米曲霉培养及蛋白酶分析
米曲霉的蛋白酶活力测定
米曲霉的蛋白酶活力测定：
紫外分光光度法：
0．4mol/L三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。
pH7.2磷酸缓冲溶液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（A 液）
称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（B液）。
取A液28ml和B 液7.2ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲溶液。
2％酪蛋白溶液：称取酪蛋白2g，加入0.1mol/L氢氧化钠20ml，在水浴中加热溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至1000ml即成。
配置后应及时使用或放冰箱保存。
蛋白酶活力测定：取试管两只，编号1，2，3，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。
时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。
继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。
取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。
空白实验也是取试管3支，编号，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L 三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。
为了清楚起见，参看下表：
计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力单位＝A/10×11×N。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅林巧赵树东杨柳炜邓远均侯云境来源：《现代食品·上》2019年第03期摘要：本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化，分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明：蔗糖27g·L-1，硝酸钠2.5g·L-1，硫酸镁（MgSO4.7H20）0.6g·L-1，初始pH6.5，在30°C的环境下培养72h后，米曲霉生长得最好。
关键词：米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化中图分类号：TS201米曲霉（Aspergillusoryzae）是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一，其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
酱油的生产过程一般是原料处理、制曲、发酵、浸出淋油、加热灭菌、检测、包装等，在这些过程中，涉及各种微生物的作用。
因而近年来，越来越多的研究者对酱油酿造中的微生物群落进行研究，其中，霉菌是人们首要的研究对象，霉菌就有米曲霉、黑曲霉、红曲霉等。
米曲霉更是酱油酿造过程中的重中之重，它拥有极强分解蛋白质的能力和糖化淀粉的能力，在酿造酱油的过程中，就是用种曲培养米曲霉，等米曲霉不断繁殖大量后就会分泌出各式各样的酶，其中最多也最重要的就是淀粉酶和蛋白酶”。
鉴别产品品质、提高原料利用率及降低生产成本基本上是以把酶活性的高低作为参考之一。
实际上，提高米曲霉产蛋白酶活力不仅仅能够使原料的利用率得到提高，而且能够降低在酿造过程中对环境产生不良影响的概率，在工厂实际生产发挥了十分重要作用。
提高米曲霉产蛋白酶活力可以通过优化米曲霉培养基组成和培养条件实现。
1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种米曲霉3.042，由四川省生生酱园食品有限公司分离出的一株高产米曲霉。
1.1.2主要仪器及试剂电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）、乐祺电子天平（上海瑶新电子科技有限公司）、手提式不锈钢压力蒸气灭菌器、生物显微镜B204LED（重庆奥特光学仪器有限公司）、电热恒温隔水式培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）、游标卡尺、苏净安泰洁净工作台、电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、四门双机双温冷柜（产品型号：QBSL-09S，耗电量5.0kW）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
米曲霉F_81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
・研究报告・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2010年第4期米曲霉F 281菌株产中性蛋白酶的分离纯化汤鸣强 曾小芳(福建师范大学生物与化学工程系,福清350300) 摘 要: 对米曲霉菌种F 281所产中性蛋白酶进行分离纯化。
经过硫酸铵分级沉淀,DE AE 2Sephar ose Fast Fl ow 阴离子交换层析和Sephacryl 2S200凝胶过滤层析后,得到一种电泳纯的中性蛋白酶,纯化倍数为2613倍,活性回收率为617%。
经S DS 2P AGE 电泳测定其相对分子质量约为7314k D 。
