RNAi的发展与应用_李婧-2007
RNAi技术在遗传学方面的研究进展
RNAi技术在遗传学方面的研究进展高利华 朱孟玲 (江苏农林职业技术学院 江苏句容 212400)R NA干扰(RN Ai)是最近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术 1。
RNA i是由双链R NA介导的,在转录后mRNA水平上关闭相应基因表达的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcrip tional gene silencing,PT G S)。
RNA i是生物体中存在的一种普遍现象,代表了一种古老的细胞反应通路。
RNA i作为一种新兴的基因阻断技术,在基因组基因功能研究、遗传病的基因治疗和蛋白质功能研究方面已显示出巨大的前景。
为此,RNA i被美国!Science∀和!N ature∀杂志评为2002年度最重要的科技成果之一。
RNA研究的重大突破性进展,是近20年来可以与HGP相提并论的最重大的成果之一。
1 研究历史与分子机制1.1 研究历史1990年,为加深矮牵牛花的紫色,Jorgensen等人导入了一个强启动子控制的色素基因,可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色,这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。
1995年,康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义R NA和正义RNA都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解。
到1998年,A ndrew F ire的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链R NA。
这些双链RNA是体外转录正义RN A时生成的,于是提出了R NAi 这个词。
2002年,Zernicka-Coetz等用双链RN A注射小鼠受精卵和着床前的胚胎,结果发现导入的双链RN A可以特异性地抑制C-mos、E-cadherin和GFP基因的表达。
Judy L ieberman和Pr emlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNA i技术治疗疾病的研究进展。
RNAi用于基因功能的鉴定和确证
鉴定基因的表达模式
总结词
通过rnai技术，可以鉴定基因在不同组织、发育阶段或环境条件下的表达模式，了解基因的表达水平 、表达丰度以及表达调控机制。
详细描述
rnai技术通过干扰特定基因的表达，观察细胞或生物体表型的变化，从而推断出该基因的表达模式。 例如，在某些组织中高表达的基因可能在其他组织中低表达或沉默，这有助于理解基因在不同生理过 程中的作用。
原理
当外源或内源的dsRNA被细胞内相应的核酸酶 切割成小片段（siRNA）后，这些siRNA与细 胞内的RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合， RISC通过碱基配对原则找到并降解对应的 mRNA，从而抑制相应基因的表达。
rnai技术的历史和发展
01 1998年，Fire等人发现dsRNA可以引发基 因沉默现象。
rnai技术的发展前景
新一代RNAi技术
随着技术的不断发展，新一代RNAi技术正 在开发中，旨在提高特异性、降低脱靶效应 并克服其他挑战。
体内应用拓展
随着药物输送系统和新型载体的发展，RNAi技术在 体内的应用前景正在不断拓展。
基因疗法和精准医疗
RNAi技术有望在基因疗法和精准医疗领域 发挥重要作用，为遗传性疾病、癌症和其他 疾病的治疗提供新的途径。
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鉴定基因的相互作用网络
总结词
rnai技术可用于鉴定基因之间的相互作用 网络，揭示基因之间的相互关系和调控 机制。
VS
详细描述
通过rnai技术，可以同时干扰多个基因的 表达，观察细胞或生物体表型的变化，从 而确定哪些基因与目标基因存在相互作用 关系。这些相互作用关系可以是有益的、 有害的或中性的，有助于深入了解基因的 功能和调控机制。
RNAi技术在医学领域的研究进展
RNAi技术在医学领域的研究进展【摘要】 rnai是利用内外源mrna沉默目标基因的现象，目前已经应用于临床疾病的治疗。
本文主要讲述rnai在病毒性、遗传性、肿瘤疾病治疗方面的应用，展现二十一世纪医学领域中治疗手段发展的新突破。
