红松SSR-PCR反应体系的建立与优化
梁山慈竹SSR-PCR体系的优化
梁山慈竹SSR-PCR体系的优化梁山慈竹(SSR-PCR)是一种分子生物学技术，用于鉴定和分析梁山慈竹(SSR)基因座的多态性。
SSR位点是一种高度变异的遗传标记，能够在不同个体之间产生不同的DNA序列重复单元。
通过优化SSR-PCR体系，可以提高PCR反应的灵敏性和特异性，从而提高SSR位点的分型效果。
优化SSR-PCR体系的关键是选择合适的引物和PCR条件，以提高PCR反应的效率和特异性。
需要选择合适的引物对SSR位点进行扩增。
引物设计应基于梁山慈竹的基因组序列，确保引物与目标位点的配对是特异性的。
引物的长度应在18-25个碱基对之间，GC含量应在40-60%之间。
还应对引物的Tm值进行优化，以提高引物与模板DNA的特异性结合。
需要优化PCR反应的条件。
PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、dNTPs、酶和缓冲液等组分。
PCR反应的温度梯度是优化PCR的关键步骤之一。
温度梯度应选择在50-70℃之间，以找到最合适的退火温度。
还应对PCR反应的延伸时间和循环次数进行优化，以保证产物的特异性和产量的充分扩增。
还可以采取其他策略进一步优化SSR-PCR体系的效果。
可以引入增效剂，如DMSO和Bovine Serum Albumin (BSA)，以提高PCR反应的效率和特异性。
还可以采用nested PCR 或semi-nested PCR的方法，以增加PCR产物的特异性和灵敏性。
在优化SSR-PCR体系时，还需要考虑一些潜在的问题和解决方案。
可能会出现非特异扩增的问题，产生了多个非目标的PCR产物。
这时，可以尝试调整PCR反应的温度梯度，增加引物的特异性，或设计新的引物对进行扩增。
PCR反应的污染问题也需要注意，可以采取一些严格的实验措施，如隔离试验和反应区和非反应区的物理隔离，以防止PCR反应的污染。
通过合理选择引物和优化PCR反应条件，梁山慈竹SSR-PCR体系的效果可以得到显著提高。
这将有助于深入研究梁山慈竹的遗传多样性和种质资源利用，为遗传改良和保护提供科学依据。
松阿扁叶蜂SSR—PCR反应体系的优化
松阿扁叶蜂SSR—PCR反应体系的优化Abstract: In order to establish the SSR-PCR amplification system using genomic DNA of Acantholyda posticalis which was extracted by SDS-proteinase K method as template, orthogonal design was used to optimize main PCR factors such as template DNA, Taq DNA polymerase, Mg2+, primer and dNTPs. The results showed that the optimized PCR system included 1.00 U Taq DNA polymerase, 3.00 mmol/L Mg2+, 3.75 mmol/L dNTPs, 25.00 ng/μL DNA template and 20.00 μmol/L each primer in the total volume 25 μL.Key words: Acantholyda posticalis Matsumura;SSR-PCR;orthogonal design松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)是松树的重要食叶害虫之一,其1年发生l代,主要为害油松､黑松､樟子松等,常将当年生和二年生针叶吃光,致使被害松林成橘褐色,严重时80%以上的针叶被取食,从而严重影响树木生长[1,2]｡中国关于松阿扁叶蜂的研究主要集中于其生物学特性[3,4]､发生原因[5,6]､寄主选择[7]､防治技术和预测预报[8,9]等方面,但关于该害虫种群遗传变异的研究至今未见报道｡