关键词: 米曲霉 中性蛋白酶 分离纯化Studi es on Separati on and Pur i fi cati on ofNeutral Protease fro m Aspergillus oryae F 281Tang M ingqiang Zeng Xiaofang(D epart m ent of B iology and Che m istry Engineering,Fuqing B ranch of Fujian N or m al U niversity,Fuqing 350300) Abs trac t: The separati on and purificati on of a neutral p r otease fr om A spergillus oryae F 281was studied .A single neutral p r oteasewas purified t o homogeneity using a mmoniu m sulfate p reci p itati on,DE AE 2Sephar ose Fast Fl ow ani on exchange chr omat ography and sephacryl 2S200gel filtrati on .This purificati on p r ot ocol resulted in a 2613fold purificati on of neutral p r otease with 617%final yield ,and the relative molecular weight of the enzy me was deter m ined t o be app r oxi m ately 7314k D using S DS 2P AGE .Key wo rd s: A spergillus oryae Neutral p r otease Separati on and purificati on收稿日期:2009212213作者简介:汤鸣强,男,理学硕士,副教授,研究方向:生化与微生物;E 2mail:mqt -1022@中性蛋白酶作用条件温和,是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂[1],可应用于食品、制药、化妆品以及丝纺等行业[2]。
米曲霉胞链接与发酵液中蛋白动态变化的研究
米曲霉发酵液中蛋白动态变化的研究冯广莉，刘洪伟，许喜林，李晓凤（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）摘要：本文利用葡萄糖和吐温80作为额外碳源培养米曲霉，对其生物量积累，胞链接蛋白以及发酵液蛋白随培养时间的变化情况进行了研究。
以葡萄糖作为额外碳源时，米曲霉生物量积累速度较快，在培养24 h已达最大值，为31.97 g/L；当米曲霉以吐温80基金项目：国家自然科学基金资助项目（20906031、31270636）；广东省教育厅科技创新项目(2012KJCX0006)；新世纪优秀人才支持项目(NCET-12-0192)作者简介：冯广莉（1988-），女，硕士研究生，现从事全细胞催化方面的研究通讯作者：李晓凤（1977-），女，博士，副研究员，现研究方向为全细胞催化及食品安全检测篇。
胞链结脂肪酶比纯酶在有机相催化体系中具有稳定好、催化效率高、廉价和易于操作的优点。
研究表明米曲霉细胞具有催化核苷类物质合成的作用[12]，在以tween80作为额外碳源时大量产生胞连接和细胞质脂肪酶，分子量分别为27 kDa与36 kDa[13]，本文主要利用葡萄糖和吐温80作为额外碳源对米曲霉生物量积累，胞链接蛋白以及发酵液蛋白随培养时间的变1832化情况进行研究，并且分析胞连接蛋白、发酵液蛋白与生物量累积之间的关系。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1化学试剂丙酮，广东化学试剂工程技术研究开发中心，分析纯；正己烷，江苏强盛化工有限公司，分析纯；Tricine，翔博生物公司；Tris-HCl，上海缘聚生物技术有限公司。
酚试剂、盐酸、氯化镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、乙酸、吐温80、三氯乙酸、溴酚蓝、β-巯基乙醇、丙烯酰胺、TEMED均为市售分析纯。
1.1.2 主要仪器设备电泳仪，DYY-6C，北京六一仪器厂；全温摇瓶柜：HYG-A太仓市实验设备厂；手提式压力蒸汽消毒器YX-280 B：广州永程实验仪器有限公司；光学显微镜：上海，xsp-3 CA 1；低温水浴培养箱：LSHZ-300太仓市试验设备厂；紫外分光光度计：Spectumlab 752 s紫外可见光分光光度计。
固态发酵-米曲霉的培养及蛋白酶
1.在扎瓶口时，我们组并不使用棉绳，而是橡皮 筋
2.过滤时，滤液的体积不一
3.比色皿表面的光滑程度影响了 结果
Thanks
2.编号试管1,2为空白试管，3,4试 管为样品试管 3.空白试管中加入2ml三氯乙酸， 40℃保温20min，然后加入1ml酪蛋 白在40℃中保温10min，样品试管加 入顺序相反
溶液分别过滤到新的试管中
样品
加入淀粉 加入葡萄糖 加入蔗糖 加入面粉 空白对照
粗酶液体积 （mL） 84.7 85.0 75.3 83.1 84.0
三、实验步骤
1. 实验室保藏的米曲
霉菌种接种PDA斜面， 30 ℃恒温培养3d。
• 此处为培养3天的米曲
霉
2. 新鲜斜面加6ml无菌 水制成孢子悬液，吸取 1ml的孢子悬液分别接 种到5种固态培养基中 （250 mL三角瓶装）
• 图示为未接种孢子的培养基
图示为接种孢子的培养 基
30 ℃恒温培养3 d成曲（每培养 8~12 h摇瓶1次）， 米曲霉培养物提 取制得粗酶液
左图为8小时摇瓶后，右图 为72小时
准确称取5 g充分研细的 成曲，按加水比1：20加 入蒸馏水，40℃水浴内间 断搅拌30分钟，滤纸过滤， 滤液即为粗酶液，用量筒 准确测量粗酶液的体积V （mL）。取1ml粗酶液用 0.1 mol/L pH7.2的磷酸 缓冲液稀释10倍后测酶活 力。
图示为过滤的粗酶液
活力来说，在葡萄糖培养基中的酶活力最高， 淀粉培养基的酶活与其相近；而蔗糖培养基， 面粉培养基，只有麦麸和豆粕的培养基酶活力 比其它的极显著降低。
• 我们可以得出：额外添加营养物质可以提高酶
活产率，而单糖和二糖比多糖对米曲霉产酶更 为有利。
• 问题讨论
高产蛋白酶米曲霉培养条件的研究8...
