鹅掌楸属植物总RNA提取方法的比较与分析

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植物和动物总RNA 的提取及Northern 杂交

植物和动物总RNA 的提取及Northern 杂交1 概述真核细胞的RNA 主要由rRNA （包括28S 、18S 和5S rRNA ，占RNA 总量的80 %~ 85 %）、tRNA 及小分子RNA （占10％~15 %）和mRNA （占1%~5%）组成。

高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern 杂交、cDNA 合成等。

提取RNA 时最关键的因素是尽量避免RNA 酶的污染。

RNA 酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNA 酶外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNA 酶。

这类酶耐热、耐酸、耐碱，煮沸也不能使之完全失活，而且其活性亦无需辅助因子，但蛋白质变性剂可使其暂时失活。

本实验所使用的TRIZOL 试剂盒中主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。

异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，可抑制RNA 酶活性；而苯酚不仅可使蛋白质和核酸解聚，亦可使蛋白质变性从而抑制RNA 酶活力。

在裂解样品过程中，TRIZOL 试剂在破坏细胞和溶解细胞成分的同时可以保持RNA 的完整性；其后加入氯仿并离心，使溶液分离成水相和有机相，RNA 完全保持在水相；转移出水相后，RNA 可用异丙醇进行沉淀回收。

为尽量防止RNA 酶污染，在实验中应注意以下几点。

① 始终戴一次性手套，防止皮肤携带的细菌和霉菌污染RNA 制品，同时采用适当的微生物无菌操作技术以防止微生物污染。

② 使用灭菌的一次性塑料制品以防止来自共用设备的交叉污染。

③ 玻璃器皿、研钵等应在160～180℃的高温下烘烤4h 。

④ 塑料制品用含0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC ）的水溶液浸泡过夜，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃下烘烤15min ，再高压蒸汽灭菌15min ，以除去器皿上痕量的DEPC ，避免DEPC对RNA 的嘌呤碱基进行修饰。

