最新的分子间相互作用分析技术--微量热泳动
使用mst在天然的生物溶液中測定分子間相互作用

使用MST在天然的生物溶液中测定分子间相互作用摘要在人体内的蛋白互作反应与在体外的情况是不同的。
在研究蛋白功能和开发新药的时候这一点是很重要的。
在这篇文章中,我们介绍了一种高效,不限缓冲液的方法,即微量热泳动方法,这种方法可以分析蛋白分子或者小分子在生物液中的相互作用,比如血清或者细胞裂解液。
这种技术以分子的热泳动为基础,提供了分子大小,电话和水化层方面的信息。
我们用免疫学相关系统,包括人体干扰素γ,以及钙调蛋白和钙离子的相互作用验证了这种方法。
小分子抑制剂橡黄素和它的激酶PKA的亲和力分别在缓冲液和血清中进行测定,结果发现二者的亲和力在血清中下降了400倍左右。
生物体液对亲和力的影响给予蛋白功能研究更可靠的结论,有可能促进更多高效的药物开发。
结果实验方法实验设置是由红外激光通过红外分色镜被耦合至荧光激发/发射通道中而最终完成成像(Fig. 1a)。
激光通过物镜(此物镜也被用作进行荧光检测)聚集在样品上。
这样就能够在各种微流样品隔室里,比如毛细管或者微流通道里进行热泳动观察。
使用100um 直径的玻璃毛细管,以及500nl的体积使得消耗的样品量很低,而且有很高的重复性。
红外激光在25um的长度范围内产生一个空间上的温度分布。
温度与激光功率呈线性增长。
在150ms后,激光加热与散热达到平衡,得到一个差不多2-6K的稳态的温度增加。
温度上升引导了一个空间上的浓度分布,这个是可以根据与荧光染料共价结合的互作分子的荧光变化观察到的。
一般来说,每个蛋白分子的一个伯胺会被标记,所以染料的位置也是呈统计学的分布。
考虑到一个典型的蛋白分子里的赖氨酸数量,我们可以认为标记会影响结合的机率是很低的。
大部分蛋白分子被标记在远离结合位点的位置上,影响结合反应的只是小部分。
为了测量蛋白分子的热泳动过程,我们对初始状态与稳态之间的浓度变化进行测量。
所以可以得到样品的两个图像:在激光加热前的初始状态的图像,显示的是分子的同质均匀分布;第二个图像是激光加热数秒后的图像(Fig. 1b)。
食品中大小分子互作用ppt课件

本质的研究, 有助于理解在食品科学、生命科学、医学、药学领域中涉及到 的分子之间的相互作用以及相互识别过程。
实际应用 食品中大分子与小分子的相互作用,使其理化性质发生一定的
改变,利用其可进行蛋白质、多糖的改性、核酸的修饰,以满足在食品研 究领域中的分析鉴定需要乃至生产加工需求。
04
02 PART TWO
光谱学技术探究食品中的 大小分子互作用
分子荧光光谱法
前表面荧光技术
前表面荧光方法是将入射光与样品成30°或56°,只对比色杯表面一层的 待测物质进行检测,样品的光照面较大,可减少样品位置的敏感性,适 用于不透明的样品,省去了很多对样品前处理的步骤,适用于快速检测。
同步荧光光谱技术
中性分子、离子、食品营养成分及添加剂、表面活性剂、药物(包括抗癌药物、 抗菌素药物、心血管类药物、杀虫剂、生物毒剂等)及制剂辅料、蛋白质的变 性剂以及蛋白质、DNA测试探针试剂等。
01
相互作用类型
• 蛋白质:小分子与蛋白质间多是非共价键的作用, 包括静
电作用、氢键、范德华力等,虽然非共价相互作用很弱(一般 小于10kJ/mol,比通常的共价键键能小1 ~ 2个数量级),作用 范围为0.3 ~ 0.5nm, 但这些分子间弱相互作用力可在一定条 件下起加合与协同作用,形成有一定方向性和选择性的强作 用力,而这种强作用力是分子识别与组装的基础。
