样本用于ELISA检测的处理方法大鼠肺组织匀浆制备过程：1.WB法：在组织匀浆器中加入大鼠肺和5体积的匀浆缓冲液进行匀浆，4摄氏度下3000转离心20分钟后，收集上清。
用Coomassie Plus Protein Assay 测定总蛋白浓度. 用等量的样本buffer与20微克样本混合(100 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0.02%溴酚蓝,和10%甘油煮几分钟之后电泳.EILSA：肺用5体积的buffer进行匀浆，缓冲液由10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.5 M 蔗糖, 1 mM EGTA, 1 mM DTT构成。
匀浆组织在750 xg 下离心10 分钟分理出细胞核. 含有细胞质部分的上清液储存在–70摄氏度冰箱用于MIP-2蛋白质测定.2.BAL液收集后, 收集左肺做TNF-alpha, MIP-2, 和移行蛋白表达评估. 肺用1mL细胞裂解液在匀浆器中进行匀浆。
得到的组织匀浆在10000Xg下离心10分钟. 上清液储存在–80 摄氏度留用于后面的检测。
3.冻存的的组织样本称重加入匀浆缓冲液（4摄氏度，每100毫克组织中加入1毫升缓冲液），样本进行匀浆和一次冻融,超声10分钟后在4摄氏度孵化一个小时。
最终得到的组织匀浆在120,000 x g下离心. 组织上清液用于细胞因子测定，这些数据用每毫克组织表达。
4. 取三分之一冻存的来源于？在4摄氏度细胞裂解液中孵化1小时的肺进行匀浆，组织匀浆之后超声并在4摄氏度12,000 转下离心10 分钟 . ELISA 检测TNF-alpha, MIP-2, and IL-6 的组织匀浆的内容。
组织匀浆总蛋白采取Bradford法.大鼠脾和肺组织匀浆制备过程：TNF-alpha检测脾和肺组织匀浆过程：冰冻组织样本称重后匀浆（每100毫克组织1毫升缓冲液）。
匀浆后的组织进行一轮冻融后，超声10分钟在4摄氏度下孵化一小时。
ELISA实验标本的采集、处理和保存
ELISA实验标本的采集、处理和保存发布时间:2009-10-19ELISA实验标本的采集、处理和保存能够应用ELISA 实验的样本种类很多，有血清，血浆，细胞上清，细胞裂解液，尿液，关节滑液，脑脊液，肺泡灌洗液，各种组织的组织匀浆；采集和处理的方式都不相同。
下面就列出了biotnt 收集的给类样本的采集、处理和保存方式。
方法大多出自文献和试剂盒说明书，部分方法经Biotnt 验证过，但有的方法并没有实际操作过，所以，以下方法仅供参考。
一、ELISA实验中血清的采集、处理和保存；1、真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；2、采血后室温静置1小时；3、将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心10min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。
4、取上清。
分装冻存备用，2-8℃下，可放置保存24-48小时；-20℃下，可放置保存1个月；-70℃下，可放置保存6个月；5、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的 ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
血清标本宜在新鲜时检测。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
二、ELISA实验中血浆的采集、处理和保存；1、真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；2、按1:9加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；3、将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心5min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。
4、取上清。
分装冻存备用，2-8℃下，可放置保存24-48小时；-20℃下，可放置保存1个月；-70℃下，可放置保存6个月；5、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。
ELISA检测样品处理方法
ELISA检测样品的处理方法Author:Elabscienceviews:2387通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。
正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。
1、血清血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。
用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。
（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。
）4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。
建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。
同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。
2、血浆用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃ 1000×g离心15min，取上清即血浆。
将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
避免使用溶血或高血脂的标本。
常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。
3、细胞培养上清取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
4、细胞裂解液1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。
悬浮细胞可省略。
2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。
3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。
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ELISA组织样本的处理
1、采集组织：在冰冷的生理盐水中漂洗组织，除去血液，滤纸拭干，称重（100mg左右为
宜），剔除附属的结缔组织，称取组织块。
2、用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理盐水，组织：匀浆介质=1:10（或所用生理
盐水的体积总量为组织块重量的9倍），尽量保证样本间所取组织重量和加入匀浆介质（PBS或生理盐水）的比例一样。
然后用眼科小剪尽快剪碎组织块（操作要在冰水浴中进行）。
3、组织匀浆：
a) 玻璃匀浆器：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水
冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手上下抽动或转动研磨杆数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
b) 组织匀浆/破碎机：用组织破碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，
也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在
冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
4、将制备好的10％匀浆用离心机4℃，5000g离心5～10min，收集各匀浆样本上清。
5、BCA法测定各组织匀浆样本总蛋白量，便于后续统计分析数据。
6、将收集的上清分装成适量小份，按需保存备用：
4℃下，可保存不超过72小时；
-20℃下，可保存不超过1个月；
-80℃下，可保存不超过2～6个月；
7、根据实验需要，取适量上清液进行各种ELISA测定。
注意事项：
1、离心后的样本应清澈透明，无沉淀；
2、冻存的匀浆样本应避免反复冻融；
2、对于冷冻保存的样本，使用前在冰上融化，避免加热融化。