【关键词】 rnai 医学治疗rnai technology in the field of medicine research progress author: liangying lishufen yuantianyou【 abstract 】 use rnai is internal and external source mrna silence the target genes phenomenon, at present has been applied to clinical disease treatment. this article mainly described in viral, inherited, rnai tumor disease treatment application, show the 21 st century in the field of medical treatment of the development of new breakthrough.【 key words 】 rnai medical treatmentrnai（rna interference，rnai）即rna干涉，是生物体内普遍存在的一种生物学现象，是由双链rna（dsrna）参与指导的，在特定酶的参与下以外源和内源mrna为降解目标的转基因沉默现象。
在过去几十年里rnai一直是生物科学中的一个亮点，人们通过向有机体引入小片段干涉rna分子（small interfering rnas，sirnas）和发夹样rna分子（small hairpin rnas，shrnas）能够特异地降解目标mrna这一特性来探索基因功能。
RNA介导基因沉默的原理与应用
RNA介导基因沉默的原理与应用近年来，随着生命科学的快速发展，RNA介导基因沉默（RNAi）逐渐成为了研究基因表达和基因功能的重要工具。
RNAi 是一种基因调控机制，通过特定的RNA分子来沉默目标基因的表达，从而影响细胞功能和生理过程。
本文将介绍RNAi的原理、应用和前景，探讨RNAi对生命科学研究和药物研发的推动作用。
一、RNAi的原理RNAi是由两类RNA参与的过程：小RNA和大RNA。
小RNA长度约为20-30个核苷酸，可分为三类：小干扰RNA （siRNA）、微RNA（miRNA）和piwi互作RNA（piRNA）。
大RNA是双链RNA（dsRNA），长约为100个核苷酸以上。
RNAi的原理可以简单地描述为：dsRNA分子在细胞内被酶切成小RNA，其中siRNA包括主导链和亚主导链两个分子，主导链与RISC（RNA-诱导沉默复合体）结合形成RNAi诱导复合物（RISC-siRNA），该复合物寻找并结合到与siRNA序列互补的mRNA上，使得该mRNA被RISC产生的核酸酶切割从而被降解。
而miRNA与piRNA则主要参与调控基因表达和细胞发育。
同时，RNAi还可以通过RNA诱导DNA甲基化（RdDM）来抑制转座子的活性。
转座子是在基因组中活跃的遗传元件，可导致基因的突变和不稳定。
RNAi激活的DNA甲基转移酶和非编码RNA直接识别和甲基化特定的DNA序列，从而抑制转座子的活性。
二、RNAi的应用1. 基因沉默与基因功能研究RNAi可以通过靶向不同基因的siRNA进行基因沉默，从而研究该基因在细胞功能和生理过程中的作用。
在功能研究中，RNAi可以帮助鉴定新基因、解析基因网络、揭示细胞信号通路等。
2. 疾病治疗和药物研发RNAi在针对特定基因的治疗和药物研发中也发挥着重要作用。
例如，通过RNAi技术靶向癌症相关基因的siRNA可以选择性地抑制癌细胞的增殖和生存，从而实现治疗的目的。
此外，RNAi还可以加强药物的靶向性和安全性，成为新型药物研发的重要方向。
《RNAi技术及其应用》课件
发展前景
RNAi技术的进一步发展将促 进基础生物学和应用系统生 物学等领域的快速发展。
结论
1 巨大潜力的技术
RNAi技术具有广阔的应用前景，对生物医学、基因工程、农业和工业等领域都具有重要 意义。
2 推动生物学发展
RNAi技术的发展将推动基础生物学和应用系统生物学的快速进步，为未来的研究提供强 大工具。
2 缺点
RNAi技术在操作过程中存在一定的技术门槛，且由于siRNA的不稳定性，其应用仍面临 一定挑战。
RNAi技术的未来发展
技术发展趋势
RNAi技术将进一步完善，新 的技术和工具的发展将推动 其在基因研究和疾病治疗领 域的应用。
局限性和突破口
克服RNAi技术的局限性，如 siRNA的降解和靶向性，将 是未来研究的重点和突破口。
RNAi的历史和发展
RNAi于20世纪末被发现， 随后广泛应用于基因功能 研究及药物研发领域，并 获得了诺贝尔奖的认可。
RNAi的原理及其作用
通过介导RNA降解或抑制 转录过程，RNAi技术可以 有效地实现基因的特定沉 默，从而控制目标基因的 表达。
RNAi技术的应用
基因功能研究
RNAi技术被广泛运用于研究基 因的功能和调控机制，帮助科 学家揭示生物体内复杂的基因 网络。
《RNAi技术及其应用》 PPT课件
欢迎来到《RNAi技术及其应用》PPT课件，今天我将向大家介绍RNAi技术的 原理、应用以及未来发展。让我们一起探索这项有着广阔应用前景的技术。
RNAi技术简介
什么是RNAi？
RNA干扰(RNA interference)是一种基因沉 默的现象，通过退化目标 基因的RNA分子，从而抑 制特定基因的表达。
RNAI原理及应用