• 核酸: DNA与靶向分子之间的相互作用主要有非共价键
作用、共价键作用和剪切作用三种。非共价键相互作用的 方式主要有:
• 1,外部静电结合(Electrostatic Binding)
• 2,沟区(大沟区、小沟区)结合(Groove Binding)
微量热泳动仪MST ---最新的分子间相互作用分析仪

1微量热泳动仪MST---最新的分子间相互作用分析仪微量热泳动技术微量热泳动技术Microscale Thermophoresis 通过测量微观温度梯度场中的分子移动来分析生物分子间的相互作用。
该技术能够测量出分子大小、电荷以及水化层变化引起的移动速度的改变,具有极高的灵敏度。
微量热泳动技术MST 具备以下主要特点: ∙ 快速:在10分钟之内测量解离常数∙高灵敏度范围:小到离子和片段的结合,达到复合物的作用均能测量(例如脂质体和核糖体) ∙实验多样性和稳健:可以再任何溶液之中完成测量,即使是复杂的去污剂溶液(膜受体) ∙接近天然的测量环境:可以在血清和细胞裂解液之中测量(NT.115) ∙高信息含量:可以直接反映出样品分子的聚合或者其他人为假象产生的结果 ∙完成各种物理学参数:亲和力、化学计量学、结合能 ∙ 低样品消耗量: < 4 µl @ nM 级别浓度 ∙ 游离状态完成测量:无需固定∙动力学范围:sub-nM 到mM (NT.115);10nM 到mM (belFree )级别的解离常数 ∙ 无需维护∙简单易操作:简单的样品准备和直观的软件界面2Monolith NT.115德国NanoTemper 公司提供两种微量热泳动仪: Monolith NT.115和Monolith belFree ,每款设备具有独特的特点和优势,方便用户根据需要选择适合的型号,且具有良好的互补性。
如果您对各种不同的样品的分析感兴趣,我们推荐您考虑同时使用两款设备。
NT.115: 通过荧光标记来完成测量:∙可以在各种缓冲液之中完成测量,包括像细胞裂解液之类的复杂的生物溶液 ∙使用荧光染料来完成测量,能够满足各种不同的结合实验需求(从离子结合到核糖体和组蛋白结合),灵敏度极高 ∙可以测量各种(生物)分子的相互作用,而不受限于他们的光谱学特性 ∙ 适用于sub-nM 到mM 级别的亲和力belFree :测量内在荧光∙无需标记荧光标签,因此可以测量对于标记过程敏感的样品,例如一些跨膜受体 ∙系统非常灵敏,甚至是目标分子的微小基团的修饰变化也可以被测量到 ∙适用于各种反应,尤其是一个结合物的内在无荧光信号,,测量范围包括核酸、多肽、糖、小分子和很多蛋白 ∙适用于10nM 到mM 级别的亲和力Monolith belFree微量热泳动仪V08。
分子间相互作用分析仪热泳MST-PPT文档资料

Title: The Decondensation factor 31 specifically binds to ssRNA but not to ssDNA or dsDNA
Object: Decondensation factor 31- ssRNA /ssDNA /dsDNA
Results the interaction of the Df31 protein and ssRNA could be detected. However, ssDNA and dsDNA showed no binding to Df31. 2) The calculated Kd from the measurements of the Df31 binding to ssRNA was 24.01 ± 3.15 μM.
