水蛭制剂中次黄嘌呤含量测定方法的建立与验证
YL-60050水蛭原料检验操作规程
检验操作规程
标准曲线含量公式： ()%100×1A ×A ×C 水分样对样对-⨯=M n 矿物类含量计算公式： 5.004×（B-A ）×稀释倍数×C 样 含量%= ×100% m ×1000×（1-水分） 【含量测定】 本品每1g 含抗凝血酶活性水蛭应不低于16.0U ；蚂蟥、柳叶蚂蟥应不低于3.0U 。
仪器与试剂：分析天平、离心机、数显恒温水浴锅、氯化钠等。
方法：取本品粉末（过三号筛）约1g ，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml ，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl ，置试管（8mm ×38mm ）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1]（临用配制）200μl ，摇匀，置水浴中（37℃±0.5℃）温浸5分钟，滴加每1ml 中含40单位的凝血酶溶液[注2]（每1分钟滴加1次，每次5μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（水蛭）或滴加每1ml 中含10单位的凝血酶溶液[注2]（每4分钟滴加1次，每次2μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（蚂蟥、柳叶蚂蟥），记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算： U=（C 1V 1/C 2V 2） 式中 U -- 每1g 含凝血酶活性单位，U/g ； C 1 -- 凝血酶溶液的浓度，μ/ml ； C 2 -- 供试品溶液的浓度，g/ml ； V 1 -- 消耗凝血酶溶液的体积，μl ； V 2 -- 供试品溶液的加入量，μl 。
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
219391866_水蛭真伪鉴定和质量评价方法研究进展
真伪鉴别ꎮ刘杰等[９]通过ＰＣＲ和微芯片电泳检测的方法可以同步鉴别３个品种水蛭的人为预混样品ꎬ且不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象ꎬ鉴别结果准确ꎮ除水蛭生药和粉末采用上述方法外ꎬ含水蛭的中成药的鉴别也多采用此法ꎬ朱晓枭等[１０]基于ＣＯＩ基因序列ꎬ分别设计了针对宽体金线蛭和日本医蛭的特异性引物ꎬ用于特异性鉴别脑心通胶囊中水蛭的有效成分及质量监测ꎮ另外ꎬ刘晓帆等[１１]基于ＣＯＩ序列ꎬ通过邻接法所构建的系统聚类树图发现同属序列聚在一起ꎬ水蛭的正品来源宽体金线蛭㊁日本医蛭形成一个独立的支ꎬ支持率近１００％ꎬ其他伪品聚集为独立的一支ꎬ说明水蛭的正品来源与其伪品能够明显区分开ꎮ１.４㊀蛋白质电泳法鉴别㊀蛋白质电泳鉴别技术是依据中药中所含蛋白质分子的大小㊁形状或所带电荷差异ꎬ采用电泳分离来鉴别中药的方法[１２]ꎮ十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)是胶体电泳的一种ꎬ其将蛋白质溶液与ＳＤＳ混合ꎬＳＤＳ为界面活性剂ꎬ会破坏蛋白质的二级结构使其变性并包覆变性蛋白质ꎬ使其带有一致的负电荷和一致的形状ꎬ故蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量ꎬ而与所带电荷和分子形状无关[１３]ꎮ水蛭主要成分为大分子化合物如蛋白质ꎬ其次还含有氨基酸㊁喋啶类㊁类以及脂肪酸类成分等[１４]ꎮ不同品种或不同生长环境的水蛭其蛋白质组成及含量上有所差异ꎬ基于此ꎬ汪波等[１５]采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对我国７种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析ꎬ结果表明ＳＤＳ－ＰＡＧＥ能初步反映不同种类㊁不同食性水蛭组织细胞可溶性蛋白质的表达差异ꎬ可用于不同品种水蛭的鉴别ꎮ１.５㊀毛细管电泳法㊀刘兴国等[１６]采用高效毛细管电泳法对宽体金线蛭和混淆品菲牛蛭进行蛋白㊁多肽的分析ꎬ发现宽体金线蛭与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异ꎬ且重复性良好ꎮ２ 质量评价目前ꎬ对于水蛭的质量评价除常规的水分㊁总灰分㊁酸不溶性灰分检测以外ꎬ还包括其特异性的质量评价手段ꎬ如抗凝血酶活性测定以及针对水蛭中蛋白质类㊁核苷类㊁多胺类㊁挥发性成分等不同化学成分的定性定量评价ꎮ２.１㊀生物检定技术㊀水蛭中含有多种抗凝剂ꎬ据研究报道水蛭素已经广泛用于脑血栓㊁冠心病㊁脑水肿[１７]㊁糖尿病[１８]等的治疗ꎬ已发现且可直接作用于凝血系统的成分主要有水蛭素㊁吻蛭素㊁类肝素㊁组胺等[１４]ꎮ因此ꎬ抗凝血活性是水蛭的主要活性ꎬ也是«中国药典»[１]中评价水蛭质量的主要方法ꎬ其检测方法为生物活性测定法ꎬ该方法用于中药质量控制ꎬ可以反映中药的整体或者主要的药理作用ꎬ与单纯控制指标性成分有较大的进步ꎮ除药典方法外ꎬ多位学者还创新了一些新的水蛭抗凝血酶评价方法ꎬ如苏斌等[１９]建立了一种基于用血液凝固分析仪测定纤维蛋白原－凝血酶时间的水蛭生物活性测定方法(Ｆｉｂｇ－ＴＴ法)ꎬ其就基源为蚂蟥和日本医蛭分别建立了反应体系ꎬ用生物检定统计法测定供试品的效价ꎬ结果表明蚂蟥和日本医蛭标准品的效价分别为５６５０Ｕ ｇ－１和４１３０Ｕ ｇ－１ꎬ当两者浸提液的一定浓度范围时ꎬ对数凝固时间与浓度线性较好ꎬ准确度和中间精密度均良好ꎬ证明Ｆｉｂｇ－ＴＴ法能区分和量化不同批次水蛭的效价ꎮ金家金等[２０]将不同浓度的水蛭浸提液加入富血小板血浆和乏血小板血浆中ꎬ结果显示水蛭能增加血小板聚集率ꎬ对凝血酶原时间未见显著性的影响ꎬ能显著延长活化部分凝血酶时间和纤维蛋白原－凝血酶时间ꎬ在一定的浓度范围内ꎬ水蛭浸提液浓度与纤维蛋白原－凝血酶时间的对数凝固时间呈现较好的线性关系ꎬ证明了Ｆｉｂｇ－ＴＴ和活化部分凝血酶时间(ＡＰＴＴ)反应体系可以用于水蛭体外生物活性测定ꎮ肖凌等[２１]将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定ꎬ探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法ꎬ结果表明４种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似ꎬ突跃范围呈平行关系ꎬ上述特点符合生物检定的要求ꎬ以肝素钠作为标准品ꎬ采用生物检定技术活性部分ＡＰＴＴ测定水蛭等的抗凝活性是可行的ꎬ证明了活化部分ＡＰＴＴ可以全面反映水蛭的抗凝血作用ꎬ测定结果对临床使用更具指导意义ꎮ２.