液相色谱柱子使用及保养
液相色谱柱使用问题解析
液相色谱柱使用问题解析液相色谱柱使用疑难问题解析就液相色谱柱的安装，使用和维护知识，以及各种柱压、峰形和色谱柱寿命等问题前来提问，也欢迎液相色谱方面的高手前来交流切磋。
内容提纲：一、液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配2、溶剂的匹配转换3、新柱使用前的平衡和老化4、pH使用范围5、色谱柱的保存二、柱压问题1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除3、化学污染物引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除三、峰形问题1、峰后拖2、峰前延3、其他峰形问题四、保留时间问题1、保留时间的重现性2、保留时间漂移3、柱与柱之间的重现性4、批与批之间的重现性五、寿命问题六、其他疑难的色谱技术问题一.安装、启用和维护中重点注意事项色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。
如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。
另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。
1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。
上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。
接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2. 溶剂的匹配转换色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。
特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。
正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗注意：每个色谱柱使用之前都要阅读一下使用说明书;色谱柱维护保养是很重要的,关系到色谱柱的使用寿命和检测结果的准确性,所以任何人用过色谱柱之后,一定要对色谱柱进行保养,管理人员和使用者互相监督;总的原则是色谱柱要轻拿轻放,避免损坏填料；另外没有使用的情况下,一定要保证两端的堵头封好;对于具体的色谱柱,下面列出常用色谱柱维护保养的具体方法和注意事项,以便使用者参考;min缓慢升高到min不接检测器冲洗色谱柱30分钟后,将色谱柱与检测器连上,流速调为ml/min冲洗色谱柱60分钟,然后不断降低有机相的比例如80%、50%、10%甲醇或乙腈各冲洗至少30分钟;若色谱柱暂时不用,则将色谱柱保存在高比例有机相中如80%甲醇或乙腈,或者参考该色谱柱使用说明书中建议的溶剂中；色谱柱使用时应用与分析流动相相同比例的有机溶剂将缓冲盐溶液换成水冲洗色谱柱15分钟,然后再换成流动相进行样品分析;样品分析完后,色谱柱维护与保养方法：流动相中若含酸、碱、盐类物质,则要先用10%甲醇或乙腈冲洗,min的流速冲洗至少30min,再用80%甲醇或乙腈冲洗至少30min,柱子保存在80%甲醇或乙腈里具体问题具体分析,洗脱程序可以是梯度洗脱程序,注意如果最后色谱柱保存的是高有机相,第二天用之前一定要用高水相过渡一下,再换成流动相;如柱子长时间未用,则柱子保存在100%的甲醇或乙腈里;对于含有离子对试剂的流动相如庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠等,柱子应采用梯度洗脱,一般用乙腈-水系统水：90-10；乙腈：10-90冲洗时间要稍长些,然后保存于90%乙腈;需要特别强调的是,目前所有的C18柱均不能用纯水进行长时间1小时以上冲洗,除非有专门耐水的专用柱,否则,用纯水长时间冲洗色谱柱,会导致色谱柱的固定相流失和相塌陷,损坏色谱柱;大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~8,有的pH稳定范围会宽,具体pH稳定范围参照色谱柱说明书,当分析条件的pH值偏小或偏大时,可选择pH稳定范围宽的柱子进行分析,否则,会损坏色谱柱;在每次进行样品分析时,要保证流动相包括盐、缓冲盐、酸等与色谱系统及柱内的保存液要互溶,如不能互溶,则需要用一定比例的有机溶剂不低于10%或与分析流动相相当的有机溶剂对柱子进行过渡,否则,流动相中的盐会在系统与柱内析出,影响样品分析或损坏柱子;硅胶柱、正相手性色谱柱包括AS-H、AD-H、OD-H系列,5DMB、5TBB系列,OA 系列如OA-3100、OA-3300对于未启用的新的色谱柱,在保证系统是正相的情况下,可先用异丙醇小流速流速为~min冲洗色谱柱约15分钟,然后换上正相流动相平衡进行色谱分析;硅胶柱及正相手性柱不能过水相对于sepax系列的硅胶柱,可以过低比例的水相有机相不低于50%,接上色谱柱之前要保证液相色谱系统中的所有管路为正相流动相如是不含盐的反相溶液如水/乙腈；水/甲醇,先用异丙醇冲洗所有管路,然后用正相流动相冲洗所有管路,最后再接上色谱柱；若反相流动相中含有缓冲盐如缓冲盐/乙腈；缓冲盐/甲醇,先用纯水冲洗HPLC系统,然后用异丙醇冲洗所有管路,最后用正相流动相冲洗,再接上色谱柱;使用结束后,先用异丙醇冲洗色谱系统与色谱柱,再用色谱级的正己烷冲洗色谱柱,或者直接用正己烷－异丙醇90：10冲洗,并保存在正己烷－异丙醇90：10中;如长时间未用,则保存在正己烷中;需要特别强调的是,冲洗硅胶柱时,不能用纯水或含水的有机溶剂或缓冲盐体系冲洗色谱柱,只能用纯有机溶剂冲洗色谱柱对于sepax系列的硅胶柱可以用不低于50%有机相冲洗色谱柱,最后保存在纯的有机溶剂中;在进行样品分析前,一定要保证流动相与色谱系统及色谱柱柱内的保存液要互溶,如不互溶,则需要用异丙醇过度,否则,会影响色谱系统与损坏柱子;反相手性色谱柱如：CHIRALCEL