2E8细胞增殖法测定白介素-7生物学活性的建立与应用
人白介素-7重组蛋白的原核表达、纯化及活性测定
人白介素-7重组蛋白的原核表达、纯化及活性测定汤建才;龙凤;李丹;王永生【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2015(000)023【摘要】Objective:To acquire recombinant human interleukin 7 prokaryotic expressing plasmid,fusion protein is expressed,purified and identified. Methods:The hIL - 7 gene was inserted into the prokaryotic expressing vector pET - 32a( + )to acquire pET32 - hIL - 7 and transformed into BL21(DE3)cells. IPTG induced the expression of fusion protein Trx - IL - 7. The induced product was washed,dissolved and purified by affinity chromatogarphy under renaturing condition. IL - 7 was identified by Western blot,and the biologic activity was detected by proliferation of IL - 7 dependence cell 2E8. Results:The recombinant plasmid pET32 / rhlL - 7 has been constructed correctly. The recombinant hlL - 7 was gained after gradient dialysis,enzyme digestion and purified,which has the right immunology specificity and biologic activity. Conclusion:The recombinant human interleukin - 7 with biologic activity has been acquired,which lay the foundation for the further study of function of IL - 7.%目的：构建重组质粒 pET32a - hIL -7，诱导表达，纯化并鉴定目的蛋白。
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。
方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。
结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。
结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。
本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。
[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法1.细胞计数法细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一、该方法通过显微镜观察细胞密度和数量来判断细胞的增殖情况。
首先，将培养皿中的细胞样本取出，使用显微镜观察细胞的形态和数量，然后用显微镜同时观察已知数量的细胞，计算出单位面积或体积中的细胞数量，最后通过比较细胞数量的变化来评估细胞的增殖情况。
2.三(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐(MTT)法MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
MTT是一种黄色噻唑盐，可以通过还原作用转化为紫色的甲氧基-4-硝基苯胺（formazan），这个转化过程是仅在活细胞中发生的。
首先，将MTT溶液加入细胞培养皿中，细胞内的活细胞色素（还原酶）可以将MTT转化为紫色的formazan。
然后，用溶剂将formazan溶解，测量溶液的吸光度，就可以通过测量吸光度的变化来评估细胞的活力。