２㊀ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法㊀水蛭不仅存在品种的差异ꎬ不同的炮制方法对其药物质量也有一定的影响ꎮ国家和地方炮制规范对水蛭烫制工艺的温度㊁时间㊁滑石粉用量㊁翻炒速度等关键参数均无统一规定ꎬ大多凭主观经验评价ꎬ从而影响了炮制品质量ꎮ现代研究发现炮制方法不同ꎬ水蛭炮制前后的水溶性蛋白存在一定差异ꎮ马莉等[２２]采用双向电泳分析水蛭酒炙前后差异蛋白表达ꎬ结果发现直接裂解液法所得条带数量最多ꎬ分布连贯清晰ꎻ水蛭酒炙前后蛋白含有量有显著性差异ꎬ所以双向电泳所得差异蛋白可作为蛋白标志物ꎬ以规范水蛭炮制工艺ꎬ并确保其稳定性ꎮ２.３㊀ＨＰＬＣ法㊀高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法ꎬ注入的供试品由流动相带入柱内ꎬ各组分在柱内被分离ꎬ并依次进入检测器ꎬ由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号ꎬ具有灵敏度高㊁重复性好㊁易于标准化等优点ꎮ多位学者尝试建立了用于水蛭化学成分分析的ＨＰＬＣ方法[２３－２５] (见表２)ꎬ以期更好地对水蛭进行质量评价ꎮ此外ꎬＨＰＬＣ还可以与质谱联检测器用(ＨＰＬＣ－ＭＳ)ꎬＨＰＬＣ－ＭＳ可综合ＨＰＬＣ与ＭＳ的优势于一体ꎬ实现对目标样品的多成分准确鉴别ꎮ如朱晓枭等[２６]利用ＨＰＬＣ－ＭＳ技术研究脑心通胶囊中的蛋白质ꎬ其基于超高分辨质谱技术及蛋白质组学的方法用于脑心通胶囊中３种动物药的蛋白质分析ꎬ此研究弥补了脑心通胶囊中蛋白类成分研究的空白ꎬ实现了对于脑心通胶囊中多种成分的准确鉴别ꎮ２.４㊀ＩＲ法㊀ＩＲ技术具有快速㊁无损㊁无污染以及可视化等优点ꎬ可有效反应药材组织上的官能团信息ꎮ李彦希等[２７]基于红外光谱法结合化学计量学进一步对光谱数据进行分析ꎬ结果水蛭与美洲大蠊㊁全蝎的红外指纹图谱有差异ꎬ３种虫类药材在１８００~１７００ｃｍ－１处峰形差异明显较大ꎬ二阶导数产地特征峰差异明显ꎬ说明ＩＲ技术可用于鉴别水蛭及其混淆品ꎬ可作为水蛭质量评价方法之一ꎮ表２㊀ＨＰＬＣ检测水蛭中的化学成分检测方法目标成分色谱柱流动相波长/ｎｍ柱温/ħ流速/ｍＬ ｍｉｎ－１参考文献ＨＰＬＣ－ＶＷＤ腐胺ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８(４.６ｍｍˑ２００ｍｍꎬ５μｍ)甲醇－水(５８ʒ４２)２３０１０~３０１[２３]ＨＰＬＣ－ＶＷＤ水蛭甲素㊁水蛭乙素㊁水蛭丙素ＫｒｏｍｓａｉｌＣ１８(４.６ｍｍˑ２００ｍｍꎬ５μｍ)甲醇－０.０５％三氟乙酸水(２０ʒ８０)３５４３０１[２４]ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ尿嘧啶㊁次黄嘌呤㊁黄嘌呤㊁尿苷㊁水蛭胺Ｃ㊁水蛭胺Ａ㊁水蛭胺ＢＹＭＣ－ＰａｃｋＯＤＳ－ＡＱ(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ＫＨ２ＰＯ４溶液(１０ｍｍｏｌ Ｌ－１):乙腈ꎻ梯度洗脱２５４３００.８[２５]２.５㊀ＧＣ－ＭＳ法㊀挥发性成分与抗凝血酶活性是水蛭的质量鉴别指标之一ꎬ挥发性成分的差异与种质及其生长环境密切相关ꎬ因此通过比较水蛭挥发性成分与抗凝血活性成分组成及含量差异可以从一定程度上反应药材的质量差异ꎮ黄荣清等[１７]应用ＧＣ－ＭＳ技术分析鉴别了水蛭提取物中有很强的抗凝血活性的１５个化合物ꎬ主要为不饱和脂肪酸甲酯以及甾体等ꎮ而刘君等[２８]采用ＧＣ－ＭＳ法分析了中药蚂蟥脂肪酸的组成ꎬ鉴别了１９个组分ꎬ其中不饱和脂肪酸占７１.８４％ꎬ饱和脂肪酸占２０.７１％ꎬ为水蛭鉴别提供了数据支撑ꎮ隋利强等[２９]通过ＳＰＭＥ－ＧＣ－ＭＳ分析探讨了炮制对水蛭挥发性成分的影响ꎬ结果从水蛭的挥发性成分中鉴别出４０种化合物ꎮ水蛭炮制前后挥发性成分含量差异明显ꎬ炮制过程中棕榈酸的含量降低ꎮ２.６㊀指纹图谱技术㊀指纹图谱技术可从整体上反应药材质量ꎬ避免了以单个或少数几个指标性成分为依据的中药质量评价略显片面的问题ꎬ在中药质量评价领域应用十分广泛ꎮ目前所建立的水蛭的指纹图谱主要分为ＨＰＬＣ指纹图谱和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ指纹图谱两类ꎮ产地㊁品种的差异均会导致水蛭基因表达的差异ꎬ进而导致化学成分的差异ꎬ最终形成不同的药材质量ꎮ指纹图谱技术即是以多批次药材的成分分析结果来评价药材质量的一致性或稳定性ꎬ而ＨＰＬＣ指纹图谱和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ指纹图谱的区别主要在于ꎬＨＰＬＣ指纹图谱是以小分子化合物为研究对象ꎬＳＤＳ－ＰＡＧＥ指纹图谱则是以蛋白质大分子为研究对象ꎮ现有水蛭指纹图谱信息见表３[３０－３４]ꎮ表３㊀水蛭指纹图谱信息方法研究对象结果参考文献ＨＰＬＣ不同产地１８批次水蛭的游离氨基酸确定２５个共有峰ꎬ指认了１６个氨基酸ꎬ药材相似度均>０.９６０[３０]ＨＰＬＣ不同产地６批次水蛭仿生酶解有效部位确定８个共有峰[３１]ＨＰＬＣ不同产地１０批次水蛭及烫水蛭确定１１个共有峰ꎬ鉴别４个核苷类成分ꎬ药材相似度>０.８５[３２]ＨＰＬＣ不同产地１０批次水蛭确定１０个共有峰ꎬ鉴别了黄嘌呤和雌黄嘌呤ꎬ药材相似度０.６６９~０.９９４[３３]ＳＤＳ－ＰＡＧＥ山东不同产地１０批次水蛭确定１０个共有条带[３４]２.７㊀灰度关联质量评价模式㊀李峰等[３５]在对不同品种㊁不同规格的水蛭中多个成分(核苷类㊁多胺类㊁总多糖㊁总磷脂㊁蛋白质)和抗凝血酶活性测定的基础上ꎬ通过定义的相对关联度为测度ꎬ建立了灰关联度模型ꎬ用以评价水蛭质量ꎬ该评价模式全面客观ꎮ３㊀讨论与总结３.