OZ-3R：同C18柱阴离子柱和阳离子柱：目前常见的阴子柱有waters IC-Pak TM anion,阳离子柱有磺酸基阳离子柱与waters阳离子交换柱钙型;对于waters IC-Pak TM anion 和waters阳离子交换柱钙型,新柱子使用前用高纯水小流速min缓慢升高到min冲洗约30分钟,然后再换成流动相平衡色谱柱;在冲洗色谱柱之前,要保证整个色谱系统为纯水相;对于磺酸基阳离子柱含有硅胶基柱的,使用前用甲醇或乙腈小流速冲洗30分钟,然后高纯水替换系统冲洗,然后接上色谱柱;分析完样品后,对于waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型用高纯水冲洗色谱柱,色谱柱最后保存在纯化水中;对于磺酸基阳离子柱,用50%的乙腈或甲醇冲洗色谱柱30分钟,最后保存在甲醇或乙腈中参照柱子说明书;冲洗所用流速根据柱子耐压情况进行调整;需要特别强调的是waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型是不能过有机相纯有机溶剂或有机溶液,否则会损坏色谱柱;氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱目前所使用的氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱基本都是使用反相系统,其操作方法与维护保养与C18相同;对于新碰到的别的型号的色谱柱,如本规程没有说明时,要参照色谱柱说明书具体问题具体分析;液相仪器的冲洗1、冲洗色谱系统具体情况具体分析,可针对缓冲盐浓度较高的流动相一般做完试验冲洗完色谱柱后,换上两通,将各通道放于10%乙腈中冲洗至少30分钟若原色谱系统中流动相含盐,则用高纯水有时候用温水效果更好冲洗至少30分钟后再用10%乙腈冲洗;若仪器长时间不用,则将仪器保存于80%乙腈中; 2、清洗进样针、柱塞杆洗针液应选择能较好溶解样品的溶剂如该样品在70%甲醇中溶解,则洗针液应选择70%甲醇或更高比例的甲醇；清洗柱塞杆的溶剂为了清洗流动相中析出的盐,一般选择低比例的有机相,如10%甲醇或乙腈;3、仪器的钝化色谱泵溶剂过滤头、进出口阀及管路包括进样器和检测池若被污染,系统应做清洗和钝化处理;一般采用30%磷酸水溶液作为清洗剂,用6mol/L硝酸作为钝化剂,先清洗再钝化;清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢;钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜;30%磷酸水溶液制备：取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀;6mol/L硝酸的制备：取浓硝酸40ml与60ml水混匀;方法：将色谱柱取下,用两通连接进样器和检测器,将所有吸滤头放入高纯水中,以min流速过渡至少30分钟,待管路中有机溶剂洗脱干净；再换用30%磷酸清洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7用pH试纸测试,清洗完成；然后换用6mol/L硝酸冲洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7,钝化完成;用纯甲醇过渡,浸润泵头及管路,备用;。
液相色谱的维护保养
液相色谱的维护保养
液相色谱(LiquidChromatography,简称LC)是一种常用的色谱分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
为了保证LC的分析结果准确可靠，必须对仪器进行定期的维护保养。
1. 液相色谱系统的清洁
在使用液相色谱前，必须对系统进行清洁，以避免污染对结果的影响。
清洁步骤包括：
- 清洗色谱柱：根据柱子类型选择合适的洗涤溶液，如纯水、乙腈、甲醇等，按照厂家提供的清洗步骤进行操作。
- 清洗进样器：将进样器从系统中拆下来，用洗涤溶液进行清洗，再用纯水冲洗干净。
- 清洗管路：将管路中的溶液排空，并用纯水进行多次冲洗，确保管路干净。
2. 液相色谱系统的保养
液相色谱系统的保养包括：
- 定期更换耗材：如柱子、进样器、滤膜等。
- 定期校准：校准泵的流量、检测器的灵敏度等参数，保证仪器的准确性。
- 定期检查电子元件：如检测器的灯管、电极等，保证其正常工作。
3. 液相色谱系统的存储
如果液相色谱系统长时间不用，必须进行正确的存储，以避免损
坏设备。
存储步骤包括：
- 将溶液从系统中排空，清洁干净。
- 拆下柱子和进样器，将其分别用保护塞封住。
- 将检测器的灯管、电极等拆下，放在干燥、通风的地方存放。
以上是液相色谱维护保养的主要内容。
只有定期进行维护，才能保证液相色谱系统的精准度和稳定性，获得准确可靠的分析结果。
液相色谱柱的保存 液相色谱维护和修理保养
液相色谱柱的保存液相色谱维护和修理保养1.反相色谱柱每天试验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，试验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。
注意：不能用纯水冲洗柱子，应当在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
2.长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必需存于合适的溶剂下。
对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。
储存的温度好是室温。
