基因编辑方法CRISPRCas9
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
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基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
基因编辑技术CRISPRCas9的原理与方法探究
基因编辑技术CRISPRCas9的原理与方法探究CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，使科学家能够精确、高效地修改生物体的基因组。
这一技术源于细菌的免疫系统，CRISPR是“簇规律间隔短回文重复”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写，Cas9则是CRISPR相关蛋白9的缩写。
CRISPR-Cas9技术的原理是通过引导RNA（sgRNA）的作用，将Cas9蛋白导向特定的DNA序列，然后通过Cas9的核酸酶活性切割靶标DNA，以实现编辑基因的目的。
具体而言，CRISPR-Cas9技术主要包括以下几个步骤：第一步：设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一段含有20个碱基的DNA片段，其中包含一个引导序列，用于与目标DNA序列互补结合。
第二步：制备sgRNA与Cas9蛋白的复合物。
sgRNA与Cas9蛋白形成复合物后，sgRNA将指导Cas9蛋白在细胞质内寻找与其序列互补的DNA。
第三步：与导向序列互补的DNA靶标结合。
sgRNA将Cas9蛋白导向到与其引导序列互补的DNA靶标上。
第四步：Cas9蛋白剪切DNA。
一旦Cas9蛋白与DNA靶标结合，其内在的核酸酶活性就会被激活，Cas9蛋白会向靶标DNA中剪切位置的特定位置引入双链断裂。
第五步：细胞修复机制介入。
细胞会尽可能修复切割的DNA，主要有两种修复机制：非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）和同源重组（Homology Directed Repair, HDR）。
通过以上步骤，科学家可以利用CRISPR-Cas9系统对特定DNA序列进行增加、删除或修改，从而实现基因组的精确编辑。
这项技术的突出优点在于其简单、高效、灵活和经济，相对于之前的基因编辑方法，CRISPR-Cas9技术更加容易操作，并且可以用于多种物种。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项基因编辑技术是一种快速、高效修改生物体基因组的方法，近年来取得了显著的进展。
其中，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于基因组编辑领域，成为一种常用的工具。
本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法和相关的注意事项。
CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过RNA引导的Cas9蛋白复合物识别特定DNA序列，并将其切割，以实现对基因组的修改。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9的步骤和注意事项。
1. 目标序列选择与设计在使用CRISPR-Cas9进行基因组编辑之前，首先需要选择并设计一个适合的目标序列。
目标序列应具有特异性，同时应具备足够的保守性，以确保CRISPR-Cas9的高效性和准确性。
此外，目标序列还应远离重要基因或调控区域，以避免非特异性的剪切事件。
2. CRISPR RNA合成CRISPR RNA（crRNA）是一种由CRISPR序列和目标序列组成的RNA分子。
它通过碱基配对与Cas9蛋白结合，从而指导Cas9蛋白与目标DNA序列配对，并发生切割。
在合成crRNA时，需要注意避免污染和二聚体的形成。
3. Cas9蛋白表达和纯化Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的核心组成部分，它能够与crRNA形成复合物并介导DNA的切割。
在使用Cas9蛋白之前，需要将其进行表达和纯化。
选择合适的Cas9表达系统和纯化方法，确保获得高纯度的蛋白样品。
4. CRISPR-Cas9复合物形成将crRNA与Cas9蛋白复合形成CRISPR-Cas9复合物，是基因组编辑过程中的关键步骤。
将纯化的Cas9蛋白与合成的crRNA按照一定的比例混合，在适当的条件下进行复合，形成稳定的复合物。
注意事项包括避免RNase和DNA酶的污染，以及控制复合物的浓度和组装时间。
5. 细胞渗透与转染在进行基因组编辑之前，需要将CRISPR-Cas9复合物引入目标细胞内。
细胞渗透和转染是常用的方法，常用的技术包括细胞渗透剂、转染试剂、电穿孔等。
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项基因编辑技术是一种能够修改生物体基因组DNA序列的高效方法，它为生物学研究、疾病治疗和农业改良等领域带来了突破性的进展。
其中一项重要的基因编辑技术就是CRISPR-Cas9系统，它是目前最常用且最受欢迎的基因编辑工具之一。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9的操作指南与注意事项。
CRISPR-Cas9是一种借鉴自细菌免疫系统的基因编辑工具，它通过特定的引导RNA（gRNA）和Cas9酶来实现基因组的精确编辑。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9进行基因编辑的操作指南与注意事项。
1. 设计gRNA在使用CRISPR-Cas9之前，首先需要设计合适的gRNA。
gRNA是由20个碱基的引导序列和一个PAM序列组成，它能够识别需要编辑的基因组DNA序列。
设计gRNA时，需要遵循以下几点：- 选择目标位点：选择一个适当的目标位点，最好是在外显子区域或有功能影响的区域。
- 避免副作用：避免选择存在副作用的位点，如可能引发多个剪切位点或产生错配修复机制引起的小片段插入或删除。
- 考虑gRNA的特性：gRNA应具有足够的特异性和高效率的结合能力。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白一旦设计好了gRNA，就可以进行gRNA和Cas9蛋白的合成。
这可以通过基因合成技术或购买合成的gRNA和Cas9蛋白完成。
确保在实验进行前将它们充分储存和离心，以保证其质量和纯度。
3. 转染将gRNA和Cas9蛋白转染入要编辑的细胞中，通常可以选择化学转染、电转染或病毒转染等方法。
选择适当的转染方法取决于您的实验目的和细胞类型。
4. 验证突变编辑后的细胞需要进一步验证是否成功进行了基因编辑。
最常用的验证方法是利用Polymerase Chain Reaction（PCR）分析、Western blotting或Sanger测序等技术检查目标DNA是否发生了预期的突变。
确保验证过程的准确性和可靠性。
crispr cas9工作原理
crispr cas9工作原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，其工作原理可以分为三个主要步骤：适应、切割和修复。
1. 适应：CRISPR-Cas系统最初通过识别和适应外源DNA的
序列来开始工作。
这一步骤发生在细菌或古细菌中，它们利用Cas蛋白和一段短的RNA序列来识别和保存外源DNA序列。
2. 切割：一旦适应完成，CRISPR-Cas系统可以进行基因编辑。
在这一步骤中，细菌通过产生一种叫做sgRNA (单导RNA)的RNA分子，该分子拥有与目标基因序列相匹配的部分。
sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物可以前往细
胞核。
sgRNA和Cas9复合物会识别和结合到目标基因的特定DNA
序列上。
一旦结合成功，Cas9蛋白便会发挥剪刀的作用，切
割目标DNA，并形成双链断裂。
3. 修复：当DNA双链断裂发生时，细胞会尝试修复这一伤口。
通常有两种修复机制：
- 非同源末端连接（NHEJ）：这是一种快速但不精确的DNA
修复机制。
在NHEJ中，细胞会直接连接断裂的DNA末端。
这种修复方式可能会导致插入缺失或碱基改变，从而导致基因功能的改变。
- 同源重组（HDR）：这是一种较慢但更精确的修复机制。
