生物样品预处理

二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
D.药物的稳定性： a.易氧化药物:加入抗氧剂 b.易被光分解药物:避光 c.易被酯酶水解药物:对酶进行灭活

二、指导原则-预处理应考虑问题
2.待测药物的浓度 浓度越大，预处理要求越低；反之，浓度越小， 预处理要求越高。例如，地高辛的治疗血药浓度 为1-2ng/ml,而水杨酸的治疗血药浓度为20100μg/ml。
生物样品预处理的常用方法 以及最新进展

目录
1
2 3
生物样品预处理的目的
预处理的指导原则
常用的处理方法
处理方法简介
4

一、生物样品 生物样品的种类
血液
组织 器官 生物 样品 唾液 头发

• • •

三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需 用酶解法。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。 它不仅可使组织溶解，并可使药物析出。枯草菌溶素是 一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH范围（ PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃ 具有最大活力。

三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
操作步骤： a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合 b.离心分离，采用超速离心机（10000r／min）离 心1～2min。（使用具塞塑料尖底管） c.取上清液作为样品。 将蛋白质粘牢在

三、常用的处理方法-除蛋白法
B.加入中性盐
加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐 能将与蛋白质水合的水臵换出来，从而使蛋白质脱 水而沉淀。 常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷 酸盐及枸橼酸盐等。 操作：a.按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2混合; b.离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以 上的蛋白质。 c.得上清液的pH为7.0～7.7。
坏 表面水化层 蛋白质亲水胶体颗粒 表面电荷 破 坏

调节pH至等电点 凝集析出 加入脱水剂
三、常用的处理方法-除蛋白法
测定血样时，首先应去除蛋白质。 去除蛋白质作用：
a.可使结合型药物释放出来，以便 测定药物的总浓度； b.可预防提取过程中蛋白质发泡， 减少乳化的形成； c.可保护仪器性能（如保护 HPLC柱 不被污染），延长使用期限。
管底，便于吸取 上清液

三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂 只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 3）在生化制备中应用比盐析法广泛。
缺点：对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和 酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。

二、生物样品预处理的指导原则
生物样品进行预处理时应考虑到的问题：
1.药物的理化性质和存在性质
2.待测药物的浓度
3.药物测定的目的 4.选用的生物样品类型 5.样品预处理与分析技术的关系

二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式 三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
操作：先将被测组织加Tris-缓冲液pH 10.5及酶， 60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液， 即可供药物提取用。 优点：可避免某些药物在酸及高温下降解；对与 蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英钠）， 可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取 酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检 测时，无需再进行过多的净化操作。
不足：不适用于在碱性下易水解的药物。

三、常用的处理方法-缀合物的水解
• 缀合物：药物或其代谢物与内源性物质结合生成 的产物。
•
内源性物质： a.葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸 等； b.一些含有羟基，羧基，氨基和巯基的药物，可 与内源性物质葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸 苷缀合物； c.一些含酚羟基，芳胺及醇类药物与内源性物质 硫酸形成硫酸酯缀合物。

三、常用的处理方法-除蛋白法
D.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂
• 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质 分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。 常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。 离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。 优点： 可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处 理后进样，简化操作。

二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率：
a.结合蛋白率高: 首先去蛋白 b.多为代谢缀合物：缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性：涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。 紫外吸收强弱：是否用UV检测器 含有-NO2 、-Cl等电负性基团：ECD检测器

三、常用的处理方法-缀合物的水解
b.酶水解法
温和 专属性强
费用高
特点
时间长
带入粘蛋白导致乳化
带入粘蛋白阻塞色谱柱

四、常用的处理方法-分离、浓集、纯化
（一）液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE） 是传统的分离、分析方法，据检测灵敏度要求，提取后 一般需浓集。 传统浓集方法： a.在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取 到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。 b.挥去提取溶剂法。挥去溶剂时应避免直接加热，防止 被测组分破坏或挥发损失。挥去提取溶剂的常用方法 是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不 稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。

三、常用的处理方法-缀合物的水解
特点：多用于尿中药物或其代谢物；缀合物极性 较大，不易被有机溶剂提取。
常用方法：
a.酸水解：适量盐酸（条件因药而异） b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者 的混合酶，一般控制pH值在4.5～5.5， 37℃培育数小时。
尿液
其他
胆汁、乳汁、脑脊液、泪液、 精液、胃液、胰液、淋巴液、 粪便等。
一、生物样品预处理的目的
1.使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的 总浓度。
2.生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量 的，必须先经过预处理，使纯化，富集。
3.为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度。 4.为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度、 准确度、精密度和选择性等。

三、常用的处理方法-除蛋白法
1.蛋白质沉淀方法
溶剂解法 盐析和脱水 加入中性盐 蛋白质沉淀
加入强酸
生成不溶性盐沉淀 加入重金属沉淀剂

三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结 合的药物释放出来。 常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水 溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将 90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不 同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液 的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH 为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。
湿法 破坏
干法 破坏

三、常用的处理方法-除蛋白法
蛋白质 沉淀
酶解法
去除蛋白

三、常用的处理方法-除蛋白法
1.蛋白质沉淀
蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为 蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质 一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质 沉淀，在一定的条件下，变性的蛋白质也可 不发生沉淀。 破
分析：过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；
也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳 酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯 酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。 因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性条件下易 分解的药物不宜用本法除蛋白。

四、分离、浓集、纯化-液液萃取法
原理：
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度 大于在水相中的溶解度，而血液或尿液中含有的大多 数内源性杂质是强极性的水溶性杂质。因而用有机溶 剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提 取药物经浓集后作为分析样品。
C.加入强酸
当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式 存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶 性盐而沉淀。 常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸钨酸混合液及5％偏磷酸等。

三、常用的处理方法-除蛋白法
C.加入强酸
操作：
a.含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合; b.离心〈10000r／min）1～2min(可以除去90％以上的蛋白质) c.取上清液作为样品。 优点：该方法去蛋白迅速简单， 且而所需样品量少， 组分极少变化。
A.酸碱性质、未电离分子的亲脂性、挥发性：涉及药物 的提取性质、是否挥发损失以及能否采用GC法 a.较亲脂的药物：可用溶剂萃取，也可用烷基键和相 硅胶、大孔吸附树脂及亲水型填料SPE等方法。 b.亲水性较强且有酸碱性、可电离药物：离子交换柱 和离子对液液萃取等。 c.亲水性较强但不能电离药物：沉淀蛋白

三、常用的处理方法-除蛋白法
B.加入中性盐
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优点: 药物的回收率高； 不引起蛋白质变性。
注意事项 : 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度， 溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。

三、常用的处理方法-除蛋白法

三、常用的处理方法
常用方法