液相色谱柱的使用和维护在液相色谱操作过程中，我们需要下面的问题，便利维护液相色谱柱。
A柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。
必需防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
B.假如仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
C.避开压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
温度的蓦地变化或者使液相色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充情形；柱压的蓦地上升或降低也会冲动柱内填料，因此在调整流速时应当缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
D.应渐渐更改溶剂的构成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂更改为全部是水，反之亦然。
E.如使用柱温掌控装置时，应注意在通人流动相后才能升温。
F.一般说来液相色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。
否则反冲会快速降低柱效。
G.选择使用适合的流动相，以避开固定相被破坏。
有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避开分析柱中的硅胶基质被溶解。
H.避开将基质多而杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。
保护柱一般是填有相像固定相的短柱。
保护柱可以而且应当常常更换。
液相色谱柱子使用及保养
专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的保养（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止 其在流动相中析出
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
硅 胶 的 溶 解 曲 线
填料新的键合技术 - PH范围 2-12
- 稳定性好，使用寿命长
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效
色谱柱的使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度
色谱柱的保养（二）
流动相方面 除去微粒 纯度的要求
超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，
再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。
色谱柱的存放
存放前的处理 除去杂质、盐等，防止细菌生长 合适的存放溶剂 两端密封保存，避免色谱柱床干枯
液相色谱柱的使用和维护保养
液相色谱柱的使用和维护保养液相色谱柱是一种广泛使用的分离技术，可用于分离和测定复杂混合物中的组分。
由于液相色谱柱具有精确分离、操作简便、分离效率高等特点，因此，越来越多的实验室都开始使用该技术。
在使用液相色谱柱时，正确的维护保养非常关键。
本文将介绍液相色谱柱的使用方法和维护保养技巧，以便确保您的分离实验能够得到最佳的结果。
一、液相色谱柱的使用1. 准备工作使用液相色谱柱之前，必须先进行预备工作。
这包括：清洗和准备液相色谱柱以免携带有污染物。
准备需要分离和测定的样品。
准备适当的流动相。
流动相必须符合样品的性质。
液相色谱柱的流动相应该是无色的，纯净的水或相应的缓冲液，并具有必要的缓冲能力。
根据柱的尺寸来选择适当的样品注射量。
2. 柱的装配通常情况下，液相色谱的柱是由管状的柱壳、填充柱节、柱端固定件和柱段之间的密封件组成。
在对柱进行装配的时候，对组件应该加强检查以保证每一个元件的质量。
柱被放置在可控压力的色谱装置中，直到达到设定的温度，流动相通过柱床高度。
在样品通过柱床的过程中，要确保流动相的速度恰好足够将所有的组分都分开并在规定的时间内溶出。
3. 分析过程准备工作完成后，可以开始进行样品的分离实验。
在整个过程中，以下措施应予以注意：在样品从样品室进入色谱柱之前，流动相必须在柱中流动。
否则，在注入样品时，将有空气囤积在柱床中，会在透射检测器处产生噪音。
更换液相色谱柱的流动相时需要小心，因为对于一些化学品来说，即使是微量的杂质也会对结果产生影响。
如果发现柱床粘住或困住，不应使用力量来拉动柱子，而应该使用相反方向的流动相，以使样品回到某一个位置，并反向流动一会，这样可以避免样品损坏柱子床。
二、液相色谱柱的维护保养液相色谱分析的成功与否，除了预备工作和分析过程外，还与样品的制备、取样位置以及样品进入液相色谱柱中的流动相的条件等因素有关。
因此，经常做好液相色谱柱的保养工作，可以有效防止柱子损坏，延长其寿命并保证实验结果的准确。
液相色谱柱使用注意事项
液相色谱柱使用注意事项在使用液相色谱柱时，需要注意以下事项以保证柱子的性能和使用寿命。
1.流动相流动相是液相色谱分离的基础，应选择与样品相容、纯度高、稳定性好的流动相。
在使用前，应进行过滤和脱气处理，以避免对柱子造成损害。
2.柱子选择根据不同的样品和分离要求，应选择合适的液相色谱柱。
选择时需要考虑柱子的类型、粒径、孔径、填料等参数。
对于复杂的样品，建议使用具有更强分离能力的反相柱。
3.柱子清洁在使用前，应对液相色谱柱进行清洁，以去除柱子内部的杂质和污染物。
清洁时应使用温和的清洁剂，如甲醇、乙醇等，并避免使用强烈的清洁剂或酸碱溶液。
4.操作温度液相色谱柱应在规定的操作温度下使用。
过高的温度可能导致柱子的性能下降或损坏，而过低的温度则可能导致样品分离效果不佳。
