病毒RNA提取实验方法(protocol)
Trizol提取RNA的protocol
Trizol提取RNA的protocol1)准备试剂：氯仿，异丙醇，75％乙醇（DEPC水配），RNAase-free的水或0.5％SDS溶液（加水到RNase-free的玻璃瓶，加DEPC到终浓度0.01%(V/V)，过夜并高压。
SDS也要用处理过的DEPC水配置）2)Homogenization：组织裂解：50-100mg的组织加1ml Trizol用匀浆器匀浆，样本体积不能超过Trizol的10％贴壁生长的细胞：3.5cm直径平皿加1ml Trizol，反复吹打。
（1ml trizol 用于10cm2的面积，Trizol不够量可能导致DNA污染）悬浮细胞：5-10×106动物、植物或酵母细胞或107个细菌加1ml Trizol反复吹打。
在加入Trizol 之前不要washing cells，以避免mRNA降解。
Optional：某些组织在homogenization后可采用12000g×10min，4度离心，去除沉淀。
3)Phase separation：a)室温放置5min，以保证核蛋白复合体完全解离。
b)每1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖。
c)颠倒混合15s，室温放置2-3min。
d)12000×15min，4℃，不超过12000g4)RNA precipitationa)取上层水相到新管中。
如分离DNA或protein可保留有机相。
b)每1ml Trizol加0.5ml 异丙醇，室温孵育10minc)12000×15min，4℃5)RNA washinga)去上清，每1ml Trizol至少加1ml 75％乙醇，蜗旋混合b)7500g×5min，4℃6)Redissolving the RNAa)去上清，短时空气干燥RNA沉淀，用RNase-free的水或0.5%SDS溶解。
b)吹打数次，55-60℃孵育10min，也可以用100％甲酰胺溶解，-70℃保存。
rna提取的流程和方法
rna提取的流程和方法RNA提取的流程和方法一、RNA 提取流程1、实验准备在RNA提取前，需要准备一些实验用品，如RNA提取试剂盒、干净的Eppendorf管、试剂管盒等。
2、组织采集从实验材料（如组织）中采集适量样品，将其添加到实验管中，并用恰当的液体（如液氮）固定。
3、细胞分离和消化将固定过的样品放置在消化槽中，并加入相应蛋白酶（常用的蛋白酶有 Protease、 DNase I 等）。
待消化完成后，细胞就可以分离出来，得到小分子和线粒体RNA。
4、细胞悬液处理细胞和消化液将放置在分离机中，以速度较快的离心来分离细胞悬液和上清液，获得纯净的细胞悬液，以及细胞内的RNA。
5、病毒筛选针对实验中可能存在的病毒，在RNA提取后期，可以采用专门的病毒筛选技术来检测病毒的存在与否，用以保证实验结果的可靠性。
6、RNA 提取利用加热或冷冻方法来预处理细胞悬液，再加入性质非常活跃的提取试剂，分离出RNA，最后经酶抑制剂处理，即可实现RNA的提取。
7、RNA 质量检测采用实时定量荧光PCR（qPCR）或定量实时荧光 PCR（qRT-PCR）技术，对提取出来的RNA进行质量检测，以确定RNA的质量是否满足后续研究的要求。
8、实验结束实验完成后，将所有的实验用品清洗干净，并完成实验报告记录和记录实验结果，结束实验。
二、RNA 提取方法1、常规方法（1）分离法利用细胞成分的不同溶解度，将细胞内的RNA和DNA分离出来，如甲醇分离法、混合洗涤法、膜过滤法等，然后将DNA除去，即可得到纯化的RNA样品。
（2）磁珠法采用特定的磁珠技术，通过磁场的作用，将RNA结合在磁珠上，然后加入洗涤液，脱除磁珠上的杂质和有害物质，最终得到纯化的RNA样品。
2、新型方法（1）多尺度细胞抗分离法利用细胞的多尺度的抗性，通过不同直径的磁珠把细胞内的RNA 分离出来，可以节约实验时间，并有效提高细胞内RNA的收量、纯度和活性。
（2）膜过滤法采用膜过滤的方法，可以快速准确的将细胞内的RNA纯化，提高RNA的收率，并保护RNA免受外界环境的破坏，为实验提供良好的保护条件。
PCR全过程Protocol
总RNA提取1．十二孔板培养细胞，每孔加入1ml Trizol 反复吸吹（无泡沫），冰浴下静置20min，转移至1.5mlEP管中。
2．加入0.2ml氯仿，用手震荡15sec×6，混匀后静置2min3．4℃12000转离心15min。
混合液分三层。
4. 小心吸取最上层无色水相于干净EP管中，按每ml Ttizol加入0.5ml异丙醇，-20℃孵育2小时（或过夜）。
5. 4℃12000转离心10min弃上清，按每ml Trizol加入1ml75%乙醇（无RNA酶，用depc水）轻微混匀。
6. 4℃7500转离心5min弃上清，室温下适度吹干。
7. 加入0.1%DEPC（超纯水）水（20ul）30-50ul溶解RNA。
55-60℃孵育5min分装后在-80℃保存。
纯度鉴定取2ulRNA加DEPC水198ul，即稀释100倍，吸取100ul至紫外板，酶标仪260nm和280nm下测定吸光度。
（1.8-2.0）完整性鉴定1.制胶：在烧杯中放入0.3g琼脂糖，加入15ml 0.5×TBE工作液，摇匀后放入微波炉加热溶解，室温放至60℃（手背无烫感），倒入托盘中。
2.加入4.5ul（0.3ul/ml ）ultrapower TM染料，充分混匀。
3.迅速倒入电泳槽中。