RNAI原理及应用RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种基因调控机制，其通过抑制特定基因的转录或翻译过程，实现对基因表达的调控。
RNAi机制首先通过特定的酶将特定基因的mRNA分解为小片段，然后这些小片段与RNA-诱导沉默复合物（RISC）结合，最终导致该基因的特异性沉默。
RNAi技术已经被广泛应用于生物学研究以及治疗疾病的实践中。
以下是RNAi原理和应用的详细解释：RNAi原理：1.RNAi的起源：RNAi最早是在植物系统中被发现的一种基因沉默调控机制，随后发现其在真核生物中也存在。
2. RNA干扰的具体机制：首先，特定的酶（Dicer）将外源双链RNA （dsRNA）或内源的小干扰RNA（siRNA）切割为21-23个核苷酸的小分子（miRNA）；然后，这些小分子与RISC结合，形成siRNA-RISC复合物；最后，这个复合物会识别并结合到目标mRNA上，以一种亚完美匹配的方式，引发mRNA的降解或抑制其翻译，从而达到对基因表达的调控。
RNAi应用：1.功能基因组学研究：RNAi可以帮助研究人和动物的基因功能，通过抑制目标基因的表达，可以观察基因敲除后生物体产生的表型改变。
这有助于揭示基因在生物体内的功能和作用机制。
2. 疾病治疗：RNAi技术在药物研发中有着广泛的应用潜力。
通过设计和合成siRNA，可以在细胞内选择性地抑制特定基因的表达，从而治疗一系列遗传病和感染病。
例如，在癌症治疗领域，可使用RNAi技术抑制癌细胞特定的致癌基因，达到治疗癌症的效果。
3.植物基因改良：RNAi技术可用于改良植物的抗感染性、抗虫性、耐盐碱性等性状。
通过抑制特定基因的表达，可以增加植物对胁迫的抵抗能力，提高作物的产量和质量。
4. 遗传治疗：通过将siRNA导入体内，可以干扰基因表达和调节细胞功能。
这种方法被广泛应用于基因治疗、基因靶向和克隆动物等领域。
总结：RNA干扰技术作为一种重要的基因调控方法，已经在生物学研究和治疗疾病的实践中得到广泛应用。
RNAi技术在神经系统疾病治疗中的应用前景
RNAi技术在神经系统疾病治疗中的应用前景随着科技的不断进步，人们对于神经系统疾病的治疗越来越关注。
而RNAi技术的出现则为神经系统疾病的治疗提供了新的思路和方法。
本文将着重探讨RNAi技术在神经系统疾病治疗中的应用前景。
一、RNAi技术的基本原理RNAi技术是指RNA干扰机制，即双链RNA通过RNA酶Dicer切割成小RNA，引发RNA诱导的基因沉默现象。
RNAi技术主要是通过特异性地破坏某些基因的mRNA分子，从而抑制其在细胞内的表达，达到治疗疾病的目的。
RNAi技术的主要步骤包括：构建RNA干扰载体、转染RNA干扰载体、siRNA的产生及作用。
二、RNAi技术在神经系统疾病治疗中的应用神经系统疾病是一类危害严重的疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、脊髓小胶质细胞瘤等。
这些疾病的治疗一直是医学研究的热点，RNAi技术的出现为这些疾病的治疗提供了新的思路。
1、帕金森病的治疗帕金森病是一种运动神经元退行性疾病，临床上以特有的三联症：静止性震颤、肌肉强直和运动迟缓为主要表现。
RNAi技术在帕金森病的治疗中的应用，主要是通过特异性的RNAi干扰技术，抑制某些基因的表达，达到治疗病情的目的。
一项研究表明，通过RNAi技术抑制TH基因的表达，可以减少帕金森病大鼠的运动神经元的退化，对治疗帕金森病有较好的疗效。
2、阿尔茨海默病的治疗阿尔茨海默病是一种较为常见的老年性疾病，临床表现主要是记忆力减退、认知障碍、行为异常等。
RNAi技术在阿尔茨海默病的治疗中的应用，主要是通过RNAi干扰技术，抑制某些基因的表达，发挥治疗作用。
研究表明，抑制β-淀粉样蛋白PPARγ基因的表达，可以延缓阿尔茨海默病的发病和进展。
这为RNAi技术的应用提供了新的思路和方法。
三、RNAi技术在神经系统疾病治疗中的局限性RNAi技术虽然对于神经系统疾病的治疗有较好的应用前景，但是其在应用过程中还存在着一些局限性。
主要体现在以下方面：1、转染效率低RNAi技术的最大问题在于困扰转染效率的问题。
rnai技术及其应用
rnai技术及其应用一、RNai技术简介RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于真核生物中的基因沉默机制。
通过特定的siRNA或miRNA靶向mRNA，使其降解或翻译受到抑制，从而达到基因沉默的效果。
这项技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，近年来被广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。
二、RNai技术在基础生物学研究中的应用1. 基因功能研究：通过靶向特定基因进行干扰，观察其对细胞或个体的影响，推断该基因在生物体内所扮演的角色。
2. 基因调控网络分析：利用RNAi技术对关键基因进行干扰，进而分析其对整个调控网络的影响，揭示调控网络中各个组成部分之间相互作用的规律。