摘要蛋白酶是活细胞产生的生物催化剂，应用十分广泛；米曲霉具有丰富的蛋白酶系，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会公布的安全微生物菌株之一，也是国内酱油等发酵食品生产的主要菌株。
因此，提高米曲霉的蛋白酶活力对于发展轻工业、提高产品质量有重要意义。
本论文利用米曲霉沪酿3.042为出发菌株，通过紫外诱变筛选出一株中性蛋白酶活力较高的菌株，命名为米曲霉UV-16。
该菌株的遗传稳定性较好，并将出发菌株的中性蛋白酶活力由1996.5 U·g-1提高到2368.0 U·g-1，蛋白酶活力提高了18.6%。
实验对米曲霉UV-16的酶系进行了研究，发现该突变株其他酶系基本没发生改变。
实验研究了基质组分和发酵条件对米曲霉UV-16产中性蛋白酶的影响，通过单因素实验，我们确定了麸皮为碳源，豆粕为氮源，豆粕添加量20%，KNO3添加量0.8%，MgSO4添加量0.07%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，温度28℃，加水量为原料量的85%，发酵时间70h，pH自然，并且发现FeSO4对产酶有抑制作用。
经过单因素实验，蛋白酶活提高到2707.8U·g-1，酶活力在诱变的基础上提高了14.3%。
单因素实验后，对加水量、培养温度、培养时间、豆粕添加量、KNO3、MgSO4利用响应面分析法精确找出最优条件。
通过PB实验，确定了培养时间和豆粕添加量为主要影响因素；通过最陡爬坡实验，找到了响应面实验的中心点；再通过中心组合实验，确定了最佳的培养条件：培养基加水量为87%，豆粕添加量23.37%，KNO3添加量0.7%，MgSO4添加量为0.08%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，培养温度为29℃，培养时间67h。
米曲霉UV-16产中性蛋白酶的能力达到2824.9U·g-1，蛋白酶活力再次提高4.3%。
米曲霉
1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
米曲霉米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化摘要：对米曲霉（Aspergillus oryaze）GN-2菌株产中性蛋白酶固体发酵的条件进行优化。
单因素试验结果表明，米曲霉的固体适宜发酵条件为发酵原料麸皮∶豆粉为4∶1（质量比，下同），培养时间60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 mL，接种量1×106个/mL孢子悬液2.0 mL，培养基起始pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4溶液1 mL。
正交试验结果表明，在温度25 ℃、加水量20 mL、麸皮∶黄豆粉为4∶1、培养时间72 h的条件下酶活力最高，达1 016.9 U/g。
关键词：米曲霉（Aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件中图分类号：TQ925；Q93-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease fromAspergillus oryzae GN-2 StrainHUANG Yan，JU Lu-ning（Minbei V ocational and Technical College，Nanping 353000，Fujian，China）Abstract：The optimal solid fermentation conditions ofneutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1，fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 mL，inoculum amount 2.0 mL 1×106 spores/mL spore suspension，the initial medium pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃for 72 h，water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1，with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.Key words：Aspergillus oryzae；neutral protease；enzyme production conditions中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
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米曲霉培养及蛋白酶的分析
•实验目的及要求：通过固态三角瓶培养米曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。
•实验原理：
固态培养方法（ solid state cultivation ）：主要有散曲法和块曲法。