微卫星(SSR)分子标记具有分布广泛､多态性高､稳定性好､操作简便､检测技术简单及共显性遗传等优点,已被广泛应用于物种资源遗传多样性研究､基因分子标记以及昆虫遗传多样性研究等领域｡但SSR-PCR反应结果易受反应体系中多种因素的影响,因此需要对其扩增体系进行优化,然后才能进行后续的试验分析;此外,不同物种所需的SSR-PCR反应的最佳反应体系一般也不尽相同｡在进行种群遗传多样性的研究中,运用正交设计方法[10-12]对影响松阿扁叶蜂SSR-PCR反应的各因素进行了优化试验,建立了一套适合松阿扁叶蜂SSR-PCR 的反应体系,为应用该技术进行松阿扁叶蜂的种群遗传多样性分析打下基础｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料供试材料为2010年6月采自陕西省周至县楼观台国家森林公园为害油松的松阿扁叶蜂幼虫,样品保存于体积分数为95%的乙醇中,带回西北农林科技大学林学院昆虫分子生物学实验室进行基因组DNA提取｡1.1.2 试剂与仪器10×PCR Buffer(无Mg2+)､10 mmol/L dNTPs､5 U/μL Taq DNA聚合酶､25 mmol/L MgCl2以及分子质量标准DL 2000 DNA Marker均购自宝生物公司(大连)有限公司,引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成,稀释成20 μmol/L｡Mastercycle Pro S型PCR仪购自德国Eppendorf公司,ND-1000微量紫外可见分光光度计购自美国NanoDrop公司｡1.2 方法1.2.1 基因组DNA的提取和浓度测定采用改良的SDS-蛋白酶K法[13]提取松阿扁叶蜂幼虫基因组DNA,在1%琼脂糖凝胶上电泳检测提取产物的完整性｡用ND-1000微量紫外可见分光光度计检测DNA溶液的浓度和纯度,并将其稀释到20 ng/μL,于-80 ℃保存备用｡1.2.2 退火温度的优化根据预试验结果,选定引物LIST2001[14]用于SSR-PCR反应体系的优化｡首先在45~65 ℃设置4个退火温度即48.9､52.7､57.6和61.6 ℃进行试验,确定该引物最佳的退火温度｡SSR-PCR基本反应体系为:2.5μL 10×PCR Buffer(无Mg2+),2 μL 25 mmol/L MgCl2,1 μL DNA模板,20 μmol/L上下游引物各1 μL,0.25 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶,2 μL 10 mmol/L dNTPs,最后用无菌去离子水补足至25 μL｡SSR-PCR基本扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s､48.9 ℃/52.7 ℃/57.6 ℃/61.6 ℃退火45 s､72 ℃延伸45 s,30个循环;最后72 ℃延伸7 min｡扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶上用100 V电泳40 min,用溴化乙锭染色10 min,用去离子水脱色10 min,然后于Bio-Rad凝胶成像仪上照相保存｡1.2.3 SSR-PCR正交试验的设计针对影响PCR反应的5个因素(DNA模板､Mg2+､dNTPs､引物和Taq DNA聚合酶),选用L16(45)正交表在4个水平上进行正交试验｡设计的因素与水平见表1,2次重复｡PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s､61.6 ℃退火30 s､72 ℃延伸45 s,30个循环;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存｡PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,经溴化乙锭染色后于Bio-Rad凝胶成像仪上照相保存｡根据正交设计PCR扩增图谱中DNA条带的清晰程度与特异性(即条带强弱及杂带多少),参照何正文等[15]的方法从低到高依次对每个反应结果进行打分,分值从1分到16分,分值越高,表示敏感性､特异性越好｡所有数据分析均采用SPSS 12.0软件｡