实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

3．浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶， 按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子， 上，立即插入梳子，将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4．样品预处理： 样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1 分钟。 混合，100℃加热1～2分钟。 5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 待浓缩胶聚合完全后， 梳子， 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上，上下槽各加入电极缓冲液。 6．加样： 加样： 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下， 将胶板垂直放于室温下，待分离胶 聚合完全后， 聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1．安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边，防止 要用琼脂进行封边， 凝胶泄露， 凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时，要将螺丝拧紧， 安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。
2．根据所测蛋白质的相
对分子量范围，选择某一 对分子量范围， 合适的分离胶浓度。 合适的分离胶浓度。按下 表所列的试剂用量配。 表所列的试剂用量配。
【试剂】 试剂】 1．标准蛋白质： 标准蛋白质： 2．30%丙烯酰胺溶液： 30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺溶液： 丙烯酰胺29.2g， 丙烯酰胺29.2g， 甲叉双丙烯酰胺0.8g， 甲叉双丙烯酰胺0.8g， 加水至100ml，棕色瓶4 保存。 加水至100ml，棕色瓶4℃保存。
3．1.5mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液 Tris-Hcl分离胶缓冲液 pH8.8（4x）： pH8.8（4x）： Tris， 1MHCl调 取18.15g Tris， 用1MHCl调pH 8.8，加水至100ml， 至 8.8，加水至100ml，4℃保存 4．0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲 Tris-HCl浓缩胶缓冲 pH6.8（4x）： 液，pH6.8（4x）： Tris， HCl调至 调至pH 取5.98g Tris，用1N HCl调至pH 6.8，加水至100ml， 6.8，加水至100ml，4℃保存。 保存。
蛋白质分子一经结合了一定量的 SDS阴离子 SDS阴离子，所带负电荷的量远远超 阴离子， 过了它原有电荷量， 过了它原有电荷量，从而消除了不同 电荷符号的差异。 种类蛋白质间电荷符号的差异 种类蛋白质间电荷符号的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结合 SDS越多 所带负电荷也越多， 越多， 的SDS越多，所带负电荷也越多，这 就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度 就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度 趋于一致。 趋于一致。
9．脱色： 脱色： 移出凝胶放入脱色液中 脱色至本底无色为止。 脱色至本底无色为止。
10、 10、观察电泳结果 根据标准样品， 根据标准样品， 大致推测蛋白质的分子 量

8．染色液（0.25%考马斯亮蓝 染色液（0.25%考马斯亮蓝 R-250、50%甲醇、7%乙酸）： 250、50%甲醇 7%乙酸 甲醇、 乙酸）： 考马斯亮蓝R 2.5g、 考马斯亮蓝R-250 2.5g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 甲醇（可用无水乙醇代替） 500ml、70ml冰乙酸 500ml、70ml冰乙酸， 冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000ml。 溶解后补足水至总体积1000ml。 9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）： 脱色液（30%甲醇 7%乙酸 甲醇、 乙酸）： 甲醇（可用无水乙醇代替） 甲醇（可用无水乙醇代替） 300ml，冰乙酸70ml， 300ml，冰乙酸70ml， 补足水至1000ml。 补足水至1000ml。
7．电泳： 电泳： 30mA的电流压下电泳 的电流压下电泳， 在30mA的电流压下电泳，当样品 全部进入分离胶时，加大电流至60mA， 全部进入分离胶时，加大电流至60mA， 当溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。 当溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。
8．染色： 染色：
从电泳装置上卸下玻板， 从电泳装置上卸下玻板， 小心橇开玻板取出凝胶， 小心橇开玻板取出凝胶，放 入染色液中60 60度水染色 入染色液中60度水染色 30min。 30min。
同时，不同蛋白质的SDS复合 同时，不同蛋白质的SDS复合 物形状也相似，均是长椭圆状 长椭圆状。 物形状也相似，均是长椭圆状。 因此，在电泳过程中， 因此，在电泳过程中，迁移 率仅取决于蛋白质-SDS复合物的 率仅取决于蛋白质-SDS复合物的 大小， 大小，也可以说是取决于蛋白质 分子量的大小， 分子量的大小，而与蛋白质原来 所带电荷量无关。 所带电荷量无关。
5．电极缓冲液（pH8.3）： 电极缓冲液（pH8.3）： 14.49g甘氨酸 甘氨酸， Tris， 取 14.49g甘氨酸，3.02g Tris，加 100ml 10%SDS，加水至1 升，4℃ 10%SDS，加水至1 保存。 保存。 6．10% SDS： SDS： SDS，加水至100ml， 取10g SDS，加水至100ml， 完全溶解后室温保存。 完全溶解后室温保存。 7．10%过硫酸铵溶液（AP）： 10%过硫酸铵溶液 AP）： 过硫酸铵溶液（ 临用前现配。 临用前现配。
当电泳体系中含有一定浓度的十 二烷基硫酸钠（SDS） 二烷基硫酸钠（SDS）时，则得 电泳迁移率的大小只取决于蛋白 质的分子量， 质的分子量，从而可推测蛋白质 的分子量。
SDS的作用原理 SDS的作用原理 SDS是一种阴离子去污剂，能 是一种阴离子去污剂，
够与蛋白质结合，破坏蛋白质分 够与蛋白质结合， 之间以及与其它物质分子之间的 非共价键, 非共价键,使蛋白质变性而改变 原有的空间构象。
当SDS的总量为蛋白量的3～10 SDS的总量为蛋白量的 的总量为蛋白量的3 倍且SDS单位浓度大于 单位浓度大于1mol./L 倍且SDS单位浓度大于1mol./L 这两者的结合是定量的， 时，这两者的结合是定量的，大 约每克蛋白质可结合1.4克SDS。 约每克蛋白质可结合1.4克SDS。
【器材] 器材] 电泳仪、 电泳仪、 垂直板电泳槽、 垂直板电泳槽、 进样器、 进样器、 乳头吸管、 乳头吸管、 50ml小烧杯 50ml小烧杯
实验一 SDS－PAGE SDS－ 测定蛋白质的相对分子量
【基本原理】 基本原理】
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分 辨率，用它分离、检测蛋白质混合样 辨率，用它分离、 品，主要是根据各蛋白质各组分的电 泳迁移率的不同。 泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同， 这种迁移率的不同，就蛋白质分子 本身而言， 本身而言，主要与其所带净电荷以及 分子量和形状有关。 分子量和形状有关。
10．样品缓冲液（2x）： 10．样品缓冲液（2x）： H2O 2.4ml，浓缩胶缓冲液 2.4ml， 1.0ml、甘油0.8ml、 1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS 3.2ml， 硫基乙醇0.4ml， 3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025% （W/V）溴酚兰0.2ml。 W/V）溴酚兰0.2ml。 11．TEMED（四甲基乙二胺） 11．TEMED（四甲基乙二胺）
灌胶时要注意： 灌胶时要注意：
催化剂不能加多了，加完催化剂要 催化剂不能加多了， 充分混匀，且立即灌胶， 充分混匀，且立即灌胶， 灌胶时要保持小烧杯摇动， 灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧 杯内的胶聚合。 杯内的胶聚合。 灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后， 灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后， 立即沿胶板的一角灌入， 立即沿胶板的一角灌入，而且要防 止气泡的产生。 止气泡的产生。