分子生物学》实验17课时
分子生物学实验课程教学大纲
分子生物学实验课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物综合教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学实验是生物技术专业一门必修的专业课，涵盖了分子与细胞生物学的许多内容，并与结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、生物医学、分子病毒学、分子免疫学等学科有着重要的联系。
分子生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学生掌握分子生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。
同时也使学生具备分子生物学基本的实验技能，学会发现问题和解决问题的能力，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。
本课程的任务是通过实验教学，使学生了解和初步掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法，教学内容包括植物基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增目的基因及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
在实验内容和方法、技术上进行合理安排，力争让学生在有限的课时中尽可能多地了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，并尽可能多地引进、介绍新的、先进的实验方法和技术，以开阔学生视野，提高学生的动手能力和创造性思维能力，培养高素质的生命科学人才。
二、本课程与其它课程的联系与分工学习和研究分子生物学的目的在于阐明生命活动的化学物质基础，并与其它学科配合，来揭示生命活动的本质和规律。
《生物化学》、《细胞生物学》和《遗传学》是先修课程。
三、课程内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；实验一植物基因组DNA的提取植物基因组DNA的提取的目的及原理[1]；植物基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法[3]；作业：提取的DNA呈褐色的原因及解决办法？实验二琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤[1]，琼脂糖电泳的实验方法[3]；作业：琼脂糖凝胶电泳中电压如何设置？实验三聚合式酶联反应（PCR）扩增目的基因聚合式酶联反应（PCR）的基本原理、实验基本条件[2]；PCR反应条件的优化和注意事项和应用范围[1]；聚合式酶联反应（PCR）的实验技术[3]；作业：PCR操作防止污染，有哪些注意事项？实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理[1]；聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤和实验方法[3] 作业：预电泳的作用是什么？四、实验方式与要求1．实验前，要求学生预习实验内容，掌握实验目的及设计思路，了解实验步骤。
生物化学与分子生物学-教学大纲(中西医)
《生物化学与分子生物学》课程教学大纲(Biochemistry and Molecular Biology)一、课程基本信息课程编号：14232051课程性质：学科专业基础课适用专业：中西医学分：4学分总学时：72学时其中：讲授56学时，实验16学时先修课程：解剖学、组织胚胎、有机化学、医学生物学后续课程：生理学、病理生理学、药理学等临床专业课程授课学期：第2学期选用教材：生物化学与分子生物学[M].北京：科学出版社，2016生物化学实验指导 2016年( 自编教材)必读书目：[1] 周爱儒，生物化学（第八版）[M]. 北京：人民卫生出版社，2013年[2] 陈诗书，医学生物化学（第八版）[M].北京：科学出版社，2009[3] 药立波，医学分子生物学（第八版）[M]. 北京：人民卫生出版社，2014年二、课程教学目标：通过本课程的学习，使学生获得生物大分子的化学组成、结构及其功能等相关知识，在此基础上进一步掌握其代谢过程及其调节规律等生化及分子生物学的基本理论和基本技能，为学习其它后继基础医学和临床医学课程，在分子水平上探讨疾病发生机理，为中西医结合诊断疾病、制定预防和治疗措施等奠定基础。
作为一名医学院校的学生，只有具备扎实的以生物化学为立足点的医学基础知识，才能学好医学相关的专业技能和知识，才能更深入理解生理学、病理学等学科的内容。
总之，通过本门课程的学习，学生应能全面、系统地领会和掌握生物化学与分子生物学的基础理论、基本知识和基本技能，为学习其它基础医学课程和临床医学课程奠定基础。
三、理论教学课时安排、课程内容与基本要求教学内容与学时安排第一章绪论1、教学目的与基本要求(1)掌握：生物化学与分子生物学的概念。
(2)熟悉：生物化学与分子生物学研究的主要内容及其与医药学的关系。
(3)了解：生物化学与分子生物学的发展史。
2、教学内容（1学时）(1)生物化学与分子生物学发展简史(2)当代生物化学与分子生物学研究的主要内容：重点阐述当代生物化学的概念，生物化学与分子生物学研究的主要内容。
《分子生物学实验》实验课程教学大纲
《分子生物学实验》实验课程教学大纲一、课程基本信息课程名称：分子生物学实验英文名称：Molecular Biology Experiment课程性质：学科及专业基础课课程属性：独立设课适用专业：生物科学（本科）学时学分：18学时，1学分开设学期：第五学期先修课程：生物化学、分子生物学二、课程简介分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。