3.荧光素酶体积法（ATP法）ATP法是一种用于检测细胞的能量代谢水平的方法。
ATP是细胞内的能量分子，在细胞进行代谢活动时会不断产生。
将细胞样品加入含有高能底物的反应溶液中，ATP酶将底物中的ATP转化为体积比较大的荧光素酶（luciferin）。
接下来，荧光素酶与荧光素生成一个反应产生的发光，发光强度与ATP浓度成正比。
通过测量发光强度来评估细胞的活力。
4.分子探针染色法分子探针是一种与特定分子结合的荧光标记物质，可以通过显微镜观察细胞中特定分子的分布和浓度。
常用的分子探针有细胞核染色剂（如DAPI），线粒体染色剂（如JC-1），胞质钙染色剂（如Fluo-3）等。
将细胞与特定分子探针共同孵育，根据分子探针的荧光强度和分布情况，可以评估细胞内特定分子的含量和活动水平，从而间接评估细胞的增殖和活力。
5.流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞的物理和化学性质，通过细胞悬浮液在液体流动中的传递和分析的技术。
通过染色、抗体标记、荧光探针等方法，可以区分和分析细胞的不同类型和状态。
白介素7_人白介素7_Human IL-7使用说明书
GMP级重组人白介素7（冻干粉）
Recombinant Human IL-7（interleukin-7）
作用机理：
IL-7 是一种对 T、B、NK 细胞的生长、存活及分化重要的细胞因子。
IL-7 和肝细胞生长因子（HGF）形成的异二聚体是前祖 B 细胞生长刺激因子。
在小鼠基因敲除的研究表明，IL-7 在淋巴细胞的生存起着至关重要的作用。
IL-7 刺激多能干细胞向淋巴系祖细胞分化。
规格参数：
货号：TL-506 规格：10ug/50ug
产品信息：
表达宿主：CHO细胞
生物活性：2×105 IU/mg
纯度：>98%
内毒素：<2EU/mg
纯化方式：层析纯化
性状：白色疏松体
保存温度：2-8℃
有效期：24 个月
生产厂家：同立海源生物
使用说明：
稀释后置于-20℃保存期 6 个月，-80℃保存期 12 个月。
适用范围：
T 细胞，B 细胞，NK 细胞的激活扩增
相关产品推荐：
Human IL-2、Human IL-15、Human IL-12、Human IL-6、Human IL-18、Human IL-21、Human IFN-γ、Human GM-CSF、Human EGF、NK细胞培养试剂盒。
生物技术制药考试卷
一、名词解释（每个2.5分，共10分）1、生物药物：是利用生物体生物组织及其成分综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和现代药学的原理与方法进行加工，制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品。
2、细胞因子：是由免疫细胞分泌的、在体内含量极低、具有多种生物学活性的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白的统称。
3、最大作用强度：指药物达到最大反应的能力。
即药物效应达到的最大高度，此时，剂量再增大效应也不再增加。
药物出现最大疗效，而不出现中毒的剂量称极量，出现中毒的最小剂量称最小中毒量。
4、生物学效价测定：以动物体内试验或体外细胞培养法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。
二、填空（每个1分，共15分）1、常见的药物有三大类，生物药物进一步可分成4大类即（基因工程药物）、（基因药物）、（天然生化药物）、合成或半合成的生物药物2、药物的基本作用包括：（兴奋作用）、（抑制作用）；药物作用的两重性包括：（药效作用）、（不良作用).3、制药车间设备包括（生产专门设施区）、（质量控制区）和贮存区。
4、成品质量标准分为（外控质量标准）和（内控质量标准）。
5、药物非临床研究质量管理规范简称（GLP）和药物临床试验质量管理规范简称（GCP）6、创新药物有（原始创新）药物和（模仿创新）药物三、选择（每个2分，共20分）1、生物技术药物主要讨论的内容不包括：（D）A．生物技术药物的临床前研究与临床评价B．生物技术药物的生产工艺与生产管理C．生物技术药物的质量控制与安全性评价D．各类生物技术药物的来源，结构、性质、作用、用途和运输方式、贮存。