DEPC 是很强的RNA 酶抑制剂，其作用机制是通过与蛋白质中组氨酸结合而使蛋白质变性。

北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析

㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｊｕｌ.２０２０ꎬ４０(７):９９８－１００９ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９０８００３刘换换ꎬ杨立春ꎬ张成阁ꎬ等.北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析[Ｊ].广西植物ꎬ２０２０ꎬ４０(７):９９８－１００９.ＬＩＵＨＨꎬＹＡＮＧＬＣꎬＺＨＡＮＧＣＧꎬｅｔａｌ.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＰＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅｉｎＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２０ꎬ４０(７):９９８－１００９.北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析刘换换ꎬ杨立春ꎬ张成阁ꎬ郝自远ꎬ李火根∗(南京林业大学ꎬ南方现代林业协同创新中心ꎬ南京２１００３７)摘㊀要:ＣＰＰ(ｃｙｓｔｅｉｎ￣ｒｉｃｈｐｏｌｙｃｏｍｂ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｏｒＴｅｓｍｉｎ/ＴＯＳ１￣ｌｉｋｅ)家族属于成员数目较少的一类转录因子基因家族ꎬ含有保守的富含Ｃｙｓｔｅｉｎ的ＣＲＣ结构域ꎬ在植物发育进程中ꎬ主要参与花发育㊁细胞分裂㊁分子进化等ꎮ为了探索ＣＰＰ转录因子家族在北美鹅掌楸花发育中的作用ꎬ该文以北美鹅掌楸(Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ)为材料ꎬ采用ＲＡＣＥ技术克隆出１个ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因ꎬ命名为ＬｔＴＣＸ２ꎬ全长２８６６ｂｐꎮ通过ＮＣＢＩ网站在线分析ꎬＯＲＦ长２４２４ｂｐꎬ编码了８０７个氨基酸ꎬ含２个保守的ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅＣＸＣ结构域ꎬ分子量为８８６９９.２５Ｄａꎬ理论等电点为５.８３ꎬ不稳定系数为６２.３８ꎬ疏水性平均值为－０.６１９ꎬ预测为亲水性蛋白㊁非跨膜蛋白㊁核蛋白ꎬ不含信号肽及切割位点ꎮ氨基酸比对及系统进化分析结果显示ꎬＬｔＴＣＸ２与其他物种的ＣＰＰ家族ＴＣＸ蛋白具有较高的同源性ꎬ与亚洲莲(Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ)的ＮｎＴＣＸ２㊁胡杨(Ｐｏｐｕｌｕｓｅｕｐｈｒａｔｉｃａ)的ＰｅＴＣＸ２进化关系最近ꎮ荧光定量ＰＣＲ结果显示ꎬＬｔＴＣＸ２基因在叶片中表达量最高ꎬ在萼片㊁花瓣中几乎不表达ꎬ表达量由高至低如下:叶片㊁花芽㊁雌蕊㊁雄蕊㊁茎㊁根㊁花瓣㊁萼片ꎮ以上结果说明ꎬＬｔＴＣＸ２属于较古老㊁保守的一类基因ꎬ可为从分子生物学层面研究鹅掌楸属植物系统进化提供一定的理论依据ꎮ关键词:北美鹅掌楸ꎬＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族ꎬＬｔＴＣＸ２基因ꎬＣＲＣ结构域ꎬ组织特异性表达中图分类号:Ｑ９４３㊀㊀文献标识码:Ａ文章编号:１０００￣３１４２(２０２０)０７￣０９９８￣１２开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＰＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅｉｎＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａＬＩＵＨｕａｎｈｕａｎꎬＹＡＮＧＬｉｃｈｕｎꎬＺＨＡＮＧＣｈｅｎｇｇｅꎬＨＡＯＺｉｙｕａｎꎬＬＩＨｕｏｇｅｎ∗(Ｃｏ￣ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＦｏｒｅｓｔｒｙｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａꎬＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００３７)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＣＰＰ(Ｃｙｓｔｅｉｎ￣ｒｉｃｈｐｏｌｙｃｏｍｂ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｏｒＴｅｓｍｉｎ/ＴＯＳ１￣ｌｉｋｅ)ｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙａｒｅｏｎｅｋｉｎｄｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｉｔｈｆｅｗｅｒｍｅｍｂｅｒｓａｎｄｐｏｓｓｅｓｓａｃｏｎｓｅｒｖｅｄꎬＣｙｓ￣ｒｉｃｈＣＲＣｄｏｍａｉｎｓ.ＣＰＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｐｌａｙｓａｎ收稿日期:２０１９－１０－１７基金项目:国家自然科学基金(３１７７０７１８ꎬ３１４７０６６０)ꎻ江苏省高校优势学科项目(ＰＡＰＤ)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１７７０７１８ꎬ３１４７０６６０)ꎻＰｒｉｏｒｉｔｙＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｏｇｒａｍＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＪｉａｎｇｓｕＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ(ＰＡＰＤ)]ꎮ作者简介:刘换换(１９９１－)ꎬ女ꎬ江苏徐州人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事林木遗传育种研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｈｈ９１＠ｆｏｘｍａｉｌ.ｃｏｍꎮ∗通信作者:李火根ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为林木遗传育种ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｈｇｌｉ＠ｎｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅａｎｄｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａＣＰＰ￣ｌｉｋｅｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＡＣＥｍｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａｎａｍｅｄＬｔＴＣＸ２ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＴｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆＬｔＴＣＸ２ｗａｓ２８６６ｂｐ.ＬｔＴＣＸ２ｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ(ＯＲＦ)ｏｆ２４２４ｂｐꎬｅｎ￣ｃｏｄｉｎｇ８０７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｗｉｔｈｔｗｏｃｏｎｓｅｒｖｅｄＴＳＯ１￣ｌｉｋｅＣＸＣｄｏｍａｉｎｓｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｎＮＣＢＩｓｉｔｅ.Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ８８６９９.２５Ｄａꎬｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｗａｓ５.８３ａｎｄｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｗａｓ６２.３８.ＬｔＴＣＸ２ｗａｓｐｒｅ￣ｄｉｃｔｅｄｔｏｂｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｏｕｔｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＬｔＴＣＸ２ｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒＣＰＰ￣ｌｉｋｅｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｗａｓｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＮｎＴＣＸ２ｉｎＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａａｎｄＰｅＴＣＸ２ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｅｕｐｈｒａｔｉｃａ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｌｅａｆａｎｄｈａｒｄｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｓｅｐａｌａｎｄｐｅｔａｌ.Ｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｄｅｒｆｒｏｍｈｉｇｈｔｏｌｏｗｗａｓｔｈａｔｔｈｅｌｅａｆꎬｆｌｏｗｅｒｂｕｄꎬｐｉｓｔｉｌꎬｓｔａｍｅｎꎬｓｔｅｍꎬｒｏｏｔꎬｐｅｔａｌａｎｄｓｅｐａｌ.Ｔｈｅｓｅｒｅ￣ｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＬｔＴＣＸ２ｉｓａｒａｔｈｅｒｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｇｅｎｅａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓｅｖｅｒａｌｈｅｌｐｔｏｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｒｉｏ￣ｄｅｎｄｒｏｎｐｌａｎｔｓｆｒｏｍｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｌｅｖｅｌ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａꎬＣＰＰ￣ｌｉｋｅｆａｍｉｌｙꎬＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅꎬＣＲＣｄｏｍａｉｎꎬｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ蛋白是一类广布于生物中㊁成员较少的转录因子ꎬ目前未在酵母中发现ꎮＣＰＰ家族基因具有１~２个高度保守㊁富含半胱氨酸Ｃｙｓ的ＣＸＣ结构域Ｃ１和Ｃ２(ｐｆａｍ０３６３０８ꎬＣＸ￣ＣＸ４ＣＸ３ＹＣＸ￣ＣＸ６ＣＸ３ＣＸＣＸ２Ｃ)ꎬ以及连接二者㊁长度可变的保守的Ｒ序列(ＲＮＰＸＡＦＸＰＫ)ꎬ３段保守序列即构成保守的ＣＲＣ结构域(Ｃ１￣ＲＮＰＸＡＦＸ￣ＰＫ￣Ｃ２)(Ｓｏｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０００ꎻＡｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ.ꎬ２００７)ꎮＣＰＰ家族基因主要集中于动物方面的调控研究ꎬ在植物中的功能研究较少(闵浩巍ꎬ２０１３)ꎬ在植物中主要参与细胞分化㊁繁殖器官发育ꎮＬｉｕｅｔａｌ. (１９９７)首次在拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)中获得的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因是ＴＳＯ１ꎮＴＳＯ１是一种核蛋白ꎬ在花器官中高度表达ꎬ调控细胞分裂与细胞膨大(Ｈａｕｓｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８)ꎮ通过对ｔｓｏ１突变体的研究ꎬ该基因对细胞的方向性增长发挥作用ꎬ并影响到有丝分裂和胞质分裂ꎬ说明ＴＳＯ１基因对拟南芥花器官的形成是必需的ꎬ推测其可能是编码花器官细胞分裂的重要元件(Ｌｉｕｅｔａｌ.ꎬ１９９７ꎻＨａｕｓｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８ꎬ２０００)ꎮ随后ꎬ在大豆(Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ)中发现了１个ＣＰＰ１蛋白ꎬ发现其参与共生根瘤中ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ基因调控(Ｃｖｉｔａｎｉｃｈｅｔａｌ.ꎬ２０００)ꎮ目前已陆续在大豆㊁水稻(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)㊁小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ)㊁玉米(Ｚｅａｍａｙｓ)等植物中发现ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因ꎬ并对它们的功能进行了一些探索(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２００８ꎻ王凯ꎬ２０１０ꎻ孟超敏等ꎬ２０１４ꎻＺｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１５ꎻＳｏｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１６ꎻ潘冉冉等ꎬ２０１８)ꎮ水稻和拟南芥ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族都具有高度保守的ＣＲＣ结构域ꎬ单子叶和双子叶植物分化之前ꎬＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因发生过大幅度的扩张ꎬ分化完成后ꎬ二者的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因按照物种特异性的方式进行了扩张ꎬ拟南芥存在基因丢失现象ꎬ而两段ＣＸＣ结构域及Ｒ序列则是协同进化(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２００８ꎻ王凯ꎬ２０１０)ꎮ目前ꎬ对ＣＰＰ转录因子在单子叶和真双子叶植物中的少数模式植物中进行了初步的进化分析ꎬ对该家族在基部被子植物中的进化过程尚待探索与研究ꎮ鹅掌楸属(Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ)隶属于木兰科(Ｍａｇ￣ｎｏｌｉａｃｅａｅ)ꎬ是第四纪冰川作用后的孑遗植物ꎬ自然散落分布ꎮ鹅掌楸属植物是基部被子植物系的典型植物ꎬ在植物进化发生系统中具有特殊地位ꎬ且保存了许多花部器官原始特征ꎬ是研究开花植物进化进程的理想树种(Ｒｏｎｓｅｅｔａｌ.