１㊀水蛭真伪鉴别方法研究现状㊀目前ꎬ水蛭的真伪鉴别方法主要性状鉴别㊁理化鉴别㊁分子鉴别㊁ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴别㊁毛细管电泳法鉴别等多种方法ꎮ性状鉴别中ꎬ不同品种水蛭在大小及各部位组织特征上有一定差异ꎬ可实现结构未被破坏生药的鉴别ꎬ但对于含水蛭的中成药中水蛭原料真伪无法鉴别ꎻ理化鉴别则以对照药材为依据进行鉴别ꎬ方法简便高效ꎻ分子鉴别主要以ＣＯＩ基因片段为研究对象ꎬ通过位点特异性ＰＣＲ或分子进化树等实现水蛭的鉴别ꎬ同时可用于水蛭粉末及其中成药的鉴别ꎬ方法准确性最高ꎻ由于水蛭为动物药材ꎬ蛋白质信息丰富ꎬ因此ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴别法和毛细管电泳法鉴别也较为常用ꎬ且适用于不同品种ꎬ不同产地水蛭的鉴定ꎮ３.２㊀水蛭质量评价方法研究现状㊀水蛭的质量评价方法主要以生物检定技术㊁ＳＤＳ－ＰＡＧＥ㊁ＨＰＬＣ㊁ＧＣ－ＭＳ㊁ＩＲ㊁指纹图谱技术等为主ꎮ水蛭抗凝血活性显著ꎬ也是其临床应用的主要活性之一ꎬ因此采用生物检定技术对其抗凝血活性进行检测是评价水蛭的主要方式之一ꎮＳＤＳ－ＰＡＧＥ主要以水蛭中的蛋白质为评价对象ꎬ但该方法受到提取条件的影响较大ꎬ且多以定性评价为主ꎬ无法定量ꎻＨＰＬＣ多以水蛭中的胺类㊁核苷类和喋啶类成分为评价对象ꎬ而ＧＣ－ＭＳ则以水蛭中的脂肪酸㊁甾体为主要评价对象ꎬ对于目前尚未明确水蛭药效物质基础的情况下ꎬ指标性成分的选择对质量评价的实际意义具有局限性ꎻＩＲ和指纹图谱技术则是从整体上评价水蛭质量的常用方法ꎬ目前指纹图谱仍以ＨＰＬＣ和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测技术为主ꎮ此外ꎬ灰关联度模式在动物类药材质量评价中也有较广泛应用ꎬ且具有指标丰富ꎬ评价客观等优点ꎮ可见ꎬ目前对于水蛭的质量评价方法研究虽然较为广泛ꎬ但方法的适用性和实际价值还有待深入研究ꎬ目前以抗凝血酶活性评价的生物检定法和整体评价的指纹图谱技术具有较高实用价值ꎮ４㊀展望水蛭为临床常用动物药材之一ꎬ目前已经明确水蛭素是其主要抗凝血成分ꎬ但水蛭临床应用炮制品常需要滑石粉烫制ꎬ高温处理易导致水蛭素失活ꎬ可见水蛭活性成分并非仅包含以水蛭素为代表的蛋白质类成分ꎬ还包含其他活性成分ꎮ再者ꎬ水蛭除活血化瘀外的多种药效如抗肿瘤[３６－３７]㊁抗纤维化[３８]㊁抗糖尿病肾病[３９－４０]等亦可佐证ꎮ因此ꎬ对于水蛭的质量评价方法应充分考虑水蛭的多活性㊁多物质基础的特点ꎬ开发更加综合全面的质量评价方法ꎮ或者深入研究药效物质基础ꎬ从而建立针对物质基础的定性定量评价方法ꎮ而对于真伪鉴别方法而言ꎬ通过性状鉴别结合分子鉴别的手段基本可满足水蛭中药材和中成药的鉴定ꎬ但仍应向简便化㊁现场化应用的实际应用方向继续开发ꎮ参考文献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０２０年版(一部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０２０:２９８.[２]国家医疗保障局ꎬ人力资源和社会保障部.国家医保局人力资源社会保障部关于印发«国家基本医疗保险㊁工伤保险和生育保险药品目录»的通知(医保发 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２０２１年１２月期间中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院和北京市第二医院收治的中晚期大肝癌患者共７３例ꎮ其中肝动脉化疗栓塞术联合仑伐替尼联合微波消融治疗的患者３６例ꎬ为观察组ꎻＴＡＣＥ联合仑伐替尼治疗的患者３７例ꎬ为对照组ꎬ对比两组患者的近期疗效㊁无进展生存期㊁总生存率及并发症的发生情况ꎮ结果㊀观察组和对照组在４个月后的疾病有效缓解率分别为７２.２％㊁４０.５％ꎬ具有显著性差异(Ｐ<０.０５)ꎮ观察组的中位无进展生存期为１８个月ꎬ对照组的中位无进展生存期为１０个月ꎬ两组差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎮ观察组的６㊁１２㊁１８㊁２４㊁３６个月的总生存率分别为９７.２％㊁８２.７％㊁７０.１％㊁５４.１％㊁２２.３％ꎬ对照组的６㊁１２㊁１８㊁２４㊁３６个月总生存率分别为９４.６％㊁６６.９％㊁３５.４％㊁３２.２％㊁９.７％ꎮ观察组总生存率明显高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ两组术后并发症发生率差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ结论㊀肝动脉化疗栓塞术联合仑伐替尼联合微波消融治疗中晚期大肝癌ꎬ可强化疗效并有效延长患者的生存时间ꎮ关键词:肝癌ꎻ肝动脉化疗栓塞术ꎻ仑伐替尼ꎻ微波消融中图分类号:Ｒ９３５.７㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)０５－０３４５－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.０５.０１１ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＴＡＣＥｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｅｎｖａｔｉｎｉｂｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＭＷＡｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｄｖａｎｃｅｄｌａｒｇｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＺＨＯＵＸｕｅｔａｏ１ꎬＪＩＡＮＧＷｅｎｈａｏ１ꎬＨＡＮＹｕｅ２ꎬＦＥＮＧＷｅｉｊｉｎｇ１ꎬＺＥＮＧＷｅｉ１ꎬＣＨＥＮＣｈｅｎ１(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｕｒｇｅｒｙꎬＢｅｉｊｉｎｇＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００３１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌꎬＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００２１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒａｒｔｅｒｉａｌｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ(ＴＡＣＥ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｅｎｖａｔｉｎｉｂａｎｄｍｉｃｒｏｗａｖｅａｂｌａｔｉｏｎ(ＭＷＡ)ｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｄｖａｎｃｅｄｌａｒｇｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｓｅｌｅｃｔ７３ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｖａｎｃｅｄｌａｒｇｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａａｄｍｉｔｔｅｄｔｏｔｈｅＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡ￣ｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄｔｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇｆｒｏｍＪａｎｕａｒｙ２０１８ｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ２０２１.３６ｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｔｒｅａ￣ｔｅｄｗｉｔｈＴＡＣＥｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｅｎｖａｔｉｎｉｂａｎｄＭＷＡꎬｗｅｒｅｓｅｔａｓｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｇｒｏｕｐꎻ３７ｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＴＡＣＥｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｅｎｖａｔｉｎｉｂｗｅｒｅｓｅｔａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍｅｆｆｉｃａｃｙꎬｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌꎬｔｏｔａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｒｅｍｉｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｈｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ４ｍｏｎｔｈｓｗｅｒｅ７２.２％ａｎｄ４０.５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｍｅｄｉａｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌｗａｓ１８ｍｏｎｔｈｓｉｎｔｈｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄ１０ｍｏｎｔｈｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｔｏｔａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｓａｔ６ꎬ１２ꎬ１８ꎬ２４ａｎｄ３６ｍｏｎｔｈｓｉｎｔｈｅｏｂｓｅｒ￣ｖａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｅｒｅ９７.２％ꎬ８２.７％ꎬ７０.１％ꎬ５４.１％ａｎｄ２２.３％ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｓａｔ６ꎬ１２ꎬ１８ꎬ２４ａｎｄ３６ｍｏｎｔｈｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅ９４.６％ꎬ６６.９％ꎬ３５.４％ꎬ３２.２％ａｎｄ９.７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｔｏｔａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｔｈｅｏｂｓｅｒ￣ｖａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｉｎｃｉ￣ｄｅｎｃｅｏｆｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓ(Ｐ>０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴＡＣＥｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｅｎｖａｔｉｎｉｂｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＭＷＡｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｉｄｄｌｅａｎｄａｄｖａｎｃｅｄｌａｒｇｅｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｃａｎｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｅｆｆｅｃ￣ｔｉｖｅｌｙｐｒｏｌｏｎｇｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａꎻＴｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒａｒｔｅｒｉａｌｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎꎻＬｅｎｖａｔｉｎｉｂꎻＭｉｃｒｏｗａｖｅａｂｌａｔｉｏｎ㊀㊀原发性肝癌目前在我国肿瘤致死病因中排名第二ꎬ严重威胁着人民的生命健康[１]ꎮ肝癌患者早期无明显症状ꎬ发现时多已是中晚期ꎬ仅少数有手术机会[２]ꎮ肝癌患者的预后与肿瘤的大小密切相关ꎬ直径大于５ｃｍ的肝癌称为大肝癌ꎬ预后较差[３]ꎮ肝动脉化疗栓塞(ＴＡＣＥ)是我国中晚期肝癌患者的主要治疗方式之一[４]ꎮ仑伐替尼作为一种多靶点药物ꎬ能有效抑制肿瘤生长和病情进展ꎬ已被列为晚期肝癌的一线治疗用药ꎮ微波消融(ＭＷＡ)用于治疗肝癌ꎬ其有效性也被多次证实[５]ꎮ本研究旨在探究ＴＡＣＥ联合仑伐替尼联合ＭＷＡ对中晚期大肝癌的临床疗效及对患者生存时间的影响ꎮ１㊀资料与方法１.