2、以下哪种在国内不属于新药（C）A、未曾在中国境内上市销售的药品B、已上市的药品改变剂型C、增加药物不良反应D、改变给药途径，3、国家食品药品监督管理局对下列哪项申请不可以实行特殊审批（C）A、未在国内上市销售的从植物中提取的有效成份及其制剂B、未在国内外获准上市的化学原料药及其制剂、生物制品；C、治疗艾滋病、恶性肿瘤、罕见病等疾病且尚无临床治疗优势的药物；D、治疗尚无有效治疗手段的疾病的新药4、下列哪项是新药研究的起始和基础（B）A、已有的化学药物B、先导化合物C、超分子化合物D、新化学实体5、下列哪项不属于新药开发的途径（D）A、药物筛选B、合理药物设计C、组合化学与药物设计D、药物分子合成6、治疗用生物制品注册分类不包括哪个（D）A、基因治疗、体细胞治疗及其制品B、含未经批准菌种制备的微生态制品C、由已上市销售生物制品组成新的复方制品D、采用转基因技术制备的制品7、下列不是跨膜信号转导有四种机制的是(C)A．脂溶性药物通过细胞膜，作用于胞内受体B．配体与跨膜受体结合，使胞内酶产生变构活性调节C．通过抗原-抗体进行信号转导D．通过G-蛋白偶联的受体进行信号转导8、下列不是机体对药物作用的影响的是：（B）A.药动学性质对药物达到受体部位浓度的影响B.配体浓度的不同对药物作用的影响C.受体数目与功能改变对药物作用的影响D.受体远侧反应成分的改变对药物作用的影响9、洁净区的环境监测不包括（D）A.空气悬浮粒子标准监测B.微生物限度监测C人员监测 D．湿度监测10、I型干扰素（酸稳定型干扰素）不包括：（C）A.α－干扰素B.β－干扰素C.干扰素-rD.干扰素ω四、判断（每个2分，共20分）1、纯化过程的质量控制真核细胞表达的制品反复多次使用，要求纯度达98%以上。
MTT比色法-细胞增殖及细胞活性测定-实验
MTT比色法*本实验要严格无菌操作，遵守细胞间操作流程。
操作流程及步骤：1、配制MTT溶液[1-7]。
以96孔板实验操作计算用量96孔板：高糖：60孔*180=10800ulMTT：60孔*20ul=1200ul2、先将原有培养液弃去，用PBS洗洗两次[8-9]。
3、将配制好的MTT溶液每孔200ul加入96孔板中，孵箱孵育3-4小时。
4、弃MTT液，MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走[10]。
5、每孔加入150ulDMSO，摇床10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
6、测OD值，酶标液设置波长范围：490nm-----492nm 510nm-----562nm[11]。
7、终点法----波长492----选择样本范围----读取----原始数据----输出----保存。
心得体会及注意事项：1、配制MTT溶液要避光。
2、MTT浓度网上查得5mg/ml。
3、经过0.22um微孔滤膜滤过。
4、血清和双抗会影响MTT染色效果，故培养液用不含血清和双抗的高糖。
5、计算配制溶液剂量，有时枪不准或损失较多，每板多加1ml高糖。
6、96孔板最外层不用所以总计孔数为60孔。
7、高糖180ul+MTT20ul(每孔)）。
8、操作过程要防止吹落细胞，加液延碧缓慢加入。
9、PBS液要高压灭菌过的。
10、有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
11、96孔板底部要洁净，否则OD值不准。
目的及原理MTT实验目的：细胞增殖及细胞活性测定。
MTT实验原理：为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
白细胞介素
白细胞介素的分类
IL-11：il-11由骨髓基质细胞产生，分子量约为23kd，是造 血微环境中一个多功能的调节因子。 IL-12：il-12主要由b细胞和巨噬细胞产生；其分子是一种 异型二聚体，40kd（p40）和35kd(p35)的2个亚基通过二 硫键相连接。 IL-13:细胞来源：il-13由th2细胞产生，分子量约10kd；其 基因位于第5号染色体上，与il-4基因紧密连接。il-13分子 的氨基酸顺序与il-4有20％～25％的同源性，在功能上也 与il-4有许多相似之处。
1.PCR扩增
PCR (Polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应：在DNA聚合酶催化下，对 特定的DNA序列进行的复制反应 本质：生物体DNA复制原理在体外合成DNA 发明者：Mullis，生物技术革命的象征， 1993年获得诺贝尔奖
2.酶切反应
概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断 裂敏感的蛋白质，高温会降解破坏
策略：生产期可采用先高温，后低温，变温表达，避 免蛋白质降解