激光微量热泳技术研究碳量子点与脱氧核酸分子的亲和行为_杨青峰

0 引 言
碳量子点是尺寸小于10nm 的球形纳 米 材料,简称碳点 (Carbon dots,CDs)[1]。目前制备碳 点 的 方 法 大 致 分 为:(1) 自上而 下 法,主 要 有 电 弧 放 电 法[1]、激 光 刻 蚀 法[2]、电 化 学 氧 化法 等 [3-6] ;(2)自 下 而 上 法,主 要 有 微 波 法[7]、超 声 法 和 [8,9] 水热 合 成 法 等 [10-13] 。 与 传 统 半 导 体 量 子 点 相 [14] 比,碳 量 子 点具有无毒或低 毒 特 性,良 好 的 生 物 相 容 性 和 环 境 安 全 性、 水溶性以及廉价易 得 等 优 点 ,所 [15-17] 以 在 生 物 标 记、荧 光 探 针生物检测等领域都具有重要的应用价值 。 [18-22]
本实验以葡萄糖 为 主 要 碳 源,精 氨 酸 为 氮 源,采 用 水 热 法合成碳 点,并 运 用 TEM、FT-IR、XPS、UV 和 F-7000 荧 光 分光光度计 表 征 碳 点 性 能,然 后 运 用 激 光 微 量 热 泳 动 技 术 (MST)[25-28]研究碳点 与 4 种 dNTP 和 单 双 链 DNA 分 子 间 的相互作用。这对碳点标记 DNA,制备碳点-DNA 复合的荧 光分子探针等碳点应用具有重要意义。
1.3 碳点与4种 dNTP 的 MST 测试 将碳点配制成 浓 度 为 0.3 mg/mL 的 溶 液,固 定 碳 点 的
溶度。将4种 dNTP从 100 mmol/L 开 始 进 行 1∶1 梯 度 稀 释 成16个梯度,每梯度取5μL 样品与5μL 碳点溶液充分混 合,室温 静 置 5 min 左 右,转 移 至 毛 细 管 中。 将 毛 细 管 置 于 MST 仪器中,在 LED power 20%、Laser power 20% 及 蓝 光 激发条件下进行 MST 实验测试。
微量热泳动(microscalethermophoresis,MST),一种最新的生物大分。。。

微量热泳动(microscalethermophoresis,MST),⼀种最新的⽣物⼤分。
微量热泳动仪-microscale thermophoresis (MST)是由总部设在慕尼⿊的德国⾼科技公司NanoTemper技术有限公司发明的设备。
2010年底的⼀篇Nautre的⽂章《Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis》最先报道了NanoTemper公司创始⼈Dr. Stefan和 Dr. Philipp使⽤MST测量⽣物溶液中蛋⽩-蛋⽩之间的相互作⽤,引起了很多科研⼈员的极⼤兴趣。
微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)是⼀种分析⽣物分⼦相互作⽤的技术。
这项技术基于⽣物分⼦的热泳动, nanotemper微量热泳动仪使⽤红外激光进⾏局部加热导致分⼦定向移动,继⽽通过荧光分析温度梯度场中的分⼦分布⽐。
MST技术能够检测到由于结合⽽引起的⽣物分⼦的⼤⼩、电荷和⽔化层的变化。
相互作⽤的过程可以在天然条件下,⽆需固定、任何⽣物溶液中完成测量。
MST在分析对象的⼤⼩范围和检测动⼒学范围等参数上是⽬前最优的技术。
此外,MST的适应性很强,适合不同的环境要求、不同的⽣物分⼦、不同的溶液环境(如膜蛋⽩等需要某些特殊溶液环境的样品)、缓冲和添加剂的类型可以⾃由选择(例如可以使⽤任何浓度DMSO等有机溶剂)、可以在复杂的⽣物溶液甚⾄细胞溶解液中完成⽽⽆需样品纯化。
通过MST可以测量不同的结合模式,包括⼆聚化、协同作⽤和竞争作⽤。
MST使⽤便宜的⽑细吸管作为耗材,样品⽤量少,避免了昂贵的样品消耗和繁琐的制备过程。
相对于其他的已有的测量分⼦间相互作⽤的技术,MST⼤⼤降低所需的实验成本。
热泳动实验 (左图) 通过聚焦的红外激光加热⽑细管之中的溶液,同时通过hotmirror来检测荧光。
分子间相互作用理论研究现状及进展

正 ,尤其是基组叠加误差需用均衡校正法 ( CP) [2 ]进行校正 。 关于基组叠加误差及其校正方法详细描述见后面部分 。
此方法除了单一总作用能 Eint之外 ,无法求得其他作用 能分量信息 ,如静电能 、诱导能 、排斥能和色散能等 [3 ] 。该方 法比较直接 ,并且不需要多余的计算过程 ,计有以下优点 : (1)不存在关于作用能微扰展开的收敛问题 ; ( 2 )有些效应 , 如理论上难以处理的交换 - 变形效应自然而然地被包括在 内 ; (3)人们能利用各种理论方法和效能高的代码来运用此 方法 。