ꎬ２００３ꎻＺａｈｎｅｔａｌ.ꎬ２００５)ꎮ鹅掌楸属主要包括两个种ꎬ鹅掌楸(Ｌ.ｃｈｉｎｅｎｓｅ)和北美鹅掌楸(Ｌ.ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ)(Ｐａｒｋｓｅｔａｌ.ꎬ１９８３)ꎮ北美鹅掌楸和鹅掌楸有着相似的外形ꎬ但要比鹅掌楸高大ꎬ花色丰富ꎬ花型优美ꎬ且属于典型的蜜源植物ꎬ具有重要的生态和经济效益ꎬ是北美地区最大且观赏性优良的树种之一(Ｂｅｃｋꎬ１９９０)ꎮ北美鹅掌楸相比于其他树种ꎬ不需要精细的管理ꎬ很少受到病虫害的侵害ꎬ对金属毒害也有一定的防御功能ꎬ是优良的园林绿化树种(Ｋｌｕｇｈ９９９７期刘换换等:北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析ｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎮ本文选择基部被子植物中的北美鹅掌楸为材料ꎬ采用ＲＡＣＥ法克隆出ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族ＬｔＴＣＸ２基因ꎬ并对其组织特异性表达和生物信息学进行分析ꎬ以期为后人研究北美鹅掌楸ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因㊁花的发育调控提供一定的研究理论基础ꎻ结合ＬｔＴＣＸ２基因的系统进化分析ꎬ初步探索该基因在植物中的理论进化过程ꎬ以期为鹅掌楸属植物在被子植物中的地位提供分析生物学层面的新思路及依据ꎮ１㊀材料与方法１.１材料与试剂材料:北美鹅掌楸选自位于江苏省镇江市句容下蜀的南京林业大学实习林场基地鹅掌楸属种源试验林ꎬ均为成年ꎬ树龄为２７ａꎮ试验林营建于１９９３年ꎬ地理位置为１１９ʎ１４ᶄＥ㊁３１ʎ５９ᶄＮꎮ采集北美鹅掌楸新鲜的花芽㊁根㊁茎㊁叶㊁萼片㊁花瓣㊁雄蕊㊁雌蕊ꎬ做好标记ꎬ迅速置于液氮中ꎬ带回实验室ꎬ存于－８０ħ超低温冰箱中保存ꎮ试剂:多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司ꎻ巯基乙醇购自上海捷瑞生物工程有限公司ꎻｐＥＡＳＹ￣ＢｌｕｎｔＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ克隆载体试剂盒㊁ＥａｓｙＰｕｒｅＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ切胶回收试剂盒㊁大肠杆菌菌株Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１ｐｈａｇｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ感受态㊁Ｘ￣ｇａｌ㊁核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ均购自北京全式金生物技术有限公司ꎻＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ(ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ)㊁ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥ５ᶄ/３ᶄＫｉｔ和３ᶄ￣ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔｗｉｔｈＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐＲＴａｓｅＫｉｔ均购自ＴＡＫＡＲＡ公司ꎻＤＮＡＭａｒｋｅｒ㊁ＧｒｅｅｎＴａｑＭｉｘ㊁ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｒｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ均购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎻ琼脂糖Ａｇａｒｏｓｅ购自北京擎科生物技术公司ꎻ无水乙醇等其他化学试剂均为国产或进口分析纯ꎮ１.２北美鹅掌楸组织总ＲＮＡ提取及反转录北美鹅掌楸根㊁茎㊁叶等组织的总ＲＮＡ提取主要按照多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒(离心柱型)说明书进行ꎬ所得产物于－８０ħ超低温冰箱中保存ꎮＲＮＡ完整性使用１％凝胶电泳检测ꎬ若２８Ｓ和１８ＳｒＲＮＡ两条带亮度为１.５~２倍ꎬ无弥散片状㊁条带消失ꎬ则说明ＲＮＡ完整性较好ꎮＲＮＡ浓度检测使用微量分光光度计(ＮＡＮＯＤＲＯＰ２０００ꎬＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司)ꎬ若ＯＤ２６０/２８０㊁ＯＤ２６０/２３０比值处于１.８~２.１之间ꎬ说明ＲＮＡ质量较好ꎮ反转录采用１０μＬ体系ꎬ反转录酶５ˑＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ加入２μＬꎬＲＮＡ使用５００ｎｇꎬｄｄＨ２Ｏ补足１０μＬꎬ轻柔混匀ꎮ反转录反应条件:３７ħ反应１５ｍｉｎꎬ８５ħ反转录酶失活５ｓꎬ４ħ终止反应ꎬ所得即为ｃＤＮＡ第一条链ꎬ用作克隆目的基因中间片段的模板ꎬ－２０ħ保存备用ꎮ３ᶄＲＡＣＥ㊁５ᶄＲＡＣＥ所使用的ｃＤＮＡ分别参照３ᶄ￣ＦｕｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔｗｉｔｈＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐＲＴａｓｅＫｉｔ㊁ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥ５ᶄ/３ᶄＫｉｔ说明书进行ꎮ１.３引物合成与测序所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成ꎬ测序由上海杰李生物技术有限公司完成ꎮ１.４北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２基因全长克隆在本实验室的北美鹅掌楸转录组测序数据库中根据ＮＲ功能注释ꎬ挑选一条ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅ的ｕｎｉｇｅｎｅꎬ基因ＩＤ为ｃ１０８０７８.ｇｒａｐｈ＿ｃ０ꎬ共３１７４ｂｐꎮ使用Ｏｌｉｇｏ７设计中间片段引物ꎬ以ｃＤＮＡ为模板ꎬ高保真酶为ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｒｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ配制５０μＬ体系的反应液ꎮＰＣＲ反应程序:９５ħ预变性３ｍｉｎꎬ９５ħ变性１５ｓꎬ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸６０ｓ/ｋｂꎬ３５个循环ꎬ７２ħ彻底延伸５ｍｉｎꎬ４ħ终止反应ꎮ使用１.５％琼脂凝胶电泳检测ＰＣＲ产物ꎬ１２０Ｖ电压电泳４０ｍｉｎꎬ于凝胶成像仪中拍照并切下含有目的片段的凝胶ꎬ参照ＥａｓｙＰｕｒｅＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ说明书进行目的片段回收ꎮ将目的片段连接到ｐＥＡＳＹ￣Ｂｌｕｎｔ载体中ꎬ并转化大肠杆菌Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１感受态细胞ꎬ均匀涂在加入抗生素的ＬＢ平板上ꎬ３７ħ过夜培养ꎬ进行蓝白斑筛选ꎬ对８个菌落进行ＰＣＲ检测ꎬ使用Ｍ１３通用引物ꎬ挑选３个片段大小正确的阳性菌落送至公司测序ꎮ获得正确的中间片段后ꎬ设计３ᶄＲＡＣＥ㊁５ᶄＲＡＣＥ引物ꎬ采用巢式ＰＣＲ扩增ꎬ反应体系㊁ＰＣＲ条件㊁连接转化㊁菌落检测与中间片段扩增相同ꎮ将中间片段㊁３ᶄＲＡＣＥ㊁５ᶄＲＡＣＥ所得序列使用ＢｉｏＸＭ２.６软件进行拼接ꎬ获得基因０００１广㊀西㊀植㊀物４０卷全长ꎬ将全长序列于ＮＣＢＩ数据库中的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ网站进行在线预测ＯＲＦꎬ在起始密码子和终止密码子附近设计引物ꎬ验证ＯＲＦ的准确性ꎬ将完整的ＯＲＦ于ＮＣＢＩ数据库中的ＢＬＡＳＴＰｒｏｔｅｉｎ进行在线功能比对ꎬ结合比对结果㊁其他物种的序列以及保守结构域ꎬ对目的基因进行命名ꎮＬｔＴＣＸ２基因全长克隆实验中所用引物见表１ꎮ表１㊀ＬｔＴＣＸ２基因引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅｓ引物序列ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓＬｔＴＣＸ２Ｆ１ＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＬｔＴＣＸ２Ｒ１ＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣＬｔＴＣＸ２Ｆ２ＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＣＬｔＴＣＸ２Ｒ２ＡＴＧＴＡＴＧＧＧＧＧＡＴＧＴＴＡＧＴＣＧＴＣ３ᶄＲＡＣＥＩｎｎｅｒＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ３ᶄＲＡＣＥＯｕｔｅｒＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴ３ᶄＲＡＣＥＧＳＰ１ＧＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＧ３ᶄＲＡＣＥＧＳＰ２ＣＡＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣ５ᶄＲＡＣＥＵＰＭＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧ￣ＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ５ᶄＲＡＣＥＵＰＳＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ５ᶄＲＡＣＥＧＰＳ１ＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣ５ᶄＲＡＣＥＧＰＳ２ＣＴＣＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＯＲＦＦＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＣＯＲＦＲＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡｃｔｉｎ９７ＦＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧＡｃｔｉｎ９７ＲＴＧＧＴＣＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧＲＴ￣ｑＰＣＲＦＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＡＲＴ￣ｑＰＣＲＲＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＡ１.５生物信息学分析将基因全长放入ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ/)在线分析预测开放阅读框ＯＲＦꎬ确定基因编码蛋白序列ꎻ通过ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线分析蛋白质氨基酸组成㊁含量㊁分子量㊁等电点等特性ꎻ通过ＰｒｏｔＳｃａｌｅ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａｌｅ/)在线软件分析蛋白疏水性分析ꎻ通过ＥｘＰＡＳｙＴＭｐｒｅｄ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｃｈ.ｅｍｂｎｅｔ.ｏｒｇ/ｓｏｆｔ￣ｗａｒｅ/ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ)和ＴＭＨＭＭ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｅｄｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＴＭＨＭＭ￣２.０)在线分析蛋白跨膜区㊁扩膜方向ꎻ通过ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)和ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ(ｈｔｔｐｓ://ｓｗｉｓｓ￣ｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/)在线预测分析蛋白的二级结构和三级结构ꎻ通过在线软件ＳｉｇｎａｌＰ￣４.０Ｓｅｒｖｅｒ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ￣４.０/)预测蛋白的信号肽ꎻ通过ＴａｒｇｅｔＰ１.１Ｓｅｒｖｅｒ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＴａｒｇｅｔＰ/)和ＷｏＬＦＰＳＯＲＴ(ｈｔｔｐｓ://ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ/)在线软件预测蛋白亚细胞定位ꎻ通过ＭｏｔｉｆＳｃａｎ(ｈｔｔｐｓ://ｍｙｈｉｔｓ.ｉｓｂ￣ｓｉｂ.ｃｈ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｍｏｔｉｆ＿ｓｃａｎ)在线分析该蛋白的结构域ꎻ将蛋白序列与ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴＰｒｏｔｅｉｎ比对ꎬ选择与之同源性较高的蛋白序列ꎬ通过ＤＮＡＭＡＮ软件ꎬ进行蛋白同源性比对分析ꎻ于ＮＣＢＩ上搜索其他物种的同源序列ꎬ使用ＭＥＧＡ７软件构建进化树(Ｋｕｍａｒｅｔａｌ.ꎬ２００４)ꎮ１.