2 结果与分析2.1 松阿扁叶蜂基因组DNA的提取结果松阿扁叶蜂幼虫基因组DNA的提取结果表明(图1),松阿扁叶蜂基因组DNA大小约15 kb,主带清晰,无拖尾现象,DNA浓度为500~1 000 ng/μL,纯度为1.8~2.0｡2.2 不同退火温度对SSR-PCR反应结果的影响退火温度是引物和模板结合时的温度参数,是影响PCR扩增特异性的重要因素｡4个退火温度下的扩增结果(图2)表明,退火温度较低时(泳道1和泳道2的退火温度分别为48.9和52.7 ℃),引物与模板之间的错配几率增大,非特异性扩增条带多并且模糊;随着退火温度升高(泳道3和泳道4的退火温度分别为57.6和61.6 ℃),引物的特异性增加,条带也更加清晰,引物二聚体减少｡但是,退火温度更高则会使Taq DNA聚合酶活性降低或丧失,从而导致无法扩增出条带｡2.3 SSR-PCR反应体系的正交设计分析依据正交设计SSR-PCR的扩增结果(图3),对每个扩增反应进行评分(表2),由表2可知,根据极差分析结果可知,最优的方案为A2B4C3D4E2,即松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00 U Taq DNA聚合酶､3.00 mmol/L Mg2+､3.75 mmol/L dNTPs､25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物｡2.4 正交设计中各个因素对SSR-PCR反应的影响2.4.1 Taq DNA聚合酶用量对试验结果的影响方差分析结果表明,Taq DNA 聚合酶的用量是SSR-PCR反应中最为重要的因素,不同用量对扩增结果的影响达极显著水平(P<0.01)｡Taq DNA聚合酶用量高时不仅成本过高,而且容易产生非特异性扩增产物,用量过低则会导致SSR-PCR产物的合成效率下降｡2.4.2 Mg2+浓度对试验结果的影响Mg2+的作用主要是dNTP-Mg2+与核酸骨架相互作用,影响Taq DNA聚合酶的活性｡Mg2+浓度对SSR-PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低SSR-PCR扩增的特异性,浓度过低则影响SSR-PCR扩增产量甚至使SSR-PCR扩增失败而扩增不出条带｡一般的情况下Mg2+的浓度为0.5~5.0 mmol/L｡2.4.3 dNTPs浓度对试验结果的影响dNTPs的质量和浓度与PCR扩增效率有密切关系,方差分析结果显示dNTPs对试验结果的影响达到显著水平(P<0.05)｡dNTPs浓度过高会扩增出片状拖带或涂抹带,dNTPs能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低｡dNTPs浓度低时PCR产率及特异性均增高｡若dNTPs浓度高至4~6 mmol/L时,Taq DNA聚合酶活力要降低20%~30%,即产生底物抑制现象｡2.4.4 DNA模板浓度对试验结果的影响DNA模板浓度是制约扩增产物获得率及特异性的重要因素｡DNA模板浓度过低,分子碰撞的机率会降低,扩增产物少或不稳定;DNA模板浓度过高,会产生大量非特异性扩增小片段,运用琼脂糖凝胶电泳检测时会有拖尾现象,有时候还可能会没有PCR条带,特别是在DNA模板不纯的时候,会对SSR-PCR起抑制作用｡2.4.5 引物浓度对试验结果的影响引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且会增加引物之间形成二聚体的机会,降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发;引物浓度过低会使扩增产物减少｡3 小结与讨论筛选微卫星(SSR)引物和建立稳定的SSR-PCR反应体系是SSR分子标记检测过程中的一个重要环节,也是SSR多态性应用的基础｡在利用SSR分子标记开展松阿扁叶蜂的种群遗传多样性的初期研究试验中,曾对SSR-PCR反应体系中各因素分别进行了单独的梯度试验,但发现不能兼顾各因素间的交互作用,因此利用正交设计的均衡分散性和整齐可比性来解决理论上所需要的与实际可行的试验次数的矛盾｡