（琼脂糖凝胶需要冷却，凝固60min以上）4.凝胶完全凝固后，小心移走梳子，将凝胶放入电泳槽，加样孔放入靠近负极一侧。
5.加入能没过胶面2-5mm深的电泳缓冲液。
6.RNA样品，6*buffer按照5：1混匀后，用微量移液枪加样（加样10ul）。
7.盖上电泳槽并通电，电压设置100V。
8.电泳完毕，切断电源，取出凝胶于紫外下观测并拍照。
逆转录1．热变性RNase Free H2O (11-a)ul a（体积）=（RNA总量（1微克）/RNA浓度）Random Primer (25pmol/ul) 1ulTotal RNA(1ug以下) aul （根据总RNA的浓度决定此体积）总体积：12ul65°C，5min后，立即置于冰上（冰浴5min）。
提取rna实验步骤
提取rna实验步骤嘿，咱今儿个就来聊聊提取 RNA 的那些事儿！这可真是个精细活儿呢！你得先准备好各种家伙什儿，离心管啦、移液枪啦，就像战士上战场得有称手的兵器一样。
然后呢，把你要研究的样本弄到手，这就好比是找到战斗的目标。
接下来，开始破碎细胞。
你就想象成是给细胞来个“大拆迁”，把它们的外壳啥的都给弄破，让里面的 RNA 能跑出来。
这一步可得小心点儿，别太粗暴了，不然 RNA 也会被你不小心弄伤的哟！然后，加入各种试剂，就像是给 RNA 搭个小窝，让它们能舒舒服服地待着。
这里面的门道可多啦，每种试剂都有它的作用，就像不同的调料能做出不同味道的菜一样。
再之后就是离心啦！这就像是把好的和坏的分离开来，让 RNA 能聚集到一块儿。
离心的时候那机器嗡嗡响，就好像在说：“嘿，我在努力工作呢！”经过一番折腾，你就能看到那一点点珍贵的 RNA 沉淀啦！这就像是在一堆沙子里找到了金子，那叫一个高兴啊！提取 RNA 可不比做饭简单多少啊，每一步都得仔仔细细的，稍有差错可能就前功尽弃啦！你想想，要是好不容易做到最后发现 RNA 没了，那得多郁闷呀！所以呀，做这个实验的时候得打起十二分的精神。
这实验就像是一场冒险，你得小心翼翼地前进，遇到问题就得想办法解决。
就好像你在森林里迷路了，得靠着自己的智慧和勇气找到出路。
而且，这可不是一次就能成功的事儿，有时候得反复尝试好多次呢！咱再说说这 RNA 啊，它可重要啦！它就像是生命的密码，藏着好多好多的秘密。
通过提取它，我们就能解开这些秘密，了解生命的奥秘。
这多神奇呀！总之呢，提取 RNA 实验是个既有趣又有挑战性的事儿。
它需要你的耐心和细心，也需要你对科学的热爱和执着。
如果你能做好这个实验，那你可就是个小科学家啦！加油吧，朋友们，去探索 RNA 的奇妙世界吧！。
RNA提取protocol
TRIzol 提取RNA实验试剂：TRIzol、氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC水实验用具：4℃离心机，1mL、200uL、100uL移液器，1.5mL、200uL EP管，一次性手套、口罩等操作步骤1. 样品处理取新鲜或-70℃冻存小鼠视网膜尽量剪碎，每50-100 mg组织加入1 ml TRIzol，匀浆仪进行匀浆处理。
（可先加200uLTRIzol直接用移液枪打碎视网膜，再加TRIzol至1mL）可选步骤：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。
匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而RNA存在于上清中。
对于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。
吸取上清备用。
2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。
3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3min。
4. 4℃12,000 rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约600μl）转移到一个新的离心管（自备）中。
5. 在得到的水相溶液中加入0.5mL异丙醇（每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇），颠倒混匀，室温放置10分钟。
6. 4℃ 12,000 rpm离心10分钟，弃上清。
7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。
每使用1 ml TRIzol用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。
8. 4℃7500rpm离心5分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。
9. 室温放置5分钟，晾干。
加入30-100 μl无RNase的水，充分溶解RNA（可55~60℃溶解10min），得到的RNA分装于200uL EP管中（每管10uL）。
Trizol法提取总RNA Protocol
Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。
然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。
最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。