６实时荧光定量ＰＣＲ分析以花芽㊁根㊁茎㊁叶㊁萼片㊁花瓣㊁雄蕊㊁雌蕊的ＲＮＡ反转录后的ｃＤＮＡ为模板ꎬ本实验室筛选出较稳定的ＬｃＡｃｔｉｎ９７为内参引物ꎬＬｔＴＣＸ２基因引物见表２ꎬ进行半定量ＰＣＲ反应(Ｔｕｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ荧光定量ＰＣＲ反应为１０μＬ体系ꎬｃＤＮＡ共５０ｎｇꎬ使用ＡＢＩ热循环仪ꎬ反应程序:９５ħ预变性１ｍｉｎꎬ９５ħ变性５~１０ｓꎬ６０ħ延伸３０~３４ｓꎬ４０个循环ꎬ１个溶解曲线９５ħ１５ｓꎬ６０ħ１ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎮ反应结果后ꎬ将数据导出ꎬ参照２￣ΔΔＣＴ法计算该基因的相对表达量ꎬ使用ＯＲＩＧＩＮ软件绘制基因表达图ꎮ２㊀结果与分析２.１北美鹅掌楸组织总ＲＮＡ提取将北美鹅掌楸花芽㊁根㊁叶㊁茎㊁萼片㊁花瓣㊁雄蕊㊁雌蕊共８个组织的总ＲＮＡ按照多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒(离心柱型)提取ＲＮＡꎮ通过１％凝胶电泳检测ＲＮＡ完整性ꎬ发现２８Ｓ和１８ＳｒＲＮＡ两条带亮度为１.５~２倍ꎬ无明显弥散片状㊁条带消失现象ꎬ且ＯＤ２６０/２８０㊁ＯＤ２６０/２３０比值处于１.８~２.１之间ꎬ说明ＲＮＡ质量㊁完整性较好(图１)ꎮ１００１７期刘换换等:北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析图１㊀北美鹅掌楸８个组织总ＲＮＡ提取完整性检测Ｆｉｇ.１㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｉｎｅｉｇｈｔｐａｒｔｓｆｒｏｍＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ２.２北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２基因克隆从北美鹅掌楸转录数据库中筛选１个ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族ｕｎｉｇｅｎｅꎬ总长度３１７４ｂｐꎬ通过设计引物依次进行中间片段扩增㊁３ᶄＲＡＣＥ扩增㊁５ᶄＲＡＣＥ扩增ꎬ回收产物进行连接转化ꎬ挑选阳性克隆送至公司测序ꎬ拼接出目的基因的完整序列ꎮ鉴于ＬｔＴＣＸ２基因片段过长ꎬ将其中间片段分为两部分依次扩增ꎮ通过ＮＣＢＩ网站进行ＯＲＦ验证ꎬ设计引物验证ＯＲＦ序列的准确性(图２)ꎮ最终ꎬＬｔＴＣＸ２基因全长２８６６ｂｐꎬＯＲＦ为２４２４ｂｐꎬ编码了８０７个氨基酸ꎬ５ᶄＵＴＲ长２２８ｂｐꎬ３ᶄＵＴＲ长２１４ｂｐꎮＭ.ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＡꎬＢ.中间片段扩增ꎻＣ.３ᶄＲＡＣＥ扩增ꎻＤ.５ᶄＲＡＣＥ扩增ꎻＥ.ＯＲＦ验证ꎮＭ.ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＡꎬＢ.ＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲꎻＣ.３ᶄＲＡＣＥｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲꎻＤ.５ᶄＲＡＣＥｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲꎻＥ.ＯＲＦｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ.图２㊀ＬｔＴＣＸ２基因克隆电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅ２.３北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２基因生物信息学分析２.３.１蛋白理化性质及跨膜区预测分析㊀将ＬｔＴＣＸ２基因序列放入ＮＣＢＩ在线软件进行ＯＲＦ预测ꎬ确定基因编码的蛋白序列ꎮ结果显示ꎬＬｔＴＣＸ２基因的ＯＲＦ长２４２４ｂｐꎬ编码了８０７个氨基酸ꎬ以ＡＴＧ为起始密码子ꎬＴＧＡ为终止密码子ꎮ通过ＭｏｔｉｆＳｃａｎ在线分析ＬｔＴＣＸ２蛋白的结构域ꎬ含有２个ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅＣＸＣ结构域ꎬ分别位于５０４~５４５㊁５９０~６３１ａａ(图３)ꎮ将ＯＲＦ编码的蛋白序列通过ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ在线分析氨基酸组成㊁含量㊁分子量等ꎮＬｔＴＣＸ２蛋白总分子式为Ｃ３８１９Ｈ６０８４Ｎ１０９６Ｏ１２５６Ｓ３９ꎬ分２００１广㊀西㊀植㊀物４０卷图３㊀北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２蛋白的结构域预测Ｆｉｇ.３㊀ＤｏｍａｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎ子量为８８６９９.２５Ｄａꎬ由８０７个氨基酸残基组成ꎬ理论等电点为５.８３ꎬ带正电荷(Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)的氨基酸残基数为１００个ꎬ带负电荷(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)的氨基酸残基数为１１５个ꎮ蛋白质分子氨基酸组成中丝氨酸(Ｓｅｒ)含量最高ꎬ共９６个ꎬ占１１.９％ꎬ其次为谷氨酸(Ｇｌｕꎬ６５个ꎬ８.１％)ꎬ色氨酸(Ｔｒｐꎬ１个ꎬ０.１％)含量最低ꎮ该蛋白在哺乳动物体外网织红细胞中的半衰期为３０ｈꎬ在酵母中半衰期大于２０ｈꎬ在大肠杆菌中半衰期大于１０ｈꎮ不稳定系数为６２.３８ꎬ脂溶性指数为６５.３７ꎬ疏水性平均值为－０.６１９ꎮ通过ＰｒｏｔＳｃａｌｅ在线软件进行蛋白疏水性分析ꎬ横坐标为蛋白质氨基酸残基ꎬ纵坐标为该位点氨基酸残基疏水性值ꎬ正值表示疏水性氨基酸ꎬ负值表示亲水性氨基酸ꎮＬｔＴＣＸ２蛋白含有疏水区域和亲水区域ꎬ疏水性平均值为－０.６１９ꎬ为亲水性蛋白(图４:Ａ)ꎮ通过ＥｘＰＡＳｙＴＭｐｒｅｄ和ＴＭＨＭＭ在线软件预测分析蛋白跨膜区㊁扩膜方向ꎮＴＭｐｒｅｄ表明ꎬＬｔ￣ＴＣＸ２蛋白仅在第３９~５８ａａ处具有一个跨膜螺旋ꎬＴＭＨＭＭ结果进一步表明ＬｔＴＣＸ２为非跨膜蛋白(图４:ＢꎬＣ)ꎮ２.３.２蛋白二级结构、三级结构预测㊀通过ＳＯＰＭＡ在线预测分析蛋白的二级结构ꎮＬｔＴＣＸ２蛋白具有４种二级结构ꎬ无规则卷曲(Ｃｃ)占７０.６３％ꎬα螺旋(Ｈｈ)占２０.３２％ꎬ延伸链(Ｅｅ)占６.９４％ꎬβ转角占２.１１％(图５:Ａ)ꎮ通过ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ网站使用同源建模法在线预测蛋白质的三级结构(图５:Ｂ)ꎮ２.３.３信号肽预测与亚细胞定位㊀通过ＳｉｇｎａｌＰ￣４.０Ｓｅｒｖｅｒ在线软件预测蛋白的信号肽ꎬ结果表明ꎬＬｔＴＣＸ２蛋白不含信号肽及切割位点(图６)ꎮ蛋白亚细胞定位通过两种不同方法预测ꎬ即ＴａｒｇｅｔＰ１.１Ｓｅｒｖｅｒ和ＷｏＬＦＰＳＯＲＴ在线软件ꎬ结合两个结果ꎬ预测该蛋白主要定位于细胞核ꎬ应为核蛋白(表２ꎬ表３)ꎮ２.３.４氨基酸同源性分析㊀将ＬｔＴＣＸ２氨基酸序列放入ＮＣＢＩ中ＢＬＡＳＴ比对分析发现ꎬＬｔＴＣＸ２氨基３００１７期刘换换等:北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析Ａ.蛋白疏水性预测ꎻＢꎬＣ.蛋白跨膜区预测ꎮＡ.ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎꎻＢꎬＣ.Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ.图４㊀ＬｔＴＣＸ２蛋白疏水性和跨膜区的预测分析Ｆｉｇ.４㊀ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎ酸与其他物种的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族蛋白具有较高的同源性ꎬ大多具有保守的ＣＲＣ结构域ꎮ选择与ＬｔＴＣＸ２同源性较高的１５个蛋白序列ꎬ通过ＤＮＡ￣ＭＡＮ软件ꎬ进行氨基酸同源性比对分析ꎮ１５个蛋白分别为沉水樟(Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｍｉｃｒａｎｔｈｕｍｆ.ｋａｎｅ￣ｈｉｒａｅꎬＲＷＲ８８９３０.１)㊁亚洲莲(ＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａꎬＸＰ＿０１０２５９１１４.１ꎬＸＰ＿０１０２５６１４０.１)㊁葡萄(ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａꎬＸＰ＿０１０６４９９４９.１ꎬＸＰ＿０１０６４９９５０.１)㊁可可(ＴｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏꎬＸＰ＿００７０３４８３１.２)㊁博落回(ＭａｃｌｅａｙａｃｏｒｄａｔａꎬＯＶＡ１５５３１.１)㊁欧洲甜樱桃(ＰｒｕｎｕｓａｖｉｕｍꎬＸＰ＿０２１８２８１８３.１)㊁土瓶草(ＣｅｐｈａｌｏｔｕｓｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓꎬＧＡＶ５７５８５.１)㊁桃(ＰｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａꎬＸＰ＿０２０４１０８６５.１)㊁胡桃(ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａꎬＸＰ＿０１８８３９３８５.１)㊁毛果杨(ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａꎬＸＰ＿０２４４６２６６０.１)㊁胡杨(Ｐ.ｅｕｐｈ￣ｒａｔｉｃａ)㊁银白杨(Ｐ.ａｌｂａꎬＴＫＲ８３７０２.１)㊁海枣(ＰｈｏｅｎｉｘｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａꎬＸＰ＿００８７８９９９４.１)ꎮ结果表明１６个蛋白序列同源性达６６.２８％ꎬＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族蛋白具有较高的保守性ꎬ尤其是Ｎ端㊁Ｃ端(图７)ꎮ２.３.５系统发育进化分析㊀在ＮＣＢＩ上搜索已经发表的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族的蛋白序列ꎬ除了氨基酸同源４００１广㊀西㊀植㊀物４０卷Ａ.二级结构ꎻＢ.三级结构ꎮＡ.ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎻＢ.Ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ.图５㊀ＬｔＴＣＸ２蛋白二级㊁三级结构预测Ｆｉｇ.５㊀ＳｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎ表２㊀通过ＴａｒｇｅｔＰ１.１预测ＬｔＴＣＸ２蛋白亚细胞定位Ｔａｂｌｅ２㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎｂｙＴａｒｇｅｔＰ１.１Ｓｅｒｖｅｒ蛋白名称Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ亚细胞结构Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ可信度Ｃｒｅｄｉｂｉｌｉｔｙ(％)ＬｔＴＣＸ２叶绿体膜ｃＴＰ５６.９线粒体膜ｍＴＰ２.８分泌通路信号肽ＳＰ０.６其他Ｏｔｈｅｒ７１.６性分析的１５个蛋白ꎬ还包括胡杨(ＸＰ＿０１１０２６９０９.１ꎻＸＰ＿０１１０３９７２０.１ꎻＸＰ＿０１１０１９７８６.１)㊁银白杨(ＴＫＲ８３７０２.１)㊁拟南芥(ＮＰ＿００１３２８５４９.１ꎻＮＰ＿００１３２８５４８.１ꎻＮＰ＿１９３２１３.５ꎻＡＥＥ８３４９６.１ꎻＮＰ＿５６６７１７.１)㊁月季(ＲｏｓａｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬＸＰ＿０２４１７９３９０.１)㊁白梨(ＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉꎬＸＰ＿００９３４５３００.１)㊁绒毛状烟草(ＮｉｃｏｔｉａｎａｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓꎬＸＰ＿００９５９１８８４.１)㊁芜菁(ＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａꎬＸＰ＿００９１３５８２５.１)㊁野草莓(Ｆｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａｓｕｂｓｐ.ｖｅｓｃａꎬＸＰ＿０１１４５９２０６.１)ꎬ共２７个具有Ｔｅｓｍｉｎ/ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅＣＸＣ２结构域的蛋白表３㊀通过ＷｏＬＦＰＳＯＲＴ预测ＬｔＴＣＸ２蛋白亚细胞定位Ｔａｂｌｅ３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎｂｙＷｏＬＦＰＳＯＲＴ蛋白名称Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ细胞核Ｎｕｃｌｅａｒ叶绿体Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ高尔基体Ｇｏｌｇｉａｐｐａｒａｔｕｓ线粒体基质Ｍｉｔｏｃｈｏｎｏｄｒｉａｌｍａｔｒｉｘ液泡Ｖａｃｕｏｌｅ内质网ＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＬｔＴＣＸ２１４－－－－－序列进行进化树构建(图８)ꎮ通过ＭＥＧＡ７软件采用邻接法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)法ꎬ设置参数自展值(Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值)为１０００次进行进化分析ꎬ结果显示ꎬ北美鹅掌楸与莲㊁胡杨的ＴＣＸ２蛋白明显聚成一个分支ꎬ说明三者进化关系较近ꎮ２.４北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２基因的组织特异性表达分析将北美鹅掌楸花芽㊁根㊁叶㊁茎㊁萼片㊁花瓣㊁雄蕊㊁雌蕊共８个组织的总ＲＮＡ参照说明书进行反转录以获得ｃＤＮＡꎬ以鹅掌楸的ＬｃＡｃｔｉｎ９７为内参基因ꎬ采用相对定量的方法进行ＲＴ￣ｑＰＣＲꎮ检测５００１７期刘换换等:北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析图６㊀ＬｔＴＣＸ２蛋白的信号肽预测分析Ｆｉｇ.