为了确定最佳的反应体系,本研究利用松阿扁叶蜂的基因组DNA为模板,对SSR-PCR反应体系中的几个重要组成因素如模板DNA､dNTPs､Mg2+､引物以及Taq DNA聚合酶进行了多因素联合优化的正交试验,由于SSR-PCR反应体系中各组分均可能对扩增的特异性､敏感性和产量产生影响,针对每个因素进行分析时,都可以找到各自最适的浓度｡但是采用多因素联合优化的正交试验设计,借助合适的正交表,可以充分考虑各因素间的交互作用,通过极差分析确定松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00 U Taq DNA聚合酶､3.00 mmol/L Mg2+､3.75 mmol/L dNTPs､25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物｡此条件下获得的条带清晰,且重复率高｡利用这个体系已成功地进行了松阿扁叶蜂几个种群的遗传多样性分析,希望该研究结果也能为其他昆虫包括叶蜂其他种类的SSR-PCR研究提供参考｡参考文献:[1] 萧刚柔.中国森林昆虫[M].北京:中国林业出版社,1992.1147-1149.[2] 孙文杰,同金侠,李新岗. 松阿扁叶蜂发生规律调查初报[J]. 西北农业大学学报,1997,25(6):105-107.[3] 赵瑞良,李仲明,秦平友. 松扁叶蜂生物学特性及防治的初步研究[J].林业科学,1979,51(3):226-228.[4] 娄巍.松扁叶蜂为害樟子松简报[J].森林病虫通讯,1988,18(2):18.[5] 杨晖,王宇萍. 岐山县油松扁叶蜂大发生原因与对策[J].植保技术与推广,2000,20(1):27-28.[6] 刘素云.油松扁叶蜂的发生与防治[J].河北林业科技,2002(3):33.[7] 张同心,孙绪艮,崔为正,等.松阿扁叶蜂对不同树种挥发物的触角电位反应[J].昆虫学报,2005,48(4):514-517.[8] 武星煜,辛恒,马虽有.松阿扁叶蜂发生规律及防治技术研究[J].甘肃林业科技,2005,30(1):20-23.[9] 梁中贵,李建军,刘建强,等. 松阿扁叶蜂研究进展[J].中国植保导刊,2007,27(5):14-17.[10] 杨水云,李继娥,吴明宇,等. 正交试验法在PCR反应条件优化中的作用[J].生物数学学报,2005,20(2):202-206.[11] 刘佳妮,桂富荣,李正跃.SSR分子标记技术在入侵昆虫学研究中的运用[J].植物保护,2008,34(3):7-11.[12] 叶红卫. SPSS实现有交互作用的正交实验设计[J]. 西安文理学院学报(自然科学版),2009,12(4):118-121.[13] 代金霞,于有志,郑哲民. 拟步甲昆虫基因组DNA提取的比较研究[J]. 宁夏大学学报(自然科学版),2004,25(1):66-68.[14] ANTON C,SETTELE J,DURKE W. Nine polymorphic microsatellite loci for the parasitic wasp Neotypus melanocephalus (Hymenoptera:Ichneumonidae) [J]. Molecular Ecology Notes,2006,6(2):399-401.[15] 何正文,刘运生,陈立华,等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报,1998,23(4):403-404.。
ssr分子标记技术存在的问题
ssr分子标记技术存在的问题SSR分子标记技术是一种广泛应用于植物遗传研究中的分子标记技术。
它具有高度多态性、遗传稳定性和易于扩增等优点，因此被广泛应用于植物遗传多样性和基因定位等领域。
然而，SSR分子标记技术在应用过程中也存在一些问题，主要包括以下几个方面。
一、样品处理问题SSR分子标记技术需要从植物组织中提取DNA，因此样品处理是影响技术稳定性和可重复性的重要因素。
样品处理不当会导致DNA质量下降，从而影响PCR扩增效果和分析结果。
因此，在样品处理过程中需要注意细节，如避免样品受到污染、避免DNA降解等。