定域相关方法是研究分子间相互作用的选择性超分子 方法 [24, 25 ] 。此方法的主要目标是减少由于化学体系大小而 造成的成本计算的不合理性 ,但同时也引进了一些研究分子 间相互作用的有利概念 ,如简化的基组叠加误差 [24 ]和将定域 相关能量分解为不同可能性的激发态 [25 ] 。特别是 , Saebo S 等人 对 水 分 子 二 聚 体 [24 ] 、Schutz M 对 水 分 子 簇 [25 ] 及 Runeberg N 对金的二聚体模型物 [26 ]分别在二级定域相关微 扰 理 论 ( local2correlation M ler2Plesset perturbation theory through second order, LM P2 ) 和 均 衡 校 正 的 二 级 微 扰 理 论
超分子方法已成功地运用于硝基 、硝胺 、硝酸酯和叠氮
类体系及其他的高能体系中的分子间相互作用的研究 [4 ] 。
此方法比较成熟且比较流行 ,常用于评估由其他方法得到的 结果 。
1. 2 密度泛函理论 ( de n s ity func tio na l theo ry, D FT) 密度泛函理论 (DFT)通过泛函 (以函数为变量的函数 )
微量热泳动技术原理及其在研究生物分子互作方面的应用

微量热泳动技术原理及其在研究生物分子互作方面的应用艾秋实;曹向宇;赵芊;牛亚利;宋水山【摘要】微量热泳动(MST)技术是近年来兴起的一项用于研究生物分子间互作的新技术。
其检测是基于热泳动现象,即分子在温度梯度中的定向运动及由此引起分子性质的变化,如分子大小、电荷和水化层及构象等。
该方法把精确的荧光检测与灵敏的热泳动相结合,从而提供了一个灵敏的、快速的精确分析生物分子间互作的检测方法。
就MST的工作原理和检测过程及其在生物学研究中的应用作以综述。
%Microscale Thermophoresis(MST)is a new technique to study biomolecular interactions in recent years. It is based on thermophoresis, i.e., the directional movements of molecules in a temperature gradient, which results in subsequent changes of molecular properties such as sizes, charges, hydration shell and conformation. MST combines the precise fluorescence detection and sensitive thermophoresis and provides a sensitive, fast and precise detection technique to analyze biomolecular interactions. Wor king principle, detection process and application of MST in biology researches are reviewed here.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】7页(P67-73)【关键词】微量热泳动;互作分析;结合性研究;生物分子间互作【作者】艾秋实;曹向宇;赵芊;牛亚利;宋水山【作者单位】河北省科学院生物研究所,石家庄 050081; 河北农业大学生命科学学院,保定 071001; 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心,石家庄 050081;河北省科学院生物研究所,石家庄 050081; 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心,石家庄 050081;河北省科学院生物研究所,石家庄050081; 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心,石家庄 050081;河北省科学院生物研究所,石家庄 050081; 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心,石家庄 050081; 河北工业大学化工学院,天津 300130;河北省科学院生物研究所,石家庄 050081; 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心,石家庄 050081【正文语种】中文研究生物分子的相互作用,对于探明生物体信号转导通路及调控机制、生理生化代谢途径具有重要意义。
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有机物含量的指标
• •
电阻率 MΩ.cm
有机物(TOC), ppb
600 400 200 0 240
添加有机物(蔗糖) 于纯水ห้องสมุดไป่ตู้,做为Milli-Q的进 水后,其所产超纯水的水质变化
细菌
细菌总数(cfu / mL) 热源 (Eu / mL) 颗粒(> 0.2µm) (units / mL)
阻塞过滤装置、色谱柱,在柱内形成涡流效应 具有光散射作用,降低UV的杀菌作用 颗粒和胶体 (硅胶体、泥沙、 对仪器的蠕动泵造成表面磨损影响溶剂分配精确度, 灰尘、管路剥落) 严重时可造成泵的物理损坏 在培养基或染料内形成假阳性观察结果