3. 药物筛选：利用RNAi技术对大量候选药物进行筛选，鉴定出具有治疗潜力的药物，并为新药开发提供理论依据。
三、RNai技术在临床治疗中的应用1. 肿瘤治疗：RNAi技术可以靶向肿瘤细胞中的癌基因进行干扰，抑制其生长和扩散，从而达到治疗肿瘤的目的。
2. 病毒感染治疗：利用RNAi技术靶向病毒基因进行干扰，阻断其复制和传播，从而达到治疗感染性疾病的目的。
3. 遗传性疾病治疗：RNAi技术可以靶向患者体内异常表达或突变的基因进行干扰，纠正其表达水平或功能异常，从而达到治疗遗传性疾病的目的。
四、RNai技术在农业领域中的应用1. 作物抗逆性改良：利用RNAi技术对作物中与逆境响应相关的基因进行干扰，提高其抵抗逆境能力。
2. 生物防治：利用RNAi技术靶向害虫或致病微生物中关键基因进行干扰，实现对害虫或致病微生物的有效控制。
3. 品质改良：利用RNAi技术靶向作物中与品质相关的基因进行干扰，提高其营养价值和经济价值。
五、RNai技术的发展趋势1. 基于CRISPR-Cas9技术的RNAi：将RNAi技术与CRISPR-Cas9技术相结合，可以实现更精准、更高效的基因编辑和调控。
2. 微型RNA（miRNA）在RNAi中的应用：miRNA是一种短链非编码RNA，具有广泛的生物学功能。
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简要介绍了其机制和应用。
关键词:R N Ai;RN A;基因组免疫现象;生物医学中图分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1673-2197(2007)12-025-04RNAi(RNAi interference)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的[1]。
人工合成的siRNA(small interfering RNA)是长度为21~25核苷酸大小的小RNA分子,可以与RISC共同发挥作用,使沉默复合物识别靶目标。
在生物体中导入dsRNA,可引起体内同源基因特异性沉默,当病毒RNA侵入细胞后,RNAi就是机体监视系统的成员,可检测病毒信息,降解病毒核酸和蛋白,维持宿主基因组的稳定性,保护机体不受病毒侵犯[2]。
自从1998年Fire等[3]提出siRNA以来,几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。
RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的深入研究,为成功地应用RNAi研究与治疗病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病提供了理论基础。
[4]1历史1993年报道,将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中,希望使紫色加深,可是,非但没有加深紫色,反而成了白色。
当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能,称为/共抑制0。
1995年,康奈尔大学Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义RNA和正义RNA都阻断了基因表达,他们对这个结果百思不得其解[5]。
1998年,Andrew Fir e研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA,这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的,于是提出了RNAi这个词。
2002年,Zer2nicka-Co etz等首次在哺乳动物中发现RNA i[6]。
同年,Judy Lieberm an和Premlata Shan-kar报道了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展[7]。
研究发现,在出现共抑制现象的植物中有)25)一类25nt 的RNA ;加入果蝇胚胎溶解物的dsRNA 会断裂为21~25nt 的片断;内源性mRNA 在与导入dsRNA 的结合部位也被切割成21~25nt 的片断,为RNAi 机制的重要中间效应分子,命名为siRNA (small inter fering RNA)[8,9]。
2 生物进化许多真核生物中都发现了RNAi 现象,而在原核生物中却未发现,提示了RNAi 的进化地位,但是其在进化中是如何出现,如何保存下来,在生物体中的意义有多大,目前均没有明确,还需要更多研究来阐明。
[5]3 重要意义RNAi 受到追捧的原因主要有两方面:¹RN Ai 可以说是基因功能检验的试金石,利用RNAi 技术可以缩短对人类基因功能了解和认识的时间,在不久的将来有望将人类大部分基因的功能和作用全部弄清楚;º科研人员有望利用这种技术获得使致病基因失活的新型基因药物,而基因药物一直是生物技术界追捧的对象。