二、PCR扩增问题SSR分子标记技术需要通过PCR扩增来扩增目标序列，因此PCR扩增是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
PCR扩增过程中需要考虑多种因素，如反应体系、扩增条件、引物设计等。
如果PCR扩增条件不合适，会导致扩增效率低下、扩增产物不清晰等问题，从而影响分析结果。
三、数据分析问题SSR分子标记技术需要通过数据分析来解读分析结果，因此数据分析是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
数据分析需要考虑多种因素，如数据质量、数据处理方法、数据统计方法等。
如果数据分析不当，会导致分析结果不准确、分析效率低下等问题，从而影响研究结论的可靠性。
四、标记选择问题SSR分子标记技术需要选择合适的标记来进行研究，因此标记选择是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
标记选择需要考虑多种因素，如标记多态性、标记分布、标记稳定性等。
如果标记选择不当，会导致研究结果不准确、研究效率低下等问题，从而影响研究结论的可靠性。
综上所述，SSR分子标记技术在应用过程中存在一些问题，需要在样品处理、PCR扩增、数据分析和标记选择等方面加以注意。
只有在技术操作规范、数据分析准确、标记选择合理的情况下，才能保证SSR 分子标记技术的稳定性和可重复性，从而为植物遗传研究提供可靠的分子标记技术支持。
红尾仙女虾养殖群体ISSR反应体系建立及遗传多样性分析
0.2
0.75
2.5
874
CCCTCCCTCCCTCCCT
0.2
1.25
2.0
905
GGAGAAGCAGCAGCAGCAGC0Fra bibliotek11.25
3.0
注:反应体系为25 |jlL,其中10 x PCR Buffer均为2.5 |xL,dNTP均为2 |jlL Note: The reaction system is 25 |jlL, of which 10 x PCR Buffer are 2.5 |jlL and dNTP are 2 |1L
收稿日期:2020-02-20 基金项目：苏州市科技计划项目农业应用基础研究(SNG201915). 作者简介:谭舜(1999-),男,本科生,从事水生动物分子遗传学研究.E-mail: 1126828469@ 通信作者:韩晓磊.E-mail: 84125241@
3期
谭舜等:红尾仙女虾养殖群体ISSR反应体系建立及遗传多样性分析
0.3
0.75
3.0
809
AGAGAGAGAGAGAGAGG
0.2
0.75
2.5
816
CACACACACACACACAT
0.3
0.75
3.0
866
CTCCTCCTCCTCCTCCTC
0.2
0.75
2.5
868
GAAGAAGAAGAAGAAGAA
0.3
1.00
2.0
873
GACAGACAGACAGACA
简单重复序列间扩增(inter simple sequence re peat ,ISSR )分子标记技术操作简单、稳定快速,无需
快速微量提取番茄DNA及SSR-PCR反应体系的优化
关键词 ： 番茄 ； Ｎ 微 量 提 取 ；Ｃ 反应 体 系优 化 ； 子 标 记 Ｄ Ａ ＰＲ 分 中 图分 类 号 ： ４．０ ． 文 献 标 识 码 ： Ｓ６ １２３ ６ Ａ 文 章 编 号 ： ０ －０ ０ （０ ００ —０ １—０ １ １ ０ ９２ １ ）８ １３ ３ ０
３ ０ ）。 －９
收 稿 日 期 ：Ｏ Ｏ Ｏ — １ ２ｌ— １ １
［ Ｚ Ｋ ｎ ａａ Ｋ， ｉｉ ｎ Ｕ， Ｋｉ ｅ ，ｔ １（ ｌ ｔ ｃ ｎｉ １］ ａ ｄ ｓｍｙ Ｍ Ｇ ｌｌ ｄＩ Ｍｃ ｎ ｙＥ Ｃ ｅ ａ Ｍｅ ａ ｔ — ｌ ａ ｎ ． ｐ ｎａ ｉ ｓ
［５ １ ］胡 松 年 ， 阎隆 飞． 豆卷 须 肌动 蛋 白Ⅱ 异 型 体 ｃ Ｎ 克 隆 的序 列 分 豌 类 Ｄ Ａ 析口］ 中国生 物化 学 与分 子 生物 学报 ，９ ９ １ （ ） ８ ７８ ０ ． １ ９ ，５ ６ ：５ —６ ．
基 金项 目 ： 国家“ 十一 五 ” 科技 支撑 计 划 资 助 项 目（ 。 ６ ＡＢ １ — ２ ０ Ｂ ｏ Ａ７