在
HDR中，细胞会利用一个同源的DNA模板来修复断裂的DNA。
这种修复方式可用于插入、删除或修改目标基因的具体部分。
通过CRISPR-Cas9技术，我们可以精确地切割和修改基因，进而研究和改变生物体的特性和功能。
这项技术在基因治疗、农业改良和生命科学研究等领域具有广泛的应用前景。
基因编辑工具CRISPRCas9的使用方法详解
基因编辑工具CRISPRCas9的使用方法详解自从科学家于2012年首次使用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑后，这项基因编辑工具引起了广泛的兴趣和研究。
CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，能够精确地修改细胞或有机体的基因组，为科学家们提供了探索基因功能、治疗遗传性疾病和改良农作物等无限可能。
CRISPR-Cas9的使用方法很简单，主要包括以下几个步骤：1. 设计引导RNA序列（sgRNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键组成部分，它能够指引Cas9酶精确地将DNA剪切。
在设计sgRNA时，科学家需要选择一个目标基因的特定区域作为靶点，这个区域应该是单链DNA，并且具有20个连续核苷酸的序列。
2. 合成和验证sgRNA：一旦sgRNA序列设计完成，科学家们可以将其合成，并通过一系列实验来验证其有效性。
验证包括确认sgRNA与目标DNA序列的亲和力以及评估其能否成功引导Cas9酶到达目标基因。
3. 转染sgRNA和Cas9：一旦sgRNA和Cas9酶验证通过，科学家们将两者一起转染到要编辑的细胞或有机体中。
这可以通过各种转染方法实现，例如永生细胞中的电穿孔或胚胎中的胚胎注射。
4. 检测基因编辑：经过转染后，细胞或有机体中的Cas9酶和sgRNA会结合并识别并剪切目标基因的DNA序列。
科学家们可以通过PCR、Western blot、DNA测序等多种方法来检测基因编辑的效果。
一种常用的方法是T7终止测序，通过将目标基因进行PCR扩增，然后使用T7终止测序反应来确定基因编辑的结果。
总的来说，CRISPR-Cas9是一种快速、高效且精确的基因编辑工具。
然而，也需要注意一些潜在的问题和挑战。
例如，CRISPR-Cas9可能会造成非特异性的编辑效应，即不仅编辑目标基因，还会编辑其他非目标基因。
此外，CRISPR-Cas9的编辑效果可能会因细胞类型、转染效率以及sgRNA的选择等因素而有所不同。
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CRISPR-Cas9技术的应用进展 1. CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生DSB后， 细胞可以通过两种方式对DNA 进行修复， 非同源末 端连接 （non-homologous endjoining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。 而HDR往往通过供体 DNA 与基因组 DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因 Knockin。
原则列必须唯一，否则会对其他基因进 行敲除而出现错误的实验结果。
• 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同 源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。
• PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
Cell 2014 157,1262-1278 Figure4
CRISPR-Cas9 技术
sgRNA 的设计
• 选择 PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM， Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间 隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列中)
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A
CRISPR-Cas9 技术 • 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，
CRISPRs） • CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根
毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。
gRNA的活性检测
•限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突
变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突 变效率的高低来衡量sgRNA 的活性。 •非配对内切酶法
重组质粒导入细胞/生物体
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编
T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并对其进行切割， 如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。用 电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 •SSA 活性检测
基因编辑方法CRISPRCas9
基因组编辑技术
又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提 出更多精确的生物学问题。
方法包括： •锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 •转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like •Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术)
effector nuclease，TALEN）技术
锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋 白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白 特异结合域定位，DNA切割域剪切。
一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作 用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。通 过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。
据 CRISPR-Cas 系统的特性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9 技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 • CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。
构建重组质粒
构建方案 ： 1. 一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因
（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选） 。 2. 二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性
基因
载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病
降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚 基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导Cas9 D10A 识别并切割靶 位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。