所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。
2.氯仿：用于抽提RNA。
3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。
4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。
6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。
实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。
2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。
3.移液器：用于吸取试剂和样品。
4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。
5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。
准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。
2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。
3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。
实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。
2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。
3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。
4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。
5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。
注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
protocol 实验
引物 V3 4x10-2 μL
Tag 酶 0.1μL
Tag 酶在常温下也会起反应 ，故配制体系最后再加入
在 PCR 仪上进行扩增 5min95°c→39cycle 95°c 30s 65°c 30s → 10min72°c →12°c 72°c 30s 琼脂糖凝胶电泳：根据目的 DNA 的碱基对数选择配制 1%的琼脂糖凝胶 1. 称量 1g 琼脂糖粉于锥形瓶中 2. 称量 100mlTAE 至锥形瓶中 3. 将托板备好，插入梳子，把锥形瓶放入微波炉中煮热至冒泡融化即可 4.将锥形瓶取出冷却加入溴化乙锭（EB）7µl 5. 将琼脂糖倒入备好的托板挑去小泡 冷却 30min 6. 电泳 将已凝胶的托板放入电泳槽中，槽中 TAE 适量，略过胶面 加 2µlBuffer 混匀取 10µl 上样量， 盖好电泳仪盖 打开电源电流 100mA 电压 90V 电泳约 25min 即可 曝光验证
5、65～70℃水浴锅预热大的塑料培养皿，同时用烧杯预热蒸馏水。 6、将标本放于预热的培养皿枕垫上，将 50%的硝酸银溶液与 2%的明胶溶液以 2：
1 混匀后，立即滴加到染色体片上，盖上盖片。 7、待反应液由无色透明变黄，最后变成棕褐色（约 2～4min），立即取出玻片，
用预热的蒸馏水彻底冲洗，晾干后镜检。（染色适度的片子染色体呈金黄色， 核仁组织区位黑色。）
终浓度 50Mm Tris PH 7.5 50Mm EDTA PH 8
10ml 5M Nacl 2.5ml 1M DTT 250 1M Spermidiner 50ml 10% SDS
100Mm Nacl 5Mm DTT 0.5Mm Spermidine 1% SDS
储液 Tris ---HCL EDTA Nacl DTT SpμL
提取RNA及PCR步骤
一、提取组织RNA1 •准备好冰盒、1.5mlEP管优RNA酶）、剪刀及镊子（需消毒，再用灭菌纯水和DEPC 水洗净）、钻头、灭菌纯水等。
2.取出冻存管，剪取约0.5cm放于EP管。
3.即刻加1ml trizol，剪碎至无可见微粒，静置5-10min4.加0.2ml氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30C静置2-3min5.离心12,000g*15min, 2-8 C6.EP管内分三层，取上层液相置于新EP管7.加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，15-30 C静置10mi n8.离心12,000g*10mim, 2-8 C9.弃上清（不用吸净残液），加1ml 75%乙醇清洗沉淀（乙醇用前需4C预冷）10.离心10000/7500g*5min, 2-8 C11.去上清（需吸净残液），干燥RNA（超净台内风干至白色变透明状，约1h以上）,加10—12ul DEPC水解（约1h以上），测浓度，-80C保存。
PS:1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。
2.75%无水乙醇用前需4C预冷。
3.若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解，可置于55C水浴加热。