ｏ ａ ａ ｔ ＡＣ 、 ，ｓｉ ｄ ｃ ｄ ｂ ｌ ｉ ｎ ｅ ｕｒ ｄ ｆ ｒｎ ｒ ｌｌｃ ｌ ｓ ｆ ｒ ａ ｉｎ ｖ ｎ ｎ ， １ ７ ｉ ｎ ｕ ｅ ｙ ａｌ ｎ ａ ｄ ｒｑ ｉ ｏ ｏ Ｆ ａ ａｌ ｏ ｒ ｔ ｘ ｅ ｆ ｕ ｎ ｏ
［］ Ｐａ ｔ ｅ ，０ １ １ ） １４ — ５ ４ Ｊ ． ｌ ｌ ２ ０ （ ３ ：５ １１ ５ ． ｎｃｌ
【 ３ ｉ ｉ ｒ Ｙｏ ｏａＥ， ｄ ｅ ａ Ａ ａ ｉ ｐｉ Ａ（ｒ ｎ １ Ｎ ｓ ｍｕ ａＴ， ｋ ｔ ｗａ ａＴ， ｔ １ ｎ Ａｒｂ ｏ ｓ ２ＤＤ ｌ ｈ ． ｄ ｓ
阔叶十大功劳ISSR—PCR反应体系的建立与优化
扩 增 程 序 中退 火 对 其 实 验 体 系 进 行 优 化 ． 研 究 采 用 正 交 试 本
１ ２ １ 基 因组 Ｄ ．． ＮＡ 的 提 取 采 用 改 良 的 Ｃ ＡＢ Ｔ
２ Ｌ 应 体 系 中 ， ． ｌ ｌＬＪ物 、 ． Ｔａ ０ 反 ０ ５／ ／ ｉ ｍｏ Ｉ ０ ５Ｕ ｑ酶 、 ０￣ ｌＬ ｄ Ｐ 和 ２ ｇ模 板 Ｄ １ ５ ｍｏ／ ＮＴ ｓ ０ｎ ＮＡ．
在最 佳 反应 条件 下 ， ８ 从 Ｏ条 引 物 中 筛 选 出 １ 扩 增 稳 定 、 态 性 丰 富 的 ＩＳ 引 物 ， 经 ５条 多 ＳＲ 并
冰箱 冷冻保 存 ．Ｓ Ｒ引 物根 据 加 拿 大 哥 伦 比亚 大 ＩＳ 学 （ Ｃ） 供 的 序 列 ， 上 海 生 物 工 程 公 司 合 ＵＢ 提 由
成 ， 初 步 筛 选 ， 定 ＵＢ ８ ６（ 物 序 列 ５， 经 确 Ｃ ３ 引 －
ＡＧ ＡＧ ＡＧ Ｇ Ａ Ｇ Ａ ＡＧ ＡＧＡ Ｇ － ’ 为 此 次 实 ＹＡ ３ ）
实验材料 采集 于武 汉植物 园 ， 料 由中南 民族 材 大学万 定荣教 授鉴 定． 摘幼嫩 叶 片后 迅 速置于 盛 采 有硅 胶 的密封塑 封袋 ， 叶片 干燥后 置于 一２ ℃低 温 Ｏ
治疗痢疾 、 炎 、 冒、 嗽 、 肝 感 咳 目赤 肿 痛 和 烧 烫 伤
等 症 状 ［ ．目前 ， 阔 叶 十 大 功 劳 组 织 形 态 ］ ７ ］ 对 、
分析 ．
关 键 词 ： 叶 十 大 功 劳 ； Ｓ Ｒ Ｐ Ｒ；正 交设 计 ；单 因 素 实 验 ； 传 多 样 性 阔 ＩＳ —Ｃ 遗
中 图 分 类 号 ：Ｒ ８ ． ２２７ 文献标识码 ： Ａ
论文简介模板定稿
大青叶SRAP扩增体系的建立与优化专业名称：制药工程学号：08580208 姓名：王亮指导教师：杨中铎职称：副教授摘要目的：建立并优化大青叶的SRAP-PCR扩增体系。
方法:先对单因素（酶浓度，dNTP浓度，引物浓度，Mg2+浓度）进行筛选，然后用正交实验确立最优体系。
结果：在50μL的反应体系中，,Taq 酶的浓度为 4 U, dNTP的浓度为 0.20mmol/L，引物的浓度为 0.60μmol/L，Mg2+的浓度为1.0 mmol/L 时SRAP-PCR反应体系带型清晰，稳定性好。
本研究建立的反应体系将为大青叶的种质资源鉴定及筛选与4（3H）喹唑酮含量相关的基因奠定基础。
关键词：大青叶；基因组DNA； SRAP分子标记Abstract：Objective: To establish and optimize the SRAP amplification system of Folium . methods : First, to design the single factor experiments ( enzyme concentration , dNTP concentration , primer concentration of Mg2 + concentration) , and then using the orthogonal experiment to establish the optimal system . Results: in total 50μL reaction system , the Taq enzyme concentration is 4 U , dNTP concentration is 0.20mmol / L , the concentration of the Primer is 0.60μmol / L and Mg2 + concentration