取水臂+终端滤器
一机两水,超纯六水
Q-POD Element 超痕量元素分析
VOC-Pak 去除挥发性有机物
EDS-Pak
内分泌干扰物分析
Milli-pak 经典的无颗粒和细菌 滤器 LC-Pak 去除痕量有机物 Bio-Pak 有效去除热源、 核酸酶及蛋白酶
15
Merck Millipore良好用水习惯
7 Presentation title in footer | 00 Month 0000 带电粒子的电荷拮抗作用
水质保障
TOC<5ppb RNases<0.01μg/ml DNases<4pg/ml 电阻率=18.2 MΩ.cm
Rnase去除效果的挑战性实验
分别检测供水水质及产水水质,蓝柱代表供水;红柱代表产水
水质保障
TOC(总有机碳)<5ppb 电阻率=18.2 MΩ.cm 细菌<0.1cfu/ml
RNases<0.01μg/ml
DNases<4pg/ml
• 瓶装水体系发 现206个检测
瓶装水
Milli-Q 水
•超纯水发现407个 检测点,而且更灵敏
纯水对于蛋白检测(LC-MS/MALDI-TOF MS)的重要性
2012 2008 2007 2000
1970’s
1980
1985
1989
1996
为什么关注实验室用水
水中污染物
——最基础和重要的试剂
监控指标
污水/自然水体→自来水→ 2/3级纯水→1级超纯水→专业级超纯水
对各类实验产生的影响 离子
(Na+/Ca2+/Fe3+/S O42-/Cl-) 电阻率(M.cm@25℃) 直接影响特定离子的检测 遇高浓度有机试剂形成结垢,堵塞仪器管路和色谱柱 电导率(μS/cm@25℃) 重金属离子抑制PCR聚合酶的活性;影响电泳速度; 电导率=1/电阻率 影响细胞及微生物正常生长 滴定反应、pH值测定等实验
6
Presentation title in footer | 00 Month 0000
实验用水对于杂交&基因芯片检测的重要性
基因芯片的主 要反应为:杂交 &荧光效应
TOC=22ppb;电阻率=18.2 MΩ.cm
TOC=3ppb;电阻率=18.2 MΩ.cm
影响因素
有机物对杂交的极性干扰 和结合位点竞争/有机物 自身荧光作用 核酸酶对杂交过程核酸的 降解作用
1
3
神经干细胞培养 经超滤的一级超纯水 无超滤的一级超纯水 二级纯水去离子处理
Countin g on day 4, n = 3 TM3: mouse Leydig cells TR-1: rat endothelial cells M2R: mouse melanoma cells
1. 2. 3.
离子含量的指标
•
•
电阻率值仅能用来表示水中离子浓度高低,与其它污染物的浓度无关
18.2 MΩ.cm超纯水之含意仅能代表水中总离子浓度在1 ppb 以下,其它污染物需以 不同的方法来检测。影响实验结果及再现性的绝不仅于离子而已。 水中有机物含量的高低用TOC(总有机碳)来表示。 单纯的电阻率值指标不能够反映水中非离子污染物的含量,无监测则无控制,从而 导致实验失败。
引起炎症、发烧、菌血症等
动物饲养对于水质要求 水的硬度过高或颗粒含量高导致自动喂饲系统堵塞 细菌<100cfu/ml;病毒含量低于致病浓度 不含有过量的有毒有害、致癌物(重金属、余氯、农 兽药残留、抗生素、内分泌干扰素) 稳定的水质 大肠杆菌群 不得检出/100ml 进行免疫相关实验需要对水进行内毒素检测
2
3 细胞培养用水重点! 超滤去除痕量核酸酶和热原 超纯水确保有机物、离子、 微生物的有效去除
1. 2. 3. 脑细胞培养 经超滤的一级超纯水 无超滤的一级超纯水 二级纯水去离子处理
1
2
水质对于动物饲养的重要性
水体中对实验动物的影响因素
1.内毒素(大肠杆菌):影响动物生理,引发一系列免
疫反应,包括发烧、发炎、血压降低、休克等 2.塑化剂(环境荷尔蒙)引起动物早熟,干扰试验结果 3.微生物(绿脓杆菌群、大肠杆菌群):引起实验动物 免疫力低下,易受细菌感染,破坏实验动物免疫系统,
经过流量分段测量,产水1500L后未发现Rnase 出厂具备认证证书《Certificate of Quality》
1.2
1
0.8
0.6 0.4
0.2 0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Volume (L)
1100 1200
1300 1400
1500
实验室纯水应用对于2D电泳的重要性
颗粒(> 0.2µm) <1units / mL
TOC<5ppb
电阻率=18.2 MΩ.cm
细菌<0.1cfu/ml
•含有离子的纯水质谱图
细胞培养用水要求
一定要无菌 (酵母菌, 细菌, 真菌) 无蛋白及核酸酶和内毒素 有机物阻碍细胞生长. (增塑剂, 表面活性剂,农药残留)
化学消毒剂的影响 (氯)
18
重要的用水观点(3)---耗材需定期更换
在电阻率值及TOC值降到极低值之前,就需以定期的方式更换耗材,以确保水质.