１㊀一般资料㊀选取２０１８年１月至２０２１年１２月中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院和北京市第二医院收治的中晚期大肝癌患者７３例ꎬ采用ＴＡＣＥ联合仑伐替尼联合ＭＷＡ治疗的患者３６例ꎬ为观察组ꎮ采用ＴＡＣＥ联合仑伐替尼治疗的患者３７例ꎬ为对照组ꎬ其中男４９例ꎬ女２４例ꎬ年龄４８~７９岁ꎮＡＦＰȡ４００ｎｇ ｍＬ－１者１９例ꎻ合并肝动脉－门静脉瘘者５例ꎻ肿瘤最大直径６~１１ｃｍꎻ患者肝功能Ｃｈｉｌｄ－ｐｕｇｈ分级Ａ级:５３例ꎬＢ级:２０例ꎮ两组一般资料比较ꎬ差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎬ具有可比性ꎮ本研究经我院伦理委员会批准ꎮ纳入标准:①经活检穿刺病理明确或者根据临床表现㊁ＡＦＰ结合影像学检查确诊ꎻ②直径大于５ｃｍꎻ③由于高龄㊁肝功能储备不足等非手术原因ꎬ不愿接受手术的ＣＮＬＣＩｂ和Ⅱａ期肝癌患者ꎻ④ＣＮＬＣⅡｂ㊁Ⅲａ和部分Ⅲｂ期肝癌患者ꎻ⑤患者签署知情同意书ꎮ排除标准:①合并严重肝肾功能不全及严重心㊁脑㊁肺疾病ꎻ②严重凝血功能障碍ꎻ③恶病质或器官功能衰竭者ꎻ④合并门静脉主干癌栓ꎻ⑤对仑伐替尼过敏ꎮ１.２㊀治疗方法㊀对照组行ＴＡＣＥ治疗ꎮＴＡＣＥ治疗方法:采用Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒ方法经股动脉穿刺插管并行肝动脉造影ꎬ明确肿瘤的位置㊁大小及血供ꎬ判断门静脉情况及有无动静脉瘘ꎮ选择合适的供血动脉灌注化疗药物ꎬ灌注完成后使用碘油栓塞供血动脉ꎮ对于合并动静脉瘘患者ꎬ先用明胶海绵颗粒填塞ꎬ再注入碘油ꎮＴＡＣＥ治疗的间隔时间为３~４周ꎬ直至碘油沉积完全或肿瘤供血动脉完全闭塞ꎮ仑伐替尼在治疗后７ｄ开始服用ꎬ体重ȡ６０ｋｇꎬ１２ｍｇꎬｑｄꎻ体重<６０ｋｇ患者８ｍｇꎬｑｄꎬ长期服用ꎮ观察组在ＴＡＣＥ治疗基础上联合ＭＷＡ:ＴＡＣＥ操作及给药方式同对照组ꎬＴＡＣＥ结束３~４周后行微波消融治疗ꎬ治疗前已行ＴＡＣＥ治疗１~３次ꎬ病程２~４月ꎮ微波消融治疗方法:术前给予镇静㊁镇痛药物ꎮ先行肝脏ＣＴ扫描ꎬ确定肿瘤位置㊁大小ꎬ根据定位选择适宜的穿刺点ꎬ明确进针的角度和深度ꎮ选择合适的微波参数ꎬ依次消融ꎮ在消融过程中ꎬ病灶直径<３ｃｍ者ꎬ行单个位点消融ꎬ使消融范围超出肿瘤边缘１ｃｍꎮ对于病灶直径在３~５ｃｍ者ꎬ设定２~３位点重叠消融ꎮ病灶直径>５ｃｍ者ꎬ行多位点重叠消融ꎬ使瘤体尽可能完全消融ꎮ仑伐替尼服用方法同前ꎮ１.３㊀疗效评价㊀随访时间６~３６个月ꎮ术后６个月内ꎬ每个月复查ＡＦＰ及腹部增强ＣＴ/ＭＲＩꎬ６个月后改为每３个月复查ＡＦＰ及腹部增强ＣＴ/ＭＲＩꎮ观察肿瘤变化及有无进展ꎬ记录两组的无进展生存期(ＰＦＳ)㊁总生存期(ＯＳ)ꎮ基于ｍＲＥＣＩＳＴ标准进行评价:①完全缓解(ＣＲ):动脉期所有病灶无强化ꎻ②部分缓解(ＰＲ):动脉期增强病灶的最长直径之和减少超过３０％ꎻ③病情稳定(ＳＤ):不符合ＰＲ或进展疾病ꎻ④疾病进展(ＰＤ):增强病灶的最长直径之和增加２０％以上ꎬ或出现新的疾病ꎻ⑤有效缓解(ＲＲ):ＣＲ＋ＰＲꎮ１.４㊀统计学方法㊀应用ＳＰＳＳ２３.０统计学软件ꎮ正态分布的计量资料ꎬ采用ｔ检验ꎻ非正态分布的计量资料ꎬ采用非参数检验ꎮ计数资料以率表示ꎬ采用卡方检验ꎮ生存资料建立Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存模型ꎬ采用Ｌｏｇ－ｒａｎｋ检验ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀近期疗效对比㊀接受治疗６个月ꎬ观察组患者ＣＲ１４例ꎬＰＲ１２例ꎬＳＤ６例ꎬＰＤ４例ꎬＣＲ＋ＰＲ７２.２％ꎮ对照组患者ＣＲ７例ꎬＰＲ８例ꎬＳＤ１３例ꎬＰＤ９例ꎬＣＲ＋ＰＲ４０.５％ꎮ两组差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎬ结果见表１ꎮ表１㊀两组患者治疗６个月后疗效对比[ｎ(％)]组别观察组(ｎ＝３６)对照组(ｎ＝３７)ｔ/χ２值Ｐ值ＣＲ１４(３８.８９)７(１８.９２)８.３８３０.００４ＰＲ１２(３３.３３)８(２１.６２)１.２５８０.２６２ＳＤ６(１６.６７)１３(３５.１４)１.２３７０.２６６ＰＤ４(１１.１１)９(２４.３２)２.１７６０.２２１ＣＲ＋ＰＲ２６(７２.２２)１５(４０.５４)７.３３７０.００７２.２㊀生存期对比㊀观察组中位ＰＦＳ１８个月ꎬ对照组中位ＰＦＳ１０个月ꎬ两组存在统计学差异(Ｐ<０.０５)ꎬ结果见图１ꎮ观察组的６㊁１２㊁１８㊁２４㊁３６个月的ＯＳ分别为９７.２％㊁８２.７％㊁７０.１％㊁５４.１％㊁２２.３％ꎮ对照组的６㊁１２㊁１８㊁２４㊁３６个月ＯＳ分别为９４.６％㊁６６.９％㊁３５.４％㊁３２.２％㊁９.７％ꎮ观察组ＯＳ明显高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ结果见图２ꎮ２.３㊀治疗后并发症对比㊀包括肝区疼痛㊁恶心呕吐㊁发热㊁肝功能异常㊁白细胞下降等ꎮ所有并发症经对症治疗后均可缓解ꎮ两组均未出现肝㊁肾功能衰竭㊁大出血及其他严重致死性并发症ꎮ两组术后并发症发生率无显著差异(Ｐ>０.０５)ꎬ结果见表２ꎮ３㊀讨论原发性肝癌患者中只有约３０％得到手术治疗[６]ꎬ肝癌体积大㊁多灶性病灶及严重肝硬化等是手术率低的原因ꎮ即使获得根治性切除ꎬ术后５年肿瘤复发㊁转移率高达５０％~７０％[７]ꎮ对不可切除肝癌的治疗ꎬＴＡＣＥ被公认为是首选的非手术治疗方法ꎬ但由于部分肝癌存在乏血供[８]㊁多动脉供血㊁栓塞治疗后肿瘤侧枝循环形成㊁以及肿瘤细胞对化疗药不敏感或者耐药等因素ꎬ导致ＴＡＣＥ治疗后病灶完全坏死率低ꎬ复发率高[９]ꎮ残存的癌细胞具有更强的增殖能力ꎬ甚至短时间可发生肝内转移或远处转移[１０]ꎮ经过多次ＴＡＣＥ治疗后导致肝萎缩和肝功能失代偿ꎬ加重病情ꎬ失去进一步治疗的机会[１１]ꎮ因此ꎬ如何去除残留物病变并阻止侧支循环的形成一直是关注的焦点ꎮ。
蚂蟥药材质量标准起草说明