is 1.0 mmol / L . Under this condition , the amplification pattern with rich polymorphism and clearband is obtained, and have a good stability. Establish the the Folium Optimizational amplification system , and the success of this experiment wil make the foundation for Folium the germplasm and screening and 4 ( 3H) quinazolinone high content related gene.Keywords: Folium Genomic DNA SRAP markers Orthogonal Optimization一、综述1.1 实验研究的背景大青叶是我国的传统中药，其味苦、性寒、归心、胃经。
优化pcr体系的方法
优化pcr体系的方法
优化PCR体系的方法有：
1. 优化引物设计：选择合适的引物序列，优化引物的浓度和比例，确保引物的特异性和互补性。
2. 优化反应条件：合理调整PCR反应的温度、时间和环节，比如优化退火温度、延长扩增时间等，以提高反应效率和特异性。
3. 优化酶的选择：选择适合的DNA聚合酶和其缓冲液，以提高PCR反应的效率和特异性。
4. 添加辅助物质：如DMSO、BSA等，可以改变反应体系的离子平衡，降低引物间的二级结构，增强PCR效果。
5. 优化反应体系中其他组分的浓度：如优化模板DNA、引物和dNTP等的浓度，以提高PCR反应的效率和特异性。
6. 引入热启动酶或热稳定酶：可以在PCR反应开始前抑制非特异性扩增，提高PCR的特异性。
7. 优化反应体系的pH值：调整PCR反应的pH值，使其适合DNA的变性和扩增过程。
8. 引入分析验证环节：如添加内参物质或设计阳性对照，进行验证实验，检测PCR反应的特异性和准确性。
9. 优化PCR反应后处理：如优化PCR产物的纯化方法、提高PCR产物的检测灵敏度，以提高PCR实验的质量和效果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Байду номын сангаас
第 １ 期
经
济
林
研
究
Ｖｏ ． ８ ＮＯ １ ２ ．１
Ｍ ａ ．２ ０ ｒ ０１
２１ ０ ０年 ３月
Ｎｏ ｎｗｏｏ Ｆｏｒ ｓ Ｒｃ ｅ ｒ ｈ ｄ ｅｔ ｓａｃ
红 松 Ｓ Ｒ— Ｃ 反 应 体 系 的 建 立 与 优 化 Ｓ Ｐ Ｒ
冯富 娟 ， 赵 丹 ， 晓 艳 ， 士 杰 许 小 妍 孙 韩 ，
ｎ ｅ ｌ ｓ ｔ ｍ ｐ ａ ｅ。ｔ ｅ ｅ ｆ ｃ ｓ ｏ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｆ ｔ ｍｐ ａ ｅ ＤＮＡ ，Ｍ ｇ ，ｄ ｅ ｄ ｅａ ｅ ｌｔ ｈ ｆｅ ｔ ｆｃ ｎ ｅ ｔａ ｉ ｓ ｏ ｅ ｌｔ ｏ ＮＴＰ ｓ，ｐ ｉ ｒ ａ ｄ Ｔａ ｏ ｙ ｒ ｓ ｎ ｒｍｅ ｎ ｑ ｐ ｌ ｍｅ ａ ｅ ｏ Ｓ Ｒ— ＣＲ ａ ｌ ｉａ ｉ ｎ ｗｅ ｅ ａ ａ ｙ ｅ ｙ ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｏ Ｓ Ｐ ｍｐ ｉ ｃ ｔｏ ｒ ｎ ｌ ｚ ｄ ｂ ｈ ｔ ｏ ｆＣＴＡＢ ｕ ｉ ｇ ｓｎ ｌ ｆ ｃ ｏ ｅ ｔａ ｄ ｏ ｔ ｏ ｏ ａ ｅ ｔ ｆＬ１（ ・ ｆ ｓｎ ｉ ｇ ｅ ａ ｔ ｒ ｔ ｓ ｎ ｒ ｈ ｇ ｎ ｌｔ ｓ ４ ） ｏ ６
ＦＥＮＧ ｕ ｎ Ｆｕ ｊａ ．Ｚ ＨＡＯ ｎ Ｄａ ．Ｓ ＵＮ ａ — ａ ，ＨＡＮ ｈ—ｉ。 Ｘｉｏ ｙ ｎ Ｓ ｉ ｅ ，ＸＵ ａ ａ ｊ Ｘｉｏ ｙ ｎ
（ ．ａ ｃ ｏ ｌ ｆｌ ｅｓｉｎ ｅ；ｂ ｃ ｏ ｌ ｆＦ ｒ ｓｒ １ ．Ｓ ｈ ｏ ｉ ｃｅ ｃ ｏ ｆ ．Ｓ ｈ ｏ ｏ ｅｔｙ，Ｎｏ ｔ ｅ ｓ ｒ ｓｒ ｉｅｓｔ ｏ ｒｈ ａ ｔＦｏ ｅ ｔｙＵｎｖ ｒｉｙ，Ｈａｂｎ １ ０ ４ ，Ｈｅｌｎ ｊ ｎ ｒ ｉ ５ ０ ０ ｉ ｇ ｉ ｇ，Ｃｈｎ ｏ ａ ｉａ；