4.破碎：取组织勿过多，否则难以破碎，亦难以提取RNA ;一个样品破碎过后需清洗，顺序为：酒精棉球擦洗 -DEPC水洗―拆分清理―纯水洗―棉球吸去钻头残液。
5.破碎仪的使用：打开前先保证已调于低档，将钻头浸没于样品中，切忌在空气中空转，从低到高慢调，同时上下轻移样品，注意力度控制，避免液体飞溅误伤；同时注意听破碎时的声音，若有尖锐声音发出，说明有异物卡住钻头，需停止查看。
二、提取细胞RNA1.细胞加1ml trizol 裂解5min, 15-30 C2.加0.2ml氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30C静置2-3min其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始PS:1.新EP管需用无RNA酶EP管。
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1，用异硫氰酸胍提取
提禽流感病毒的详细步骤，可参考（我提过N次做定量PCR都没问题）：
1.取200ul样品数+阴性对照+阳性对照个1.5ml灭菌eppendorf管
2.加600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加200ul氯仿，颠倒混匀
3.13000rpm离心15min
4.在第3步离心快结束时，另取同样多eppendorf管，加入400ul -20度预冷的异丙醇
5.取第3步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层，第3步离心结束往外拿的时候，管子尽量不要倾斜）转移到第4步准备的管中，颠倒混匀
6.13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体
7.加600ul 75％乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇
7.13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体
8.4000rpm离心10sec，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min（不可过分干燥，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。
2000rpm离心5sec，冰上保存备用（最好2小时内使用，以免RNA降解）
2，用TRIzol LS提取
应用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。
提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。
所用一切物品也应是无RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混匀，室温放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。
1.3 离心4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。
1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。
1.5 离心4℃、13000r/min、15min，（这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看，会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了）用枪小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min，（这时又会发现管子没东西了，不要担心，有的，但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。
1.7 加入适量DEPC处理水。
（如果材料来源丰富的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；若要省着点用，则自己看着办了，尽量不要加太多的水）。
1.8 建议立即做RT。
若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。
3，Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
1、取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积Trizol液，混匀；
2、室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
3、取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g 离心5分钟；
5、重复第4步；
6、小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
7、然后将RNA溶于水中，放置10分钟。
[注意]
1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。