６㊀ＴｈｅｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎ实线部分表示２个保守结构域ＣＸＣꎻ虚线部分表示保守的Ｒ序列ꎬ连接２个ＣＸＣ结构域ꎮＳｏｌｉｄｌｉｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｔｗｏｃｏｎｓｅｒｖｅｄＣＸＣｄｏｍａｉｎｓꎻＤｏｔｔｅｄｌｉｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄＲｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇｔｈｅｔｗｏＣＸＣｄｏｍａｉｎｓ.图７㊀ＬｔＴＣＸ２氨基酸序列同源性分析Ｆｉｇ.７㊀ＨｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎ６００１广㊀西㊀植㊀物４０卷图８㊀ＬｔＴＣＸ２蛋白系统发育进化树Ｆｉｇ.８㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｐｒｏｔｅｉｎＬｃＡｃｔｉｎ９７㊁ＬｔＴＣＸ２基因在８个组织中的半定量表达情况ꎬ以检验荧光定量引物的特异性以及ｃＤＮＡ的质量ꎮ由图９:Ａ可知ꎬ内参基因ＬｃＡｃｔｉｎ９７在８个组织中的表达量相对稳定ꎬ条带亮度相对一致ꎬ可以用于此８个组织的荧光定量ＰＣＲ实验ꎬＬｔＴＣＸ２基因在８个组织中均有表达ꎬ在花芽㊁雄蕊㊁雌蕊㊁叶片中表达量较高ꎮ将ＬｔＴＣＸ２基因的ＲＴ￣ｑＰＣＲ实验数据导出后ꎬ以花芽的表达量为参照ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法计算相对表达量ꎬ分析其在８个组织中的表达情况ꎮ由图９:Ｂ可知ꎬＬｔＴＣＸ２基因的半定量和荧光定量ＰＣＲ表达结果相对一致ꎬ在叶片中表达量最高ꎬ花芽次之ꎬ花瓣㊁萼片中最少ꎮ３㊀讨论与结论北美鹅掌楸花型优美㊁花色变化丰富ꎬ花蜜量大ꎬ且较于鹅掌楸结实率高ꎬ是研究繁殖器官发育的较理想材料ꎮ目前ꎬ有关北美鹅掌楸花部器官发育分子调控的研究较少ꎬ且多集中于花色合成方面ꎬ雌蕊㊁雄蕊等繁殖器官发育调控起步较晚ꎮＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族转录因子广泛分布于各种生物中ꎬ主要参与生物的细胞分裂与性器官发育ꎬ目前研究多以动物为对象ꎬ在植物中研究较少ꎬ且起步较晚ꎮ本文在北美鹅掌楸中分离出１个ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家７００１７期刘换换等:北美鹅掌楸ＣＰＰ转录因子家族ＬｔＴＣＸ２基因的克隆与分析Ａ.ＬｔＴＣＸ２基因半定量表达情况ꎻＢ.ＬｔＴＣＸ２基因荧光定量ＰＣＲ表达情况ꎮＡ.Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅꎻＢ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅ.图９㊀ＬｔＴＣＸ２基因的组织特异性表达Ｆｉｇ.９㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｔＴＣＸ２ｇｅｎｅｉｎｅｉｇｈｔｔｉｓｓｕｅｓ族基因ꎬ命名为ＬｔＴＣＸ２ꎬ全长２８６６ｂｐꎬ编码区长２４２４ｂｐꎬ编码了８０７个氨基酸ꎮ组织特异性表达分析表明ꎬ该基因在叶片中表达量最高ꎬ花芽次之ꎬ花瓣㊁萼片中最少ꎬ整体表达水平差异不大且水平不高ꎬ推测ＬｔＴＣＸ２并不是调控北美鹅掌楸繁殖器官发育的主要基因ꎮ目前关于植物ＣＰＰ转录因子ꎬ既研究它们在细胞分裂与繁殖器官发育的调控ꎬ又聚焦于它们在植物系统进化历程ꎮ通过对模式植物水稻和拟南芥生物信息分析发现ꎬ所有的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族都具有高度保守的ＣＲＣ结构域ꎬ单子叶㊁双子叶植物分化之前ꎬ植物ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族基因发生过大幅度的扩张(王凯ꎬ２０１０)ꎮ在单子叶和双子叶植物分化完成之后ꎬ拟南芥和水稻基因组中的基因家族按照物种特异性方式进行扩张ꎬ拟南芥存在基因丢失现象ꎬ而两段ＣＸＣ结构域序列及Ｒ序列在长期进化过程中是协同进化的(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２００８)ꎮ但对除水稻㊁拟南芥以外的其他植物的ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族研究较少ꎬ亟待补充ꎬ且该家族在基部被子植物中的进化过程尚待探索与研究ꎮ本文经过对北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２蛋白氨基酸序列分析以及结构域预测ꎬ表明ＬｔＴＣＸ２蛋白亦具有２个保守且富含半胱氨酸ＣＸＣ结构域Ｃ１和Ｃ２ꎬ以及连接Ｃ１㊁Ｃ２保守的Ｒ序列ꎬ具有完整的㊁高度保守的ＣＲＣ结构域ꎬ再次说明了ＣＲＣ结构域的高度保守性ꎮ根据被子植物的系统进化分析ꎬ被子植物分为基部被子植物和真双子叶植物ꎬ真双子叶植物可分为基部真双子叶植物和核心真双子叶植物ꎮ木兰目㊁无油樟目和睡莲目属于基部被子植物ꎬ无油樟目和睡莲目更接近基部被子植物ꎬ而木兰藤目和核心被子植物处于并列的分支ꎬ北美鹅掌楸属于典型的基部被子植物(Ｑｉｕｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＪａｎｓｅｎｅｔａｌ.ꎬ２００７)ꎮ通过北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２蛋白系统进化树构建分析ꎬ表明北美鹅掌楸与亚洲莲㊁胡杨的ＴＣＸ２蛋白明显聚成一个分支ꎬ说明三者进化关系较近ꎮ北美鹅掌楸ＬｔＴＣＸ２与亚洲莲进化关系较近ꎬ与木本植物的模式植物胡杨次之ꎬ其系统进化结果与被子植物进化进程相一致ꎬ说明ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族属于较古老㊁保守的一类基因ꎬ可以为从分子生物学层面研究植物系统提供一定的理论帮助ꎮ目前关于其他植物ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ家族的研究匮乏ꎬ北美鹅掌楸更是鲜少见报ꎮ本文仅针对该家族中的１个基因进行了克隆与分析ꎬ初步探索其在基部被子植物中的表达㊁进化过程ꎬ日后仍需对其及其他成员继续探索与研究ꎬ分析该家族基因在木兰科中的进化关系及进化方式ꎮ８００１广㊀西㊀植㊀物４０卷参考文献:ＡＮＤＥＲＳＥＮＳＵꎬＡＬＧＲＥＥＮ￣ＰＥＴＥＲＳＥＮＲＧꎬＨＯＥＤＬＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２００７.Ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｃｙｓｔｅｉｎｅ￣ｒｉｃｈｄｏｍａｉｎｏｆａｔｅｓｍｉｎ/ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｓｚｉｎｃｉｎｖｉｔｒｏａｎｄＴＳＯ１ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｂｏｔｈｍａｌｅａｎｄｆｅｍａｌｅｆｅｒｔｉｌｉｔｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＪＥｘｐＢｏｔꎬ５８(１３):３６５７－３６７０.ＢＥＣＫＤＥꎬ１９９０.ＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａＬ.ｙｅｌｌｏｗ￣ｐｏｐｌａｒ[Ｍ]//ＢＵＲＮＳＲＭꎬＨＯＮＫＡＬＡＢＨ.ＳｉｌｖｉｃｓｏｆＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａꎬ２:Ｈａｒｄｗｏｏｄｓ.Ｕ.Ｓ.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＨａｎｄｂｏｏｋ６５４ꎬＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ:４０６－４１６.ＣＶＩＴＡＮＩＣＨＣꎬＰＡＬＬＩＳＧＡＡＲＤＮꎬＮＩＥＬＳＥＮＫＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０００.ＣＰＰ１ꎬａＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｏｆａｓｏｙｂｅａｎｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｃ３ｇｅｎｅ[Ｊ].ＰＡＮＳꎬ９７(１４):８１６３－８１６８.ＨＡＵＳＥＲＢＡꎬＨＥＪＱꎬＰＡＲＫＳＯꎬｅｔａｌ.ꎬ２０００.ＴＳＯ１ｉｓａｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｍｏｄｕｌａｔｅｓｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓａｎｄｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１２７(１０):２２１９－２２２６.ＨＡＵＳＥＲＢＡꎬＶＩＬＬＡＮＵＥＶＡＪＭꎬＧＡＳＳＥＲＣＳꎬ１９９８.Ａｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓＴＳＯ１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇﬂｏｒａｌｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ１５０(１):４１１－４２３.ＪＡＮＳＥＮＲＫꎬＣＡＩＺꎬＲＡＵＢＥＳＯＮＬＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２００７.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ８１ｇｅｎｅｓｆｒｏｍ６４ｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅｓｒｅｓｏｌｖｅｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｉｎａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｇｅｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｐａｔｔｅｒｎｓ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ１０４(４９):１９３６９－１９３７４.ＫＬＵＧＨＫＲꎬＣＵＭＭＩＮＧＪＣꎬ２００３.ＶａｒｉａｔｉｏｎｉｎｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｅｘｕｄａｔｅｓａｍｏｎｇｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｓｐｅｃｉｅｓｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｕｌｉｐｉｆｅｒａＬ.(ｙｅｌｌｏｗｐｏｐｌａｒ)ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｌｕｍｉｎｕｍ[Ｃ]//ＳａｖａｎｎａｈꎬＧｅｏｒｇｉａ:ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｍｅｒｉｃａＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇＡｂｓｔｒａｃｔｓꎬ８８:１８６.ＫＵＭＡＲＳꎬＴＡＭＵＲＡＫꎬＮＥＩＭ.２００４.ＭＥＧＡ３:ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ[Ｊ].ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍꎬ５(２):１５０－１６３.ＬＩＵＺꎬＲＵＮＮＩＮＧＭＰꎬＭＥＹＥＲＯＥＩＴＺＥＭꎬ１９９７.ＴＳＯ１ｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎｓｉｎｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１２４(３):６６５－６７２.ＭＥＮＧＣＭꎬＪＩＪＨꎬＬＩＸＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１４.ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｃｌｏｎｅａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＰＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍｗｈｅａｔ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２４(４):３９－４２.[孟超敏ꎬ姬俊华ꎬ李雪林ꎬ等ꎬ２０１４.小麦ＣＰＰ转录因子基因的电子克隆及生物信息学分析[Ｊ].生物技术ꎬ２４(４):３９－４２.]ＭＩＮＨＷꎬ２０１３.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅＺｍＲＡＶ１ａｎｄＺｍＴＣＸ８.１ｉｎＺｅａｍａｙｓ[Ｄ].Ｂｅｉｊｉｎｇ:ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ:１６－１９.[闵浩巍ꎬ２０１３.玉米抗逆相关基因ＺｍＲＡＶ１和ＺｍＴＣＸ８.１的功能研究[Ｄ].北京:中国农业大学:１６－１９.]ＰＡＮＲＲꎬＷＥＩＭＭꎬＷＡＮＧＹＪꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｂＣＣＰ１ｉｎｒｕｂｂｅｒｔｒｅｅ(Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎ￣ｓｉｓ)[Ｊ].ＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ５４(５):７６３－７７２.[潘冉冉ꎬ位明明ꎬ王亚杰ꎬ等ꎬ２０１８.巴西橡胶树ＨｂＣＰＰ１基因的克隆与表达分析[Ｊ].植物生理学报ꎬ５４(５):７６３－７７２.]ＰＡＲＫＳＣＲꎬＭＩＬＥＲＮＧꎬＷＥＮＤＥＬＪＦꎬｅｔａｌ.ꎬ１９８３.ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｗｉｔｈｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓＬｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ(Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ) 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鹅掌楸属植物基因差异表达与杂种优势的关系