例如： 大肠杆菌和酵母生长最低温度为10℃
大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃ 酿酒酵母：生长最适温度为30℃，最高温度为40℃
白细胞介素2的应用列举
1.肿瘤 2.AIDS（艾 滋病） 3.抗病毒， 细菌感染 4，自身免疫 系统疾病
酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液， 限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。
3.连接反应
概念：
DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因 共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键，使原来断 开的DNA缺口重新连接起来。
白细胞介素(IL-2)检测及临床意义
白细胞介素（IL-2）检测及临床意义
一、概述
白细胞介素-2 (IL-2)又称T细胞生长因子。
主要由T细胞产生。
是在淋巴细胞增殖分化过程中重要的细胞生长因子，生理作用有刺激T细胞生长、诱导细胞毒作用和对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用等
二、检测方法
IL-2主要检测方法为生物素亲合素系统的双抗体夹心ELISA 法。
三、临床意义
1、IL-2可提高人体对病毒、细菌、真菌和原虫等感染的免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK 细胞)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。
2、IL-2 还可以增加抗体和干扰素 (IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。
3、IL-2的表达异常与临床多种疾病有密切关系，尽管外周血、尿液中IL-2 水平，或激活淋巴细胞上清液中IL-2水平的异常没有疾病特异性，但是可作为相关疾病的辅助诊断、预后及疗效观察提供可靠数据。
4、IL-2升高：肿瘤、心血管病、肝病等疾病时均可使 IL-2 水平升高，在器官移植后早期排斥反应时也出现IL-2表达升高。
5、IL-2降低：在多种原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病时均可伴有 IL-2 水平降低，如 SLE、麻风和艾滋病等。
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１ ０ ｏ Ｌ ／ 孔转 移 至新 的 ９ ６孔 细胞 培养 板 中； 离 心收集 ２ Ｅ ８细
人Ｉ Ｌ － ７ （ ｒ ｈ Ｉ Ｌ － ７ ） 取得很 大 的进 展 】 ， 不管采 用何种表达 系统
制备 ｒ ｈ ｌ Ｌ － ７ ， 其生 活学活 性 高低成 为评 价 ｒ ｈ ｌ Ｌ － ７质量 的重 要 指标 。 目前 ， Ｉ Ｌ ． ７活性测定 方法包括 ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ２ ｂ细胞增殖 法 、 Ｐ Ｂ － ＭＣ细胞增 殖法和 ２ Ｅ ８细胞 增 殖法 ， 前 两种 方 法 中采用 的 ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ２ ｂ细胞无购买途径 ， Ｐ Ｂ ＭＣ细 胞需 要每次新鲜制 备 ， 操作 繁琐 ， 对 实验条件要求 高 ， 在 检测 的 准确性 、 重 复性 和结果 一
从 细胞和样品稀释培养基类 型、 细胞 密度 、 样品稀释倍数 以及样 品和细胞 相互时间等 多个环 节对 实验条件进 行优化 ； 将建立 的 ２ Ｅ ８细胞增殖法
应 用于重组人 白介素－ ７ 和鼠 白介素－ ７的活性检测 。结 果
建立 了采 用 ２ Ｅ ８细胞增 殖 法测 定 白介 素＿ ７生物 学活性 方法 ； 实验 条件优化 结果表
摘要 ： 目的 建立并优化采 用２ Ｅ ８细胞株 测定 白介 素－ ７生物 学活性 方 法， 并应 用于重 组人 白介 素＿ ７和 鼠 白介 素＿ ７的 活性检 测。 方 法 将
Ｒ ＆Ｄ重组人 白介素＿ ７进行梯度稀释后 ， 与２ Ｅ ８细胞 相互作用一段时间 ， 通过 Ｍ ＴＦ法测定细胞 增殖 情况 ， 从 而反 映重组 白介素＿ ７的生物学活性 ；