分子生物学实验课是理论课的延续和实践，是一门针对核酸分子（DNA、RNA、质粒等）以及蛋白质分子而进行的一系列操作，是生物学的前沿及生长点。
分子生物学实验已深入到动物、植物、微生物以及医学等各个领域，已成为生命科学及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。
本课程包括：DNA 的提取、电泳、PCR、质粒提取等实验。
通过这些实验的锻炼，使学生掌握分子生物学实验中最常用的技术，为以后进入科研实验奠定基础。
三、实验课程目的与要求学习本门课程的目的：通过本课程的学习使学生了解DNA、RNA和质粒等核酸分子的理化性质，掌握电泳、PCR等基本的分子生物学操作技能。
通过实验的手段加深对理论知识的理解，并把理论知识应用到实验实践中。
在实验过程中，培养学生形成科学的思维方法，逐渐提高学生分析解决问题的能力，培养其动手能力、独立科研能力和科学、严谨、实事求是的学风，为今后进行后继课程的学习和将来的科学研究工作打下基础。
学习本门课程的要求：理解分子生物学实验原理及实验方案，掌握基本实验方法和技能；掌握各种仪器的使用，了解其性能参数、适应范围及注意事项，通过实验，培养学生观察、比较、分析、综合等科学思维能力，以及独立工作的能力和实事求是的科学作风。
四、考核方式1、实验报告成绩：从实验态度、实验动手能力、实验观察能力、实验报告完成情况四个方面进行考查。
2、出勤占20%，实验报告占40%，实验操作占40%。
五、实验项目、学时分配情况六、实验内容实验一、分子生物学的实验安排及基本实验操作目的要求：1、了解分子生物学实验的安排及常用试剂的配制；2、掌握分子生物学实验基本实验操作。
《分子生物学实验》教学大纲 - 兰州大学生命科学学院.doc
《分子生物学实验》教学大纲课程编号：课程名称：分子生物学实验选修类型：全院必修课实验学时：36学时总学分：考核方式：课前预习、出勤率、实验报告开课时间：秋季（三年级第一学期）适合专业：生命科学学院各专业实验指导教材及参考书：实验教材：1、自编分子生物学实验教材2、刑婉丽，程京主编，生物芯片技术实验教程，清华大学出版社，2006主要参考书：1、J.萨姆布鲁克主编，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，20062、F.M.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.赛德曼，J.A,史密斯，K.斯特拉尔主编，精编分子生物学实验指南（第五版），科学出版社，20083、卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术（第二版），中国协和医科大学出版社，1999一、本课程的性质和任务分子生物学是人类从分子水平上揭开生物世界奥秘，以生物化学、细胞生物学、遗传学、微生物学为基础的一门实验学科。
其基木理论和实验技术已经渗透到生命科学的各个领域，并带动和推进了其他许多学科的发展。
分子生物学实验研究的内容主要包括DNA重组转化技术、基因表达调控研究、生物大分子的结构功能研究。
通过本实验课程的开设，可以让学生将基础理论知识与实验技能的实践相结合，培养学生掌握分子生物学实骑常用仪器设备的使用和操作；了解儿种分子生物学实验方法在科研中的应用；初步培养学生从分子水平分析和解决问题的综合能力，为以后的毕业论文和科学研究打下坚实的基础。
二、教学要求与教学方法1、课前预习实验，基本了解实验的基本原理、操作步骤、注意事项和预期结果。
课堂上认真听取老师讲解课件，实验中勇于提出问题，积极动手解决问题，认真、如实记录实验结果，主动查取相关文献完成实验报告。
2、听从老师的指导，爱护仪器设备，遵守实验室安全操作规则。
实验完毕后做好清洁卫生，按照要求安全处理有毒有害的废液和废弃物。
3、本实验课内容主要通过多媒体演示方法进行教学，实验过程要求学生独立动手完成，老师巡视、示范操作方法。
分子生物学实验教学大纲
《分子生物学实验》教学大纲一、课程基本信息课程编码：091118B课程名称：分子生物学实验英文名称：experiment of molecular biology课程类别：专业必修课总学时：24总学分：1适用专业：生物科学二、实验课程的性质、目标与任务1. 分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。
目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。
因此，在掌握基本分子生物学理论的基础上，为培养学生在分子生物学技术方面的实际动手能力，开设本实验课程。
2. 目标：通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作技能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。
3. 通过本课程的实验教学和实验操作，要求学生熟练掌握下列分子生物学实验技术：大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，质粒DNA的分离及纯化，琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增，DNA重组、转化与检测实验等。
三、实验课程教学基本要求（1）注重分子生物学基础实验技能的掌握与提高，提升学生的动手操作能力；（2）实验课前要预习，明确每次实验的目的、原理与基本步骤；（3）实验过程中要具有严谨科学的态度，尊重事实与实验结果，要善于发现问题、分析问题、解决问题；（4）树立学生之间的交流与合作意识。
四、实验教学内容及要求实验一大肠杆菌感受态细胞的制备【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。
