昆虫酚氧化酶

昆虫酚氧化酶酚氧化酶（PO）又称为酪氨酸羟化酶或酪氨酸酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，位于黑素细胞中的黑素体内，绝大部分与黑素体膜相结合，只有极少部分以游离状态存在。

不同来源的PO，其生物化学特性具有一定的差异，并且在同种生物的不同器官中也具有不同的特征。

在高等植物中，酚氧化酶通过催化形成黑色素可进入表皮和毛发的角质细胞中，使体表着色。

哺乳动物合成的黑色素可以保护皮肤和，抵御紫外线的辐射，防止内部组织过热等。

酚氧化酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与昆虫的发育、伤口癒合和果蔬的褐变有密切关系。

因此多年来，酚氧化酶一直受到学术界的关注，其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。

目前已有上百种酚氧化酶的研究报道，来源于20多种生物的酚氧化酶已被测序，近几年来，对该酶的研究愈加深入，已有来自于链霉菌的酚氧化酶晶体结构的报道。

在昆虫体内，PO是一种重要的酶，它在昆虫的变态发育和名疫系统中起着重要作用。

酚氧化酶催化完成的醌鞣化作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化，这个过程对于具有“外骨骼”的昆虫生命过程至关重要。

在昆虫变态的各个阶段，譬如，由新生卵发育为成熟卵、幼虫蜕皮、幼虫化蛹以及蛹羽化为成虫后的体壁及其附肢的黑化和硬化过程都与酚氧化酶的作用息息相关。

因此，酚氧化酶抑制剂的研究可以为发展新型害虫控制剂提供重要线索，特别是研究不同昆虫酚氧化酶特性及抑制剂抑制动力学将会为发现一类全新的、专化性的无公害害虫控制剂提供理论基础和实践参考。

酚氧化酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能：1、参与表皮的硬化和黑化，昆虫的新表皮经过硬化和黑化过程才得以坚硬，从而可以起到支撑和保护整个虫体的作用，硬化过程中，PO产生的醌与角蛋白及甲壳质相互作用，最终形成角质，高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵。

2、对卵壳的鞣化作用。

3、参与伤害防御，在节肢动物中，PO要参与防御反应和伤口癒合。

对于小颗粒异物如细菌，宿主可通过吞噬作用来消灭它，当入侵的异物太大而无法被单个血细胞吞噬时，宿主便通过黑色素包囊反应来抵抗和消灭，而PO在这个过程中起重要作用。

当外来物入侵时，酚氧化酶原（proPO）从血细胞中释放出来并被激活成PO，在外来有机体上产生黑色素沉淀通包囊和黑化来限制入侵的外来物，因此，在包囊物的周围、血细胞结节中和感染真菌的角质部位会出现黑色素沉淀。

与此相似，当，操作部位会出现深色色素区，这是由于proPO被蛋白酶水解激活，而激活的PO将酚氧化成醌，最终形成黑色互。

酚氧化酶在伤口处催化产生黑色素沉淀以防止血淋巴丢失，并阻止入侵的微生物乘机进入，由此对有机体产生保护作用。

4、加速伤口的癒合。

5、产生具有细胞毒作用的氧自由基和具有潜在细胞毒作用的半醌及三羟酚，进一步增强寄主的防御能力。

活性氧如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢是脊椎动物和无脊椎细胞毒性成分，黑色素形成过程中伴随活性氧的产生，同时也产生具细胞毒性的半醌及三羟酚，半醌有结合亲核物质的特性，醌可结合到个来细胞物质的表面，通过形成黑色素包囊来隔离入侵的外来物，并通过醌和其他中间产物产生氧的还原形式来摧毁入侵的微生物或寄生虫。

昆虫表皮通过其中的蛋白与醌反应完成鞣化，使表皮变硬并且获得高度的柔韧性与稳定性。

昆虫中最常见的鞣化是醌鞣化，其中包括O-醌与表皮蛋白的自由氨基成键结合，另一种为β-鞣化，即蛋白与醌在支链β-碳原子上交联。

这两种鞣化剂的前体都是N-乙酰多巴胺（NADA）。

NADA是昆虫醌鞣化过程中（包括卵壳硬化和表皮硬化）普遍存在的鞣化剂，而酪氨酸经酚氧化酶、多巴脱羧酶和乙酰基转移酶作用形成NADA，这是NADA产生的重要途径之一。