关键词 ： ２ Ｅ ８细胞 ； 白介 素－ ７ ； 生物 学活性 中图分类号 ： Ｒ ９ １ ４ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ６ － ３ ７ ６ ５ （ ２ ０ １ ５ ） ． ０ ５ — １ ２ ０ ５ － ０ ２ ４ ３ － ０ ４
白介素－ ７ （ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｄ ｅ ｕቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｋ ｉ ｎ － ７， Ｉ Ｌ － ７ ） 是 １ ９ ８ ８年 Ｎ ａ ｍ ｅ ｎ等应 用骨
６ ． ０ ４ ％， 检测 结果稳 定， 表 明此方法具有可靠 的重复性 。结 ｊ 沦 建 立并优化 采用 ２ Ｅ ８细胞株 测定 白介 素－ ７生物 学活性 方法 ， 该 方法操作 简便 ， 定量准确 ， 重复性好 ， 稳定可靠 。可有 效应 用于重组人 白介素－ ７和鼠白介素 的活性检测 。
致 性方面 也存 在难 以克 服 的 障碍 。２ Ｅ ８细 胞 增殖 法 是基 于
胞， 用Ｐ Ｂ Ｓ 清洗细胞 ２ 次， 计 数后 用样 品待测／ 细胞稀 释培养 基重悬至一 定 的浓 度 ， 以５ ０ ￣ Ｌ ／ 孔加 入到装 有不 同浓度 Ｉ Ｌ － ７
标准品或待测样 品的 ９ ６孔 细胞培养板 中 ， ３ ７ ￣ Ｃ、 ５ ％ｃ ０ ２ 条 件 下培养细 胞一 定 时 间 ， 加入 ５ ｍｇ・ ｍ Ｌ ＭＴ Ｆ溶液 ２ ０ 孔；
核 巨噬细胞表达多 种 细胞 因子” 。采 用 重 组技 术 制备 重 组
胞 培养 箱购 自Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ 。
１ ． ２ ２ Ｅ ８细胞 增殖法测定 Ｉ Ｌ － ７ 生 物学活性 用样品待测／ 细 胞 稀释培养 基 将 Ｉ Ｌ － ７标 准 品 或 者 待 测 样 品稀 释 至 １ 懈 ・
Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｔ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ Ｖｏ ｌ ２ ７ Ｎｏ ． ５ ２ ０ １ ５
２ Ｅ ８细胞 增 殖 法测 定 白介 素 ． ７生物 学活 性 的 建 立 与应 用
周 婷 （ 厦 门特 宝生 物 工程 股份 有 限公 司 厦 门 ３ ６ １ ０ ２ ２ ）
剐 进 行 ３次测 定 ， 结 果平 均值 分 剐 为 １ ２ ． ０ ９ ｘ １ ０ 、 ９ ． ０ ０ ×ｌ ０ 、 １ ０ ． １ ９ ×１ ０ 、 １ ０ ． ２ ３ ×１ ０ Ｕ ・ｍ ｇ ＿ 。 ， 变 异 系数 分 剐 为 ３ ． ９ ７ ％、 １ ． ４ ｏ ％、 ３ ． ０ ９ ％、
３ ７ ｃ 放置 ４ ｈ ， 然后 加入 Ｍ Ｔ Ｙ 溶 解液 １ ５ Ｏ Ｌ ／ 孔， 使用 多通道 移 液器吹打孔内液 体均匀 ， 放入酶标仪中 ， 以６ ３ ０ ｉ ｒ ｍ为参 比波长 ，
测定 Ｏ Ｄ 跏值 ， 结果取 ２复孔的平均值 ， 利用 ｓ ｏ ｆ ｔ Ｍ ａ ｘ ｐ ｒ ｏ ５ ． ２软
明， 在Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０＋ ２ ０ ％Ｆ Ｂ Ｓ ＋ ０ ． ０ ５ ｍ Ｍ ２ ・ 巯基 乙醇的稀释培养基 背景 下， 样品 以 １ Ｉ ． Ｌ ｇ ・ ｍ Ｌ － １ 的起始 浓度上 板， 采用 ５ 倍 梯度稀释 ， 与２ ｘ １ ０ ／ ｍ Ｌ 的２ Ｅ ８ 细胞相互作用 ， 培养 ４ ８ ｈ ， 可以得到典型 的四因子回归曲线 ； 利用优化后 的实验 条件 对重组人 白介素＿ ７和鼠 白介素－ ７ 各２ 批样 品的活性分
定仪 器酶 标 仪 Ｓ ｐ ｅ ｅ ｔ ｒ ａ Ｍａ ｎ Ｍ ２ ｅ为 Ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｄ ｅ ｖ ｉ ｃ ｅ ｓ 公司， 细
髓长期培养 系统（ Ｌ Ｔ Ｂ Ｍ Ｃ） 发 现 的一种 能 够刺 激前 Ｂ细胞生 长的细胞 因子 ， 随着研究 的深入 ， Ｉ Ｌ － ７在 白细胞 的发 育和功 能 上表现越来越 多的作用 ， Ｉ Ｌ ｏ ７不仅 是正 常 Ｔ， Ｂ淋 巴细胞分 化 成熟 过程 中的重要 因子 ， 还是 多潜能 干细胞 和髓 系前体细 胞 的移 动因子 ， 同时 ， Ｉ Ｌ － ７还能 够促 进 Ｔ淋 巴细 胞功 能 、 诱 导 单