与延长耗材寿命所得的利益相比,高纯净度的水质更为重要. 为防止耗材在物理上或化学上的劣质化,影响水质,所以要定期更换UV灯,终端滤器
25
电阻率值(MΩ・cm)
20 15 电阻率值 10 5 硼酸盐 硅酸盐
重要用水观点(1)---即取即用
越纯的实验室用水,越不宜久放
超纯水对周围环境物质有很强的溶解能力,被称为“hungry water” 超纯水从系统中取出,运送到实验操作场所过程中,很容易受到所使用容器的 溶出或者空气中的污染物质的污染,进而影响到实验结果
即取即用是非常重要的一个观念
使用前才取水的[即取即用]方式可避免超纯水受到环境污染
超纯水系统与有机溶剂等污染源隔离也是降低环境污染的重要因素
20-
电阻率值 (MΩ.cm)
10-
4-
空气中二氧化碳溶于超纯水而造成水质的劣化 •从碳酸中解离出之氢离子浓度 pH= 5.7 •氢离子及碳酸根离子增加,造成超纯水阻抗值 下降至 4 左右
20 40 60 80 100
0-
时间(分钟)
17
重要的用水观点(2)---双参数监控
浓度(ppb)
0
0 1000 2000 3000 取水量(L) 4000 5000 6000 7000
超纯水取水模式的革命---空间优化
引 领 纯 水 未 来
谢谢您的关注!
联系方式:400-889-1988 Yonina.Tang@
•应用超纯水的质谱图
水中污染物对蛋白检测的影响
颗粒、胶体堵塞色谱柱、形成柱内涡流、磨损色 谱泵 生物大分子及小分子有机物造成杂峰、峰形劣化、 保留时间偏离、基线漂移、色谱柱寿命下降、仪 器污染 离子形成加Na+或 K+ 微生物产生各种污染物,同时造成仪器堵塞,此 外还可驻留仪器内持续增殖
超纯水水质保障
有机物(腐殖酸、 • 影响细胞培养、PCR、电泳、TOC测定等实验;
核酸酶、三聚氰 胺、PCB)
总有机碳 TOC(ppb) • 导致液相色谱基线不稳定、鬼峰增加、灵敏度下降、 Rnases(ng/ml) 色谱柱寿命缩短 Dnases(pg/μl)
细菌本身影响生物学实验和仪器分析实验,裂解释 放热原,酶等多种物质 形成菌膜堵塞色谱柱及管路,持续释放各种污染物
实验室超纯水在生物医学相关实验的应用及解决方案
实验室纯水业务部
Merck Millipore 市场部 唐 莹 400-889-1988
讲座内容
一、实验用水对物生医学验实关相的影响
二、Merck Millipore良好用水习惯
默克密理博实验室纯水:40多年的传奇,全球最知名的品牌
不断塑造和引领实验室纯水金标准的演进和发展!
13
Merck Millipore纯水系统全景图
一体机
Milli-Q Integral 3,5,10,15 Milli-Q Direct 8/16
超纯水机
Milli-Q Advantage A10 Milli-Q Reference(A+) Synergy UV(R)
纯水机
Elix Advantage 3,5,10,15 Elix Reference3,5,10,15 Elix Essential 5,8,16,24
Milli-Q已经成为超纯水的代名词,有超过4万多篇SCI文献提及并使用Milli-Q水
• 1973年,Merck Millipore 推出世界上第一台实验室级超纯水系