在昆虫表皮鞣化过程中，酚氧化酶的存在是必不可少的。

当醌的前体——N-乙酰多巴胺在酚氧化酶作用下被氧化成N-乙酰多巴醌是，其反应性增高，因而易与蛋白质N 端氨基结合，生成淡色的邻苯二酚态蛋白质。

这蛋白质又因N-乙酰多巴醌被还原为N-乙酰多巴胺。

这样蛋白质N端的氨基与醌环结合起来形成壳硬蛋白。

赖氨酸残基的ε-NH2和SH等还可以醌环结合，也就是说，肽链不仅其末端氨基可以与醌环结合，而且肽链中间也可以与醌环直接结合。

在昆虫角质化的色黑而坚硬的表皮形成过程中，还存在醌环的重合和缩合。

另外，酪氨酸的代谢产物NADA由皮细胞分泌进入表皮后，同时与能利用的酰胺基或羟基相互作用。

如上所述，PO是昆虫表皮硬化和黑化过程中的关键性酶，与它紧密相关的醌鞣化作用在昆虫的生命过程中具有重要意义。

由于上述过程同时也是害虫形成防御体系的重要反应，因此酚氧化酶可能作为害虫控制中的一个作用靶标，可通过抑制昆虫酚氧化酶的活力，使害虫丧失防御能力从而间接达到合理控制虫害的目的。

酚氧化酶抑制剂有可能成为继几丁质抑制剂之后一类新的对环境友好的害虫抑制剂。

由于酚氧化酶具有重要的理论意义和发展前景，大量的研究工作集中在此领域，目的在于寻找对酚氧化酶具有活性的抑制剂，并对其抑制动力学和抑制机理进行研究。

因为蘑菇酚氧化酶已有成功的分离纯化产物且性质稳定，所以多以蘑菇酶为研究对象。

虽然该酶与来自昆虫的同类酶系有不同之处，但作为基础研究仍具有重要意义。

从当前的研究资料来看，对酚氧化酶有抑制作用的化合物有多种类型，其中以酮醇和取代苯酸类化合物较多。

抑制类型与酶源、底物和抑制剂种类有关。

例如，以L-多巴为底物，蛇葡萄素对酚氧化酶为竞争性抑制；以L-酪氨酸类似物与L –酪按酸为底物，对羟基苯甲酸对酚氧化酶为竞争性抑制；以邻苯二酚为底物，硫脲对酚氧化酶为非竞争性抑制；以L-酪氨酸为底物，银杏叶提取对酚氧化酶为非竞争性抑制；以L-多巴为底物，苦参碱、芦荟素和肉桂酸则属于混合型抑制。

近些年来，从植物中分离对酚氧化酶具有抑制活性的天然化合物已得到人们关注，当前，酚氧化酶抑制剂的大量研究工作集中于这些天化合物。

植物中存在的鼠鞠草素、对羟基苯甲酸、槲皮素、山奈素、芦丁、曲酸、枯醛、枯酸、杨梅黄素和蛇葡萄素等都可以作为酚氧化酶的抑制剂，另据报道，放多中药的提取成分对酚氧化酶有抑制作用，抑制作用较强的有茯苓、白鲜皮、芦荟、橘梗、当归和熟地黄等。

酚氧化酶抑制剂对该酶抑制的机理可能有以下几种：1作为酚氧化酶的竞争性底物，抑制酚氧化酶的活力。

酚氧化酶活性中心的环境是疏水的，与氧化态酶中双氧结合的质子来源于酪氨酸和多巴等底物分子中的羟基，因此氨酸和多巴等底物与氧化态酶必须以酸的形式结合。

含羟基的芳环化合物对格氨酸酶的作用机理与酪氨酸和多巴的作用相似，通过与酪氨酸和多巴竞争氧化态酶和铜离子态，把一部分酚氧化酶从催化反应循环中带走，降低酚氧化酶在反应体系中的浓度，从而抑制该酶的活力，在其他条件不变的情况下，它的抑制作用随pH的增大而减弱。