在使用过程中，应密切关注柱温的变化。
5.压力变化压力变化是液相色谱分离的关键参数之一。
在使用过程中，应密切关注压力的变化情况。
若出现压力波动或异常升高，应立即采取措施解决问题，以免对柱子造成损害。
6.流动相流速流动相流速是影响液相色谱分离效果的重要因素之一。
应根据分离要求和样品性质选择合适的流速。
过快的流速可能导致柱子的性能下降或损坏，而过慢的流速则可能导致样品分离效果不佳。
7.样品处理在进样前，应对样品进行处理，以去除杂质和干扰物质。
处理方法包括样品萃取、净化、浓缩等。
处理时应避免对样品造成污染或损失。
8.柱子储存在使用完毕后，应对液相色谱柱进行妥善的储存。
储存时应避免阳光直射、高温、潮湿等不利环境条件。
同时，应定期对柱子进行检查和维护，以保证其性能和使用寿命。
液相色谱柱的使用和维护
前言液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以固定相中流出而得到分离。
因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。
柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。
但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护色谱柱的知识非常必要。
色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。
引起这些问题的内在原因有:(1) 硅羟基的死吸附。
色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。
任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。
被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。
当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。
(2)重金属。
色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高，无论怎样处理,都会有不少于5x10- 6的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。
例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。
(3) 碳流失。
固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。
(4)缓冲液中盐的析出。
在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。
分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。
这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。
(5)色谱柱变干。
如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。
2色谱柱的使用新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。
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溶剂准备：过滤
选择合适的滤膜
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可 溶物。
醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推 荐用于蛋白质和其相关的样品。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于 强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性 样品和有机溶剂。
样品准备
为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护 作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样 品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨 损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
胍, THF, HFIP
若仍无效，应考虑更换过滤片
色谱柱头塌陷的修补
柱头有塌陷可用填料修补：
1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头
塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面 ，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用
刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上
柱入口接头，把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速，直 到操作上限为止。
色谱柱以外的因素（二）
柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题
阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱
压力传感器不准确
流速是否错误?