study atterns
differential in between F1 andtheir were
geneexressionlumules hybrids arents
DDRT-CR．Theresultswereasfollows．
analyzedby
1．The RNA themethodofTrizolwas
total obtained
by goodqualityhighyieldsand
s
摘要
为了探讨鹅掌楸属植物杂种优势形成的分子机理以其亲本及杂种F1的叶芽
为材料利用DDRT-CR技术分析了杂种及其亲本基因表达的差异主要结论
如下：
研究。
2．杂种和亲本之间存在显著的基因表达差异可归纳为：双亲共沉默型 I 、
期和休眠旺盛期杂种鹅掌楸HxM四种差异表达类型所占的比例均小于杂种鹅掌
特异表达型 II 所占的比例高于杂种鹅掌楸BMxJ所占的比例但是杂种鹅
掌楸HxM其它两种基因差异表达类型所占的比例低于杂种鹅掌楸BMxJ所占的比
例。
不同生长发育时期均间存在极显著差异而单亲表达一致型 III 、单亲表达沉
同基因差异表达模型 I、II、ⅡI、IV 在萌动期、生长旺盛期、休眠期都存在
显著差异。
4．在生长旺盛期单亲表达一致型 III 与杂种鹅掌楸的叶面积杂种优势呈
显著正相关；单亲表达沉默型 IV 与杂种鹅掌楸的地茎和株高都呈显著负相关。
关键词：鹅掌楸属植物；RNA提取：杂种优势；差异显示
Abstract
Inordertosisof of
Liriodendronthe
the BetweenDifferentialGeneand