曲酸、氢醌、黄芹素诱导体等都属于这种抑制剂，主要通过作为竞争性底物来抑制酶活性。

2结合酶活性中心周围的基团，在活性中心周围形成空间位阻，阻止底物与酶活性中心作用。

醛类化合物对异丙基苯甲醛和Melanoxazal通过羟基与酶活性中心周围的亲核基团如—SH、—NH2、—OH结合，生成的产物在酚氧化酶的疏水性环境中能稳定存在，并在活性中心周围形成空间位阻，阻止底物与酶活性中心作用。

3结合酶中的铜离子，使铜离子失去对氧的结合能力，从而抑制酚氧化酶的活力。

酚氧化酶是一种含铜酶，铜离子是构成酚氧化酶催化氧化反应活性中心的重要因子，是维持酚氧化酶活性的重要保证，因此铜的螯合剂能够特异性地抑制酚氧化酶的活性。

如苯硫脲、二乙基二硫代氨基甲酸钠、和托酚酮等均可被用来作为PO的特异性抑制剂。

另外，黄酮醇、高良姜精、四羟基黄酮和槲皮素等也是与该类氧化酶中的铜离子进行螯合而产生抑制作用。

4阻止酚氧化酶中氧原子与芳环的取代反应，抑制酶活力。

在芳香酸中带有羧基的化合物，如苯甲酸对氧化态酶的作用机理与酪氨酸和多巴有所不同，因为羧基是强吸电子基，它抑制了氧化态酶中的氧原子与芳环的取代反应，于是氧化态酶与之形成的化合物成了终端化合物，从而降低了催化反应循环过程中的酚氧化酶浓度。

5作为氧化剂，拮抗氧对酚氧化酶的激活。

银杏叶提取物及时清除了过氧自由苦，从而终止了自由基链的引发，减弱了酚氧化酶的作用。

6去除自由基，终止自由基链的引，抑制酚氧化酶的活力。

过氧负离子、氢氧基和氧原子自由基等可以作为酚氧化酶活性中心的桥联配体，与酚氧化酶的活性有密切关系，有些植物提取物如银杏中含有效的天然自由基清除刘，同时可参与调节和提高超氧化物岐化酶（SOD）等搞氧化酶的活力，因此可以降低酚氧化酶的活性。

酚氧化酶抑制剂在害虫控制领域的前景由于传统农药固有的缺点，加之不合理的使用和研发工作的滞后，传统农药的负面影响逐渐暴露出来，已经引起了从们的高度关注，如“三R”，即残留、抗性、再猖獗等现象。

面对此情况，们们逐渐转变新农药研发思路，制订新的防治策略，探索新的防治途径，其中之一就是寻找新型的环境友好有害生物控制剂。

研究开发新杀虫剂的途径一般有四条，即：1、随机筛选；2、类推合成；3、天然产物模型；4、生物合理设计。

生物合理设计是一个诱人的领域。

对杀虫剂研发而言，其理论基础即昆虫生物化学，即以靶标生物体生命过程中某个关键的生理生化作用机制作为研究模型，人为地设计合成干扰此作用机制的化合物，从中筛选出先导化合物，然后进行结构优化开发。

大多数农药都是与某种特定的酶或者受体结合，发生化学反应而表现活性作用的。

酶在正常条件下有很强的催化活性，当特定的外源分子与酶结合发生作用时，酶很容易被抑制，使其活力下降甚至完全变性失活，所以我们可以针对特定的酶研究开发能影响酶活性的抑制剂作为害虫的控制剂。

鉴于酚氧化酶在害虫的生长发育过程中的重要作用，故有可能作为害虫控制中的一个重要作用靶标，寻找有效的抑制剂，通过抑制害虫体内酚氧化酶的活力，使其丧失防御能力从而间接达到合理的控制害虫的目的。