蚂蟥药材质量标准起草说明蚂蟥药材质量标准起草说明【历史沿革】《中国药典》（1963年版一部、1977年版一部、1985年版一部、1990年版一部、1995年版一部、2000年版一部、2005年版一部、2010年版一部）收载“水蛭”来源之一，药用干燥全体。
水蛭始载于《神农本草经》，历代本草[1-4]及历版《中国药典》均有收载，药用全体。
【药材名称】本品为《中国药典》收载“水蛭”项下来源之一。
目前多为人工养殖，现制订其标准，将药材名称定为“蚂蟥”。
其他称谓马蛭、宽身金线蛭、宽身蚂蟥；蛭蝚、至掌、虮、蚑、马蜞、蜞、马蟥、马鳖、红蛭、水琪、蚂蟥蜞、黄蜞、水麻贴、沙塔干、肉钻子、蚂蟥[5-6]。
药材拉丁名WHITMANIA PIGRA WHITMAN【来源】本品经中国科学院昆明动物研究所鉴定为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman。
动物形态体略呈纺锤形，长一般60～130mm，宽13～20mm。
背面暗绿色，有5条纵行的黑色间杂淡黄色的斑纹，此黄色部分由各体节中间3环上的圆形斑点构成。
腹面两侧以及中间共有9条断续的黑色纵纹。
体分107环，节Ⅶ的背面可见4环，腹面仅有3环。
体中部完全体节各有5环。
眼5对，排列如医蛭型。
前吸盘小，口内有颚，颚上有两行钝的齿板。
雄性与雌性生殖孔分别位于节Ⅺ和Ⅻ的b5/b6环沟上，两孔相隔5环。
射精球细长，贮精囊不发达，常附于前者的下面。
阴茎囊相当粗大[7]。
产地及分布在我国广泛分布，吉林、辽宁、河北、内蒙古、宁夏、甘肃、陕西、山西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、湖北、贵州；国外仅见于日本[7]。
现多为人工养殖。
生态环境生长于水田、沟渠、湖沼中，取食螺类[7]。
药用部位《中国药典》（2010年版一部）收载“水蛭”药用部位为干燥全体。
采集加工本品夏、秋二季捕捉后，洗净，用沸水烫死，晒干或低温干燥[8]。
品种应用情况水蛭为传统中药，除配方用药外，目前以水蛭为主要原料的成药制剂“脉血康胶囊”、“活血通脉胶囊”、“疏血通注射液”等。
水蛭质量标准及检验操作规程
XXXXXXXXXX 有限公司原料质量标准及检验操作规程1品名：1.1中文名：水蛭1.2汉语拼音：Shuizhi2代码：3取样文件编号：4检验方法文件编号：5依据：《中国药典》（2020年版一部）6质量标准：7.1试药与试剂：乙醇、水蛭对照药材、环已烷、乙酸乙酯、盐酸、10% 硫酸乙醇溶液、0.9%氯化钠溶液、1ml中含40单位的凝血酶溶液、0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。
7.2仪器与用具：电子天平、超声波处理器、硅胶G薄层板、紫外光灯、烘箱、马福炉、离心机、水浴锅。
7.3性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。
7.4鉴别：取本品粉末1g,加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。
另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各5卩」分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯（4: 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。
7.5检查：7.5.1水分：不得过18.0% （附录15第二法）。
7.5.2总灰分：不得过10.0% （附录17）。
7.5.3酸不溶性灰分：不得过2.0% （附录17）。
7.5.4酸碱度：取本品粉末（过三号筛）约1g,加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液照pH值测定法（附录11）测定，应为4.5~6.5。
7.5.5重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录35原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过十万分之一；镉不得过百万分之一；砷不得过百万分之五；汞不得过百万分之一；7.5.6黄曲霉毒素照黄曲霉毒素测定法（附录50）测定。
取本品粉末约5g,紧密称定，加氯化钠3 g,照黄曲霉毒素测定法项下的供试品的制备方法，测定，计算，即得。
一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]
![一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cf5bb17ee418964bcf84b9d528ea81c758f52ebc.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710011208.7(22)申请日 2017.01.06(71)申请人 北京物资学院地址 101149 北京市通州区富河大街1号(72)发明人 陈静 沈丽 王超 (51)Int.Cl.G01N 21/33(2006.01)G01N 1/34(2006.01)(54)发明名称一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法(57)摘要本发明公开了一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，涉及一种次黄嘌呤的检测方法。
本发明的方法简单，完成速度快，设计合理，准确度高，数据参考性强，操作容易，无须特制实验仪器，即使用现有检测仪器就能达到检测目的，有利于大面积推广和使用。
本发明方法是取鱼肉制样品液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化样品液后用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
本发明用于判断鱼的新鲜度。
权利要求书1页 说明书6页CN 106855508 A 2017.06.16C N 106855508A1.一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于该检测方法是按下述步骤进行的：步骤一、取鱼肉研磨至泥状，离心取上清液，用过滤膜过滤后去除沉淀蛋白；步骤二、然后离心取上清液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化，再用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