植物DNA和RNA提取方法剖析

植物DNA和RNA提取⽅法剖析实验⼀植物基因组DNA的提取⼀、实验⽬的掌握植物总DNA的抽提⽅法和基本原理。

学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提⽅法。

⼆、实验原理通常采⽤机械研磨的⽅法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产⽣不利的影响，在抽提缓冲液中需加⼊抗氧化剂或强还原剂(如巯基⼄醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作⽤。

⼗⼆烷基肌酸钠(sarkosyl)、⼗六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、⼗⼆烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离⼦型表⾯活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋⽩，使核蛋⽩解聚，从⽽使DNA得以游离出来。

再加⼊苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋⽩质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)⽔溶性很强，经离⼼后即可从抽提液中除去细胞碎⽚和⼤部分蛋⽩质。

上清液中加⼊⽆⽔⼄醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料⽔稻幼叶四、主要试剂配⽅2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先⽤70ml ddH2O溶解, 再定容⾄200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基⼄醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤1. DNA的提取（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃⽔浴中预热。

（2）取少量叶⽚（约1g）置于研钵中，⽤液氮磨⾄粉状；（3）加⼊700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（4）将磨碎液分倒⼊1.5 ml的灭菌离⼼管中，磨碎液的⾼度约占管的三分之⼆；（5）置于65℃的⽔浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；（6）冷却2 min后，加⼊氯仿-异戊醇（24：1）⾄满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；（7）放⼊离⼼机中10 000 rpm离⼼10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加⼊另⼀新的灭菌离⼼管中；（8）10 000 rpm离⼼1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转⼊含有异丙醇的离⼼管内，将离⼼管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与⽔层充分混合⾄能见到DNA絮状物；（9）10000 rpm离⼼1 min后，⽴即倒掉液体，注意勿将⽩⾊DNA沉淀倒出，将离⼼管倒⽴于铺开的纸⼱上；（10）60 sec后，直⽴离⼼管，加⼊720 µl的75%⼄醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，⽤⼿指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；（12）10000 rpm离⼼1 min后，倒掉液体，再加⼊800 µl 75%的⼄醇，将DNA再洗30 min；（13）10000 rpm离⼼30 sec后，⽴即倒掉液体，将离⼼管倒⽴于铺开的纸⼱上；数分钟后，直⽴离⼼管，⼲燥DNA（⾃然风⼲或⽤风筒吹⼲）；（14）加⼊50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；（15）置于-20℃保存、备⽤。