色谱柱以外的因素（三）
实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变
样品溶剂不同
样品稳定性不好 方法的开发不好
样品过滤头的类型：
30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品 体积少于50μl。 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格,材料为纤维素。
3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格。处理样品体积为7μl。
色谱柱的保养（二）
流动相方面 除去微粒 纯度的要求
超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
不要高压冲洗柱子
色谱柱保护
在线的保护装置
给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染
装置
在线过滤器
自装填料保护柱
预装保护柱
新型的保护柱
特点 高质量, 高效填料 - 不损失柱效 增加分析柱效 - 增加适应范围 20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保护柱 寿命 手可拧紧接头，安装时不需要工具
典型的流速
流动相的保存
有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发 选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150x4.6mm 2.5ml 50ml 200x4.6mm 3.3ml 65ml 250x4.6mm 4.2ml 80ml **再有杂质严格清洗： 20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流 动相清洗
溶剂过滤-除去微粒
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶 剂过滤器以及色谱柱。
遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和 色谱柱的寿命：
������ 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。
������ ������ ������ ������
用滤膜过滤溶剂去除微生物。 每两天更换或过滤溶剂。 避免溶剂瓶直接日照。 向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。
1天
新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
色谱柱日常使用
过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液 开机时，流速和柱压要逐渐增加
进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液
注意色谱柱的pH值使用范围 不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子
关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗
固定相稳定，不易流失
应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响
缺点∶
pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
反相HPLC柱（C18）的性能
常规C18填料的稳定性
硅胶基质填料 pH范围：2-8 pH值大于7时 键合相粉碎或溶解 pH值小于2时 键合相的化学键断裂 经常用缓冲液 固定相降解
通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径) 整体式- 使用方便，容易
各种不同填料配合色谱柱
色谱柱常见毛病
柱压过高 多少才算高?
不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异
柱效低
重复性差
不出峰，回收率低
柱压过高
为什么柱压会过高 微粒堵塞
样品 流动相 密封垫
注意：1）每张滤膜只能用一次。
2）水相和有机相不要搞混。
溶剂的相溶性
溶剂信息
避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：
������ ������ ������ ������ ������ 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。 高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。 在有机溶剂中的有机酸溶液。 含有强络合剂的溶液。
缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足
手动进样器-六通阀的结构
手动进样器清洗
为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗
2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，
再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。
色谱柱的存放
存放前的处理 除去杂质、盐等，防止细菌生长 合适的存放溶剂 两端密封保存，避免色谱柱床干枯
避免机械震动
注意存放的温度
色谱柱以外的因素（一）
“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹 氦脱气，效果较好，但成本高。
加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染
抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡 10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱 气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优 于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
2 星期 1 星期
1天 1 小时 新鲜配制
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保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期
柱床膨胀
不可逆吸附 细菌生长
柱效低
为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞
样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞
色谱柱内的死体积
流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯
重复性差、回收率低
实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定
硅解 胶曲 的线 溶
填料新的键合技术 - PH范围 2-12
- 稳定性好，使用寿命长
1 3 5 7 9 2 4 6 8 p H
良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效
色谱柱的使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度
������ 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。
������ 四氯化碳和异丙醇或THF混合液。
溶剂截止波长
溶剂准备：脱气
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶 解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动 相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气 泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降， 甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些 组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分 离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的保养（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止 其在流动相中析出
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
记 住 ∶ 每 种 色 谱 柱 可 能 有 特 定 的 方 法 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的清洗-物理阻塞
在安装柱前后测试压力差
如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的