部分黄酒用曲，红酒及酱油米曲霉培养属散曲法，而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸热的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲；转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中。
固态培养微生物，主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母也可采用此法。
其主要优点是节能，无废水污染。
单位体积的生产效率教高。
米曲霉（ Aspergillus oryzae ）属于曲霉菌（ Aspergillus ）。
菌落初为白色，黄色，既而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
•实验过程：
•米曲霉菌种的纯化，制成斜面，将斜面菌种接入 250ml 三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养
（ 500ml ）三角瓶。
培养物经过水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活性测定。
•米曲霉培养：本实验分为斜面培养和三角瓶培养两个阶段。
三角瓶培养物在工厂中作为一级种子。
试管斜面培养基：豆饼浸出汁： 100 克豆饼，加水 500ml ，浸泡 4 小时，煮沸 3-4 小时，纱布自然过滤，取液，调整至 5 波美度。
没 100ml 豆汁加入可溶性淀粉 2 克，磷酸二氢钾 0.1 克，硫酸镁 0.05 克，硫酸铵 0.05 克，琼脂 2 克，自然 pH 。
或采用马铃薯培养基：马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 15-20 克，加水至 1000ml ，自然 pH 。
三角瓶培养基制备：
米曲霉的培养基： 1 ：麸皮 40 克，面粉（或小麦） 10 克，水 40ml 。
2 ：豆粕粉 40 克，麸皮 36 克，水 44ml 。
装料厚度： 1cm 左右；
灭菌：120 ℃，30min；
接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度，湿度，装料量，基质水分含量。
固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的，实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂中则是原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。
这点与液态发酵是不同的。
28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔8小时检查一次，并摇瓶。
培养时间一般为72小时。
3. 实验仪器、设备很材料
恒温培养箱或者固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板和 500ml 三角瓶等。
4. 实验分析项目和方法
米曲霉蛋白酶活力的测定方法
（ 1 ）称取充分研细的成曲 5g ，加入 100ml 蒸馏水，40 ℃水浴不间断搅拌20分钟，使其充分溶解。
然后用干纱布过滤。
吸取滤液1ml，用适当的缓冲液（0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液）稀释一定的倍数（如10、20、或者30倍）。
（ 2）绘制标准曲线
A、取试管7支，编号，按照下表加入试剂。
单位：ml
B 、摇匀，置于40 ℃恒温水浴中显色20分钟。
C、用分光光度计在波长为660nm处测定OD值。
D、以光吸收值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（ 3 ）蛋白酶活性的测定
A 、取试管三支，编号，每管中加入酶样品稀释液 1ml ，40 ℃水浴锅中预热2分钟，再加入同样预热的
1.0%酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后过滤。
B、同时另做一对照试管，取酶样品稀释液1ml，三氯乙酸2ml，摇匀，然后再加入1.0%酪蛋白1ml，保温十分钟，保温放置20分钟，过滤。
C、然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加入0.4mol/L的碳酸钠5ml，以中和剩余的三氯乙酸，已稀释的福林试剂1ml摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。
同时另取两管做B滤液对照和蒸馏水空白对照。
（ 4）计算
在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位。
样品蛋白酶活力
单位（湿基）=( A×4n) /(10×5)
A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
4 ： 4ml 反应液取出 1ml 测定；
n ：稀释倍数；
10 ：反应十分钟。
•实验数据处理及图表绘制：
（ 1 ）标准曲线数据：
试管号0 1 2 3 4 5 6
浓度（μg /ml ）0 10/7 20/7 30/7 40/7 50/7 60/7
OD 值 0 0.065 0.166 0.269 0.392 0.450 0.606
（ 2 ）样品数据：
（ 3 ）标准曲线：。