中 图 分 类 号 ： Ｑ７ ； ７ １ ２ ７ ５￥ ９ ． ４ 文 献标 志码 ： Ａ 文章 编 号 ：１ ０ — ８ ８ （ ０ ０ ０ —０ ３ —０ ０ ３ ９ １ ２ １ ）１ ０ ５ ６
Ｅｓ ａ ｉ ｈ ｅ ｎｄ ｏ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｈｅ Ｓ Ｒ— ｔ ｂｌｓ ｍ ｎｔａ ｐｔｍ ｚ ｔｏ ｆ ｔ Ｓ ＰＣＲ ｅ ｃ ｉ ｎ ｒ ａ ｔｏ ｓ ｓ ｅ ｉ ｎｕ ｒ ｉ ｎ ｉ ｉ ｂ． ｅ Ｃ ． ｙ ｔ ｍ ｎ Ｐｉ ｓ ｋｏ ａ ｅ ｓ ｓ Ｓ ｅ ｔＺＵ Ｃ
（． １ 东北 林 业 大 学 ａ 生命 科 学 学院 ；． 学 院 ， ． ｂ林 黑龙 江 哈 尔滨 １ ０４ ； ５ ０ ０
２ 中 国科 学 院 沈 阳 应 用 生 态研 究 所 ， 宁 沈 阳 １ ０ １ ） ． 辽 １ ０ ６
摘 要 ： 为 了建 立 红 松 Ｓ Ｒ—Ｃ 最 佳 反 应 体 系 ， Ｃ Ｂ 法提 取 的 红 松 针 叶 ＤＮ 为 模 板 ， 用 单 因子 试 验 及 Ｉ Ｓ ＰＲ 以 ＴＡ Ａ 应 （ ｓ正 交试 验 系 统 分 析 了 Ｄ ４） ＮＡ 模 板 浓 度 、 浓 度 、 Ｎ ｓ浓 度 、 物 浓 度 、 ａ Ｍｇ ｄ ＴＰ 引 Ｔ ｑ酶 浓 度 等 对 Ｓ Ｒ Ｐ Ｒ 扩 增 结 果 的 Ｓ —Ｃ 影 响 ， 对 延 伸 时 间 、 循 环 参 数 进 行 了 探 讨 ， 立 了 稳 定 的 、 重 复 的 红 松 Ｓ Ｒ Ｐ Ｒ 最 佳 反 应 体 系 及 Ｐ Ｒ 扩 增 参 并 热 建 可 Ｓ —Ｃ Ｃ 数 。结 果 表 明 ，Ｃ 的最 佳 反应 体 系 为 ：Ｏ ｌ体 系 中 ， ×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ｒｌ Ｌ Ｄ ＰＲ １ ｌ Ｃ ｕｆ 、 ＮＡ 模 板 ５ ～ １ ｏｎ ， ３ｍｍ ｌＩ， ｅ Ｏ ２ ｇ Ｍｇ ｏ／ ｄ Ｐ ０ ４ｍｍｏ／ ， 物 ｏ ５ ｍｏ／ ， ａ ＮＴ ． ｌＩ 引 ． ｌＬ Ｔ ｑ酶 ０ ７ 。利 用 该 体 系筛 选 出 扩 增 条带 清 晰 、 态 性 丰 富 的 Ｓ Ｒ 引 物 １ ． ５Ｕ 多 Ｓ ３ 对 。在 此 反 应 体 系 下 ， 扩 增谱 带 清 晰 、 定 、 所 稳 多态 性 高 。 关 键 词 ： 红 松 ； Ｓ 优 化 ； 交设 计 ； 因子 试 验 Ｓ Ｒ； 正 单
２ Ｉ ｓ ｉｕｔ ｆＡ ｐｐｌ ｄ Ｅｃ ｌ ｇｙ，Ｃｈｉ ｓ ａ ｍ ｙ ｏｆＳｃｅ ｅｓ，Ｓｈｅ ａ ０ ６，Ｌｉｏｎｉ ． ｎ ｔｔ ｅ ｏ ｉ ｏｏ ｅ ｎｅ ｅ Ａｃ ｄｅ ｉｎｃ ｎｙ ｎｇ １１ ０１ ａ ｎｇ，Ｃｈ ｎ ｉ ａ）
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｉ ｄｅ Ｏ ｅ ｔ ｌｓ ｈｅ ｏｐ ｉ ａ ｓ ｒ ｃ ： ｎ ｏｒ ｒ ｔ ｓ ａｂ ｉｈ ｔ ｔｍ ｌＳＳＲ— ＰＣＲ ｅａ ｔｏｎ ｓ ｓ ｅ ｎ Ｐｉ ｕｓｋ ｒ ｅ ｓｓ，ｔ ｋｉ ｒ ｃ ｉ ｙ ｔ ｍ ｉ ｎ ｏ ａｉｎ ｉ ａ ｎｇ ＤＮ Ａ ｘｔ ａ ｔ ｄ ｆｏｍ ｅ ｒ ｃ ｅ ｒ
ａ ｈ ｘｔ ｎｓｏｎ ｔｍ ｅ ａ ｄ ｔ ｒ ｍ ｅ ｅ ｓｏ ｈｅ ｍ ａ ｙ ｌｎｇ ｗ ｅ ｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｅ ｎｄ ｔ ｅ ｅ ｅ ｉ ｉ ｎ ｈｅｐａ ａ ｔ ｒ ｆｔ ｒ ｌｃ ｃ ｉ ｒ ｅ ｅ ｒ ｈ ｄ． Ｔ ｈ ｔｍ ａ ｅ ｏｐ ｉ ｌＳＳＲ— ＰＣＲ ｅ ｔｏ ｙｓ ｅ ｒ ａｃｉ ｎ ｓ ｔ ｍ ａ ｔ ｅ ｎｄ ｈ ａｍ ｐｌ ｉａｔｏｎ ａ ａ ｅ ｅｒ ｗ ｅ ｅ ｓ ａｂｌ ｈｅ ｉ ｃ ｉ ｐ ｒ ｍ ｔ ｓ ｆ ｒ ｅ ｔ ｉ ｄ， ａ ｔ ｓ ｓ ｅ ｗａｓ ｔ ｂｌ ａｎ ｒ ｐ ａｔ ｂｌ Ｔｈｅ ｓ ｎｄ ｈｅ ｙ ｔ ｍ ｓ ａ ｅ ｄ ｅ ｅ ａ ｅ． ｏｐｔｍ ａｌ ｉ ＰＣＲ