[10]4 RNAi 作用机制与特点4.1 机制模型[11-14]RNAi 发生过程大致为3阶段:¹起始阶段。
dsRNA 在细胞内Dicer 均匀切割成21~23nt 大小siRNA 。
dsRNA 可以是外源的,也可以是内源的。
siRNA 长短是种族特异的,5c 端是磷酸的,3c 端往往突出2个nt 。
º扩增阶段。
siRNA 与m RNA 靶向性结合,并作为引物,在RdRp 作用下再次形成dsR -NA ,dsRNA 又被Dicer 切割成siRNA ,新形成的siRNA 又可以进入下一轮循环而达到扩增目的。
»效应阶段。
siRNA 和内切核酸以及其它蛋白一起形成RISC (RNA -induced silencing com plex )。
RISC 的核酸部分起到靶向性作用,蛋白部分则起到降解mRNA 的作用[15]。
4.2 作用特点(1)21~23nt dsRNA 为降解靶基因的中介分子。
Phillip 等发现,501bpPr -dsRNA 、505bpPr -dsR -NA 在胚胎裂解物中孵育时,约15%生成了稳定存在的21~23nt RNA 片段,而且不要求有相应的mRNA 存在,这证实了小片段RNA 由长dsRNA 切割而来,而不是dsRNA 针对的靶基因mRNA 的产物。
进一步研究表明,21~23nt dsRNA7为降解靶图1[16]图2图3)26)基因的介质分子,决定切割位置。
(2)细胞RNAi装置具有饱和性。
Susan等发现,RNAi反应中特异性dsRNA到达一定浓度后不可再增加,而非特异性dsRNA浓度可以改变。
研究还发现,随着非特异性dsRNA浓度增加,特异阻抑反应逐渐减弱。
(3)RNA i作用广泛。
Fir e等在新小杆线虫中发现,dsRNA介导RNAi不仅在导入部位产生阻抑效应,而且可以跨越细胞界限弥散到其它腔道和组织,发挥阻抑作用。
(4)RNA i需要AT P参与。
Phillip等发现,当ATP水平由250L m ol降至10L m ol以下,加入外源性ATP,针对靶基因的dsRNA没有阻抑基因的表达,因此证明在体外RNAi是需要AT P合成的,外源性AT P不可取代。
进一步研究发现,在ATP合成缺失的裂解物中不能发生RNA i。
(5)RNAi过程不需蛋白辅助。
Phillip等用环己亚胺等合成拮抗剂,发现RNAi仍以正常效率作用,说明RNAi中不需合成蛋白辅助产生阻抑效应。
(6)RNAi作用的靶基因有一定的选择性。
An-drew等发现,保守基因更易产生RNA i效应,而且神经元细胞较其它类型细胞对RNAi不敏感。
参与精子运动的基因也很少能够发生RNAi效应。
[17]5应用进展5.1肿瘤抑制中的进展传统技术诱导的单个癌基因的阻断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的生长,也很难达到预期的治疗效果,而利用siRNA干涉技术能异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因过度表达,使基因保持静寂或休眠状态,且抑制效果互不干扰,从而有望达到抗肿瘤作用。
5.2拯救病毒或创造新病毒根据一些病毒的已知核酸序列,采用反向遗传学操作技术可以构建出/人为设计0的病毒,得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒,这给通过获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了全新的途径。
也可在生产疫苗时,将流行毒株与高产毒株进行基因重配,得到同时具有高产特性和流行毒株抗原性的重组毒株,以提高疫苗产量。
[18]5.3凋亡辅因子研究中的应用[19]人类flap内切核酸酶(FEN21)涉及DNA复制及修复,FEN21在DNA复制期间对于处理冈崎片段很重要,但是Parrish发现,编码线虫FEN21同系物的crn21,其蛋白产物作为CPS26PEndoG的辅因子,可以介导凋亡DNA片段化,而且其对凋亡的正常进行很重要[20]。
细胞死亡相关核酸酶(cell death2related nucleases,CRN21)定位于细胞核,利用CPS26的内切核酸酶活性、CRN21的5c23c外切核酸酶活性及其缺口依赖性、内切核酸酶活性, CRN21能结合并协同CPS26促进DNA逐步片段化。
用RNAi减少crn21的活性则会引起死亡细胞表型,这些表型类似于缺乏CPS26PEndoG的突变体所展示的表型。
研究者证实,CRN21能生理性结合CPS26,而CPS26PCRN21蛋白相互作用也能在体外刺激蛋白核酸酶活性。
这些结果表明,涉及DNA 复制和修复的CRN21也能作为凋亡核酸酶CPS26的辅因子。
5.4基因治疗针对有害基因序列设计dsRNA,将dsRNA导入生物体内,或让dsRNA在生物体内转录,利用dsRNA 引发其同源内源有害基因的mRNA序列的降解,从而可达到抑制该有害基因表达的目的,包括各种人类疾病,特别是肿瘤[21]和遗传病的相关基因。