植物组织RNA提取的难点及对策

植物组织RNA提取的难点及对策从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。

要进行Northern 杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。

因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。

从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA，而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。

一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。

在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA 相互作用。

酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。

对于这些植物材料，用常规的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以提取出其RNA。

如Lбpez-Gбmez等在用常规的方法提取芒果果实的RNA时未能成功，他们的结果分为三种情况：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能进行体外翻译。

他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其中也包含RNase，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA 提取的因素。

Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时，发现RNA与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收，从而干扰了RNA紫外吸收的测定。

因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。

本文根据文献综述了解决上述植物RNA提取过程中难点的相应对策。

植物rna提取的原理

植物rna提取的原理嗨，小伙伴们！今天咱们来唠唠植物RNA提取这个超有趣的事儿。

你知道吗？植物RNA就像是植物细胞里的小信使呢。

那怎么把它从植物细胞这个大家庭里请出来呢？这就涉及到它的提取原理啦。

植物细胞有一层细胞壁，就像给细胞穿了一层铠甲。

这层铠甲可不好对付，我们得先把它打破，才能接触到里面的RNA。

一般会用到一些特殊的试剂，就像是魔法药水一样。

比如说液氮，液氮的温度超级低，把植物材料往液氮里一放，就像给植物细胞来了个“速冻魔法”。

这时候细胞变得脆脆的，然后用研磨棒一研磨，细胞壁就很容易被打破啦，细胞里面的东西就都跑出来啦。

这就像是打开了一个装满宝藏的小盒子，RNA就在这些宝藏里面哦。

细胞里面的东西可杂了，有蛋白质啊、DNA啊、多糖啊什么的，就像一堆混在一起的小玩意儿。

我们要提取RNA，就得把RNA和这些小伙伴们分开。

RNA是一种核酸，它有自己独特的性质呢。

我们会用到一些试剂来利用这些性质。

比如说，有一种试剂叫胍盐，胍盐可厉害了，它就像一个超级包容的大姐姐，能把细胞里的各种成分都溶解在里面，不管是蛋白质还是RNA，都能被它“照顾”到。

但是呢，RNA在胍盐溶液里和其他东西还是混在一起的。

这时候就轮到有机溶剂出场啦。

有机溶剂就像一个挑剔的小管家。

它对RNA和其他成分的“态度”不一样。

比如说氯仿，氯仿和胍盐溶液混合后，会发生神奇的分层现象。

蛋白质这些杂质就会跑到下层的有机相里面，就像被小管家赶到了地下室一样。

而RNA呢，就乖乖地留在上层的水相里啦。

这一步就像是一场小小的分离魔法，把RNA从那些杂七杂八的东西里初步分离出来。

但是这还不够哦，溶液里可能还残留着一些其他的杂质。

我们还得再进行一步提纯。

这时候会用到异丙醇，异丙醇就像一个专门捕捉RNA的小能手。

把异丙醇加到含有RNA的溶液里，RNA就会慢慢地从溶液里析出，就像小雪花一样。

然后我们就可以把这些析出的RNA收集起来啦。

不过呢，这个时候的RNA可能还不是特别纯净。

植物总rna的提取实验报告（共4篇）

植物总rna的提取实验报告(共4篇) 植物总RNA的提取实验植物总RNA 的提取RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和cDNA 的合成都是必须的，RNA 的纯度和完整性对于Northern blot，RT-PCR 和cDNA 文库的构建等分子生物学实验都至关重要。

RNA 分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA 酶的污染。

本实验采用异硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇等抑制RNA 酶利用GTC 和N-十二烷基肌氨酸钠将促使核蛋白复合体解离，使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中, 用乙醇沉淀方法分离RNA。

本实验从番茄幼苗中提取总RNA 的提取，掌握Trizol 提取的方法和步骤。

一材料与方法1. 植物组织设备番茄（Lycopersiconesculentum）幼苗为材料，利用移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml 离心管等设备。

2. 试剂本实验中所有试剂均用无RNA 酶灭菌水，用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌而得到。

75%乙醇，氯仿:异戊醇(24 : 1 by volume) 或氯仿，异丙醇、无水乙醇、70％乙醇，Trizol 试剂等试剂由分子生物学实验室提供。

3. 实验方法1. 50-100mg 组织在液N 中磨成粉末后，加入1ml Trizol 液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%。

2. 研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。

3. 取上层水相于一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10 分钟，10000r/min 离心10 分钟。

4.弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入70%乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min 离心5 分钟。

不同组织总rna提取

不同组织总rna提取
总RNA是一种包含所有转录本的RNA样品，对于许多生物学研究非常重要。

不同组织中的总RNA提取方法可能略有不同，以下是一些常见的总RNA提取方法：
1. 经典酚/氯仿法：该方法适用于多种组织，包括动物和植物组织。

它利用酚和氯仿的不同溶解度将RNA从DNA和蛋白质中提取出来。

它需要耗时且冗长的样品制备步骤，但可以获得高质量的RNA。

2. Trizol法：该方法是一种常用的RNA提取方法，适用于多种组织和细胞类型。

它使用一种酚-胍-氯仿混合物将RNA从细胞和组织中提取出来。

这种方法比经典酚/氯仿法更快，也可以获得高质量的RNA。

3. 氯化锂法：该方法适用于小型样品和细胞类型，例如酵母细胞。

它使用氯化锂和酒精的不同溶解度来提取RNA。

这种方法需要较短的制备时间，但可能会影响RNA的质量。

4. 柱式RNA提取法：该方法使用酚/氯仿或Trizol提取RNA，
并通过硅胶柱纯化步骤来去除杂质。

这种方法可以获得高质量的RNA，并且适用于各种组织类型。

总之，不同组织中的总RNA提取方法略有不同，但通常都可以使用上述方法之一。

选择合适的方法取决于实验的具体需求和样品类型。

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中图分类号：７１￥９．１Ｑ８；７２２
文献标识码：Ａ
维普资讯
福建林学院学报
２０，８２：５０８２（）１６—１９５
第２８卷第２期
２００８年４月
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鹅掌楸属植物总ＲＡ提取方法的比较与分析Ｎ
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பைடு நூலகம்
文章编号：０１３９２０）２— １６— ４１０ — ８Ｘ（０８Ｏ０５０
ＣｏｐｒｓｎａｄａａｙｉｆｔｅｍｅｈｄｆＲＮＡｉｏａｉｎｆｒＬｒｏｅｄｏｅｕｍａｉｏｎｎｌｓｓｏｈｔｏｓｏｓｌｔｏｉｉｄｎｒｎｇｎｓｏ
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徐进，李帅，季森施（南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏南京２０３）１０７
摘要：以中国鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂种鹅掌楸的幼芽为材料，利用ＴｚｌＣＡＳＳ和异硫氰酸胍法提取鹅掌楸植物总ｉｒｏ、ＴＢ、ＤＲＡ，Ｎ结果表明，１用Ｔｚｌ（）ｒｏ法提取的中国鹅掌楸、ｉ北美鹅掌楸、杂种鹅掌楸的ＲＡ具有２Ｓ１Ｓ５ＲＡ３条较清晰的Ｎ８、８、ＳｒＮ
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