2.根据权利要求1所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中取5g 鱼肉研磨。
3.根据权利要求2所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中所述去除沉淀蛋白是按下述步骤制备的：向用过滤膜过滤的滤液中加入0.1mL 10％(质量)三氯醋酸，搅拌混匀。
4.根据权利要求3所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤二中偶联催化是：向上清液中依次加入3mL的苯酚、3mL 4-氨基安替比林、3mL Tris-HCL缓冲液、3mL 叠氮钠和3mL辣根过氧化物酶，加100μL黄嘌呤氧化酶和10mL样品液，置于37℃的恒温水浴锅内保温8min，然后煮沸2min后加入1mL浓度为71.389mg/mL的Na 2CO 3溶液，放入冰水中冷却，用紫外分光光度计测量。
高效液相色谱测定水蛭药材次黄嘌呤的含量
样品： 宽体金钱蛭 （ 南宁市药材公司） 尖细金钱
蛭 （河北安国药材公司） 次黄 嘌呤对照品（ 中国药 表 １ 提取 方 法 比较 （ ＝３ Ｉ ） １
４ ３ 定量 设定程序仪器 自动进样 ， ． 分别吸取参照 物及供试品各 ｌｕ Ｏ Ｌ注入液相色谱 ， 采用面积归一化
寿命 ， 值得大力推广。
１ 仪 器
密称定 ， 置小 烧 杯 中加 ０ ９ 生 理盐 水 ５ ｍ ， 温 ．％ ０ Ｌ室
高效液相 色谱仪 （ 国惠普公 司 Ｈ １０ ） 紫 美 Ｐ ｌ０ ；
外 检 测 器 及 自 动 进 样 系 统 （ 国 惠 普 公 司 美
放置 ２ ｈ ４ 。提取方法２ 取约 １ ｍ长水蛭 ５ ， ： ｍ ｇ精密称 定 ， 小 烧 杯 中 加 ７ ％ 乙 醇 溶 液 ５ ｍ 室 温 放 置 置 ０ ０Ｌ
的 医药研 究越来 越 广 泛 ， 以水蛭 为 原料 的药 物 已广
品生物 制 品鉴定 所 批号 １０ ６ — ０４ ２含量 ９ ％ ４６ １ ２０ ０ ９
）
３ 色 谱条 件
色谱柱 ： Ｏ Ｂ Ｘ Ｅｌ ｓＸ Ｂ—Ｃ ８规格 ：． Ｚ Ｒ Ａ ｃｐｅ Ｄ ｉ １ ４６
×１０ｍ ； 动相 ： ５ ｍ 流 超纯 水 ； 速 ：．ｍＬ ｍｎ 检 测 流 １０ ／ ｉ； 器： 紫外检 测器 ； 测波 长 ：５ ｎ 柱温 ：０ Ｃ 检 ２４ ｍ； ３０
５ １ Ｄ） ４５ 。
置小烧杯 中加 ５ ｍ ０ Ｌ水 ， 超声 溶解 ２ｍ ｎ 将上述物 ０ ｉ， 质 匀浆 ， 离心 （００／ ｉ）０ ｎ取 上清液 用微 孔 滤 ３０ ｒｍｎ １ｍｉ，
水蛭质量标准及检验操作规程
XXXXXXXXXX有限公司原料质量标准及检验操作规程1 品名：1.1 中文名：水蛭1.2 汉语拼音：Shuizhi2 代码：3 取样文件编号：4 检验方法文件编号：5 依据：《中国药典》（2020年版一部）。
6 质量标准：7 检验操作规程：7.1 试药与试剂：乙醇、水蛭对照药材、环已烷、乙酸乙酯、盐酸、10%硫酸乙醇溶液、0.9%氯化钠溶液、1ml中含40单位的凝血酶溶液、0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。
7.2 仪器与用具：电子天平、超声波处理器、硅胶G薄层板、紫外光灯、烘箱、马福炉、离心机、水浴锅。
7.3 性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。
7.4 鉴别：取本品粉末1g，加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。
另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。
7.5检查：7.5.1水分：不得过18.0%（附录15第二法）。
7.5.2总灰分：不得过10.0%（附录17）。
7.5.3酸不溶性灰分：不得过2.0%（附录17）。
7.5.4酸碱度：取本品粉末（过三号筛）约1g，加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液照pH值测定法（附录11）测定，应为4.5～6.5。
7.5.5重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录35原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过十万分之一；镉不得过百万分之一；砷不得过百万分之五；汞不得过百万分之一；7.5.6黄曲霉毒素照黄曲霉毒素测定法（附录50）测定。
菲牛蛭的含量测定方法改进及检测中的注意事项
［ ２］ 杜义斌 ， 吴 洋， 段艳蕊 ， 等 ．骨疏 颗粒治 疗绝经后 骨质疏松 症ｆ 临床 观察 ［ Ｊ ］ ． 新 中医 ， ２ ０ １ ３ ， ４ ５ （ ８） ： ７ ６—７ ８ ．
［ ３ ］ 李冰 ， 杜义斌 ， 李黔云 ， 等． 骨疏 颗粒对 去卵巢雌性 大 鼠骨 质疏松
的影 响［ Ｊ ］ ． 云南中医学院学报 ， ２ ０ １ ４ ， ３ ７ （ ４ ） ： ９—１ ２ ． ［ ４］ 崔燎 ， 吴铁 ， 刘 晓青 。 等 ．人参 茎叶皂苷 与小剂量 雌激素联 合用药 防治去卵巢大 鼠骨丢失 ［ Ｊ ］ ． 药学学报 ， ２ ０ ０ ２ ， ０ ７： ５ ０ １— ５ ０ ５ ． ［ ５］ 刘钰瑜 ， 崔燎 ， 吴铁 ， 等 ．雌孕激 素合用 对去卵巢 大 鼠骨质 疏松 的 预防作 用［ Ｊ 】 ． 中国药理学通报 ， ２ ０ ０ ３ ， ｌ １ ： １ ３ ０ ３—１ ３ ０ ６ ． ［ ６ ］ 刘晓青 ， 崔燎 ， 吴铁 ， 等 ．人参 水煎剂 防治去卵巢 大 鼠骨 量丢失 的 骨形 态计量学 观察 ［ Ｊ ］ ． 中国骨质疏松杂志 ， ２ ０ ０ ３ ， ０ ４： ２ ７— ３ ０ ． ［ ７］ Ｇ ｒ ａ ｙ ， Ｆ ｌ ｙ ｒ ｒ ｍ Ｔ Ｃ ， Ｇ ｒ ａ ｙ Ｋ Ｍ， ｃ ｔ ａ １ ． １ ７一Ｂ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｏ ｌ ａ ｃ ｔ ｓ ｄ ｉ ｒ ｅ ｃ ｔ ｌ ｙ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ
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中图分类号 ：Ｒ １ ９７
文献标识码 ：Ａ
文章编号 ：１ ７ － ０５ （０ ８ － ６ ６０ ２５ ８ ２０ ）７ ０ ５ － ３ ６
水蛭为水蛭科动 物蚂 蝗或柳 叶蚂 蝗的干燥全体 ，具有破 血 ，逐瘀 ， 经的功能。其水针制剂具有活 血化瘀 、通经活络 通
ｌｍｉ Ｏ 量瓶 中，加适量水溶 解并定容至刻度 ， 得浓度为 ２ ０ ０ ｕ Ｉｌ Ｔ 的次黄 嘌呤储备 液。 １ ２ ． ２标准溶液 的制备 精密量取次黄 嘌呤 的储备液 ２ 、０ ５５ 、
Ａ 次黄嘌 呤对照 品图
４１ ． 标准 曲线的建立
取次黄 嘌呤对照 品 ２ ，精密称 定，置 ５ 容量瓶 中， ｍｇ ｍｌ 用水溶解并稀释 至刻度 ，作为储备液。精密量取该储备液 ２ 、 ５ ５ 、１０ ０ 、４ ０ 分别于 ５个 ２ 容量瓶中，均用水稀 ０ ０ 、２ ０ ０ ｕ１ ｍｌ 释 至刻度 ， ５ ０ ２ 、４ 、８ Ｉ１ 得 、１ 、 ０ ０ ０ Ｔ 次黄嘌 呤对照 品溶液， ｕ １ 精 密量取上述溶 液各 １ ｕ１ ０ 分别注入液相色谱仪 ， 记录色谱 图，
的作用 。 临床用于 急性期脑梗塞 。 次黄嘌呤是黄 嘌呤的氧化产
物 ，广泛 存在于动植物中，性质稳定 ，通过测其 含量来控制制
１０ ０ 、４ ０ｕ１ ０ 、２ ０ ０ 分别于 ５ ２ 容量瓶 中，均用水稀释 个 ｍｉ
剂 的质量 。本文采用反相高效液相色谱法（ ＇ Ｈ Ｌ ） Ｐ － Ｐ Ｃ 对水蛭 ￣ 水针制剂中次黄嘌呤含量进行检测 ，方法 方便 、快捷 ， 灵敏度
＿
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４方 法验 证
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Ｂ 水蛭制剂样品 图 以浓度 为横坐标 ，峰面积为纵坐标作 图，求得 ｒ 值及 线性 回归 方程 ：Ｙ ５ ． ９ ８８ ７（＝ ．９９ ）； ＝ ０９ ｘ＿． ５ ６ ｒ Ｏ ９ ９ 当次黄嘌呤的信噪 比为 ９ ３时，最低检测浓度为 ００ Ｉｌ ． ２ｕ Ｔ。 １
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临床用药 ・
２８ ７ 第 卷 ７ ＷｒＨｌＤｅ ０ 年 月 ５第 期 ｏ ｅｈｉｔ ０ ｌ ａ ｇ ｄ ｔ ｓ
水蛭制剂中次黄嘌呤含量测定方法的建立与验证
赵 洪英 ’ 赵 春 阳 。 赵春 燕 。
（ 黑龙江省牡 丹江灵泰 药业股份 有限公 司 １７１ ） １ ５０１ （ 黑龙江省牡 丹江医药技 工学校 ２ １７１ ） ５０３
配制低 、中、高浓度分别 为 １ ，２ ，４ ／ａ 的次黄嘌 ０ ０ ０ｇｇｈ
呤对照 品溶液 ，分别室温放置 ０ 、４ 、 １、２ ｈ 、２ 、８ ２ ４ ，供试 品
溶液配制后室温放 置 ０ 、 、８ ２ ４ ，精密量取不 同时 、２ ４ 、１、２ｈ
表
液在所 考察 ２ｈ内稳定。 ４
稳定性考察结果
・
临床用药
表 １ ６日内精密度考察结果 （ ６ ）
４３稳定性考察 ．
间的溶液 １ ａ 分别注入液相色谱仪 中， ０１１ 记录次黄嘌呤的峰面 积 ，结果见表 ２ ，低 、中浓度 的次黄嘌呤对照品溶液在 ４ ｈ内 稳 定，高浓度 的次黄嘌 呤对照品溶液在 １ｈ内稳定， ２ 供试 品溶
３色谱条件 Ａ ｉ ｎ１ ０ ｇｌ ｔ１０液相色谱仪：ｌｅｔｌ ＤＳ３ ｅ ｎｒ ｉ ｓ Ｏ ． 色谱柱 （ ５ｌ ａ ｍ， ４６ ． ｍｍ￣２ ０ ５ ｍｍ） ；检 测波长 ：２ ４ｍ； ５ ｎ 流速 ：０８ ／ ｎ ．ｍｌ ｍｉ
柱 温 ：２ ℃ ；进 样 量 １ ５ ０ｕ ；流 动 相 ：甲醇 ：０ ％醋 酸 水 ｌ ． ３
次黄嘌呤购于中国药品生物制 品检 定所 ：甲醇 由 Ｔ ＤＡ ＥＩ
公司提供 ，色谱纯；醋酸 由 Ｍｅｃ 司提供 ，色谱纯。 ｒｋ公
高效液相色谱仪为 Ａ ｉ ｎｌ ０Ｈ Ｉ ，配备紫外检测器 、 ｇｌ ｔ１ ０ Ｐ￣ ｅ
自动进样器 、柱温箱及四元梯度洗 脱泵 。
２试 祥 的制 备
２１对照品储备液 的制备 ．
ｇ ａ １ｇ ｍ ，每一浓度各 ３ ／ 、４ａ ／ ｌ ｈ 份，供 ９ ，结果见表 ３ 份 ，平 均 回收率为 １０ ％，Ｒ Ｄ小于 ２ ５ ０． ７ Ｓ ． ％。 ０
高。 １ 实验材料与仪器设备
并定容至刻度 ，得 ５ ０ ０ ０ ０ Ｉ１ 、１ 、２ 、４ 、８ ｕ Ｔ 次黄嘌呤系 １ 列浓度的对照品溶液 。 ２３供试 品溶液 的制备 取注射用疏血通，每瓶精密加入 ． ２ 水溶解 ，精 密量 取 ０ ｍｉ ２ 容量瓶 中，加水稀释 ｍｉ ． 至 ｍｉ ５ 至刻度 ， 充分混匀后， ０４ ｕｍ滤膜， 过 ．５ 作为供试品溶液 。
４ 精 密度考察 ， ２
配制低 、中、高浓度 分别 为 １ ，２ ，４ ｕｇＩｌ的次黄嘌 ０ ０ ０ ／１ Ｔ 呤对照品溶 液，分别于同 日内测定 ６次结果见表 １ ：
・６ ５６・
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２０ 年 ７月第 ５ 第 ７期 ０８ 卷
Ｗｏｌ Ｈ ａｈＤ ｇｓ ｒ ｅｌ ｉｅｔ ｄ ｔ
呤 ２０ ｍｇ，置于 ． ０ ，
ｌ
溶液 （ ：９ ） Ｐ Ｃ色谱 图见 图 １ １ ９ 。Ｈ Ｌ 。
■ ＇誊 毒 ｜ 誊 ＿ ： ＿
”
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鞋 口 毫
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｜ ｌ々 曩
｜－ ｜ § －
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｜ ＝； ＿
４ ． 样 回收 率 试 验 ４加
．
取同一批号的注射用疏血通 ，每 瓶精密加入 ２ ｌ ｍ 水溶解 ， 精密量取 ０ ｍ 至 ２ ｌ ． ｌ ｍ 容量瓶 中， ５ 加入适量 的次黄嘌呤储各液 ，
并用 水稀 释定 容，使对照 品加入量 分别 为， １ ａ ／ａ ２ ｕ ０ｌｇｈ 、 ０