注意严格无菌操作，在冰上进行。
正确选取对数生长期的大肠杆菌细胞。
【内容提要】感受态是细菌处在容易吸收外源DNA的状态。
选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌DH5a菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。
因而具备了吸收外源DNA的能力。
实验操作步骤：1.挑取单菌落，接种培养过夜2.转接培养3.将菌液置冰浴处理4.收集菌体5.CaCl2处理，-70℃保存。
《分子生物学》实验(17课时)
《分子生物学》实验(17课时)（本科）生物科学专业分子生物学实验2013年制订课程代码：学分：1总学时：17先修课程：《生物化学》，《有机化学》等。
开课对象：生物科学专业（本科）一、课程的性质、目的与任务分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。
目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。
为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。
除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。
通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作机能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。
二、实验内容与学时分配实验内容实验类型学时分配比例实验器材清洁灭菌与试剂配制操作 2PCR扩增目的DNA 验证 2 核酸的琼脂糖凝胶电泳与分析验证 2 pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增与试剂盒抽提（碱抽提法）综合 4 感受态细胞的制备(CaCl2法）综合 3 pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10与鉴定综合 4共17学时配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。
将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。
室温保存。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。
-20℃保存。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖3. 0.05mol/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
2024版最新分子生物学实验教学教案
通过实例展示如何将数据可视化方法应用于分子生物学实验数据 的分析和解读。
统计分析在分子生物学实验中的应用
统计分析方法
介绍常用的统计分析方法，如描 述性统计、假设检验、方差分析 等，并解释其原理和适用范围。
统计分析软件
推荐一些常用的统计分析软件， 如SPSS、SAS、Stata等，并介绍 其使用方法和优缺点。
电泳条件选择
核酸条带检测
使用荧光染料或放射性同位素标记的 探针与核酸条带结合，通过荧光扫描 仪或放射自显影仪检测条带位置和强 度。
根据核酸分子大小和电荷选择合适的 电泳条件，如电压、电流和电泳时间 等。
CHAPTER 03
基因克隆与表达实验
基因克隆原理及方法
基因克隆原理
基因克隆是利用DNA重组技术，在体外将目的基因与载体DNA连接，构建成 重组DNA分子，然后导入受体细胞进行扩增和表达的过程。
详细介绍差异表达分析的原理和方法，包括t检验、方差分析等，并 通过实例展示如何对基因表达数据进行差异表达分析。
结果解读与讨论
对聚类分析和差异表达分析的结果进行解读和讨论，探讨其在分子生 物学研究中的应用和意义。
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3
RNA定量
使用分光光度计或荧光定量仪测定RNA浓度和纯 度。
蛋白质提取与纯化
细胞裂解
使用化学或物理方法破坏细胞膜，释放蛋白质。
蛋白质纯化
通过去除其他细胞成分，如核酸、多糖等，获 得纯净的蛋白质。
蛋白质定量
使用Bradford法、Lowry法等方法测定蛋白质浓度。
核酸电泳分析
核酸样品准备
将DNA或RNA样品与载样缓冲液混合， 加热变性后进行电泳。
分子生物学实验课程
分子生物学实验课程分子生物学实验课程是生物学专业中非常重要的一门实践课程。
通过这门课程的学习和实践，可以使学生熟悉和掌握分子生物学的基本理论和实验技术，培养学生的实验操作能力、科学研究思维和解决实际问题的能力。
在分子生物学实验课程中，学生将学习到许多基本的实验技术和方法，比如DNA提取、PCR扩增、基因克隆、蛋白质表达与纯化、基因组测序等。
这些实验方法是分子生物学研究的基础，掌握了这些方法，学生就可以进一步开展各种生物学研究。
在实验的过程中，学生需要仔细阅读实验操作步骤，并按照要求准备实验材料，如提取试剂、制备琼脂糖凝胶、配制PCR反应体系等。
在实验中，学生需要严格按照实验操作规程进行操作，注意实验室安全，保证实验的准确性和可重复性。
实验过程中，学生还需要进行实验数据的记录和分析。
这些数据包括实验操作的时间、实验结果的观察和记录等。
通过对实验数据的分析，可以得出实验结果，验证实验目的，进一步探讨实验结果的意义。
在分子生物学实验中，学生还会接触到许多常用的实验仪器和设备，如离心机、PCR仪、电泳仪、显微镜等。
学生需要了解这些仪器和设备的基本原理和操作方法，掌握它们的正确使用和日常维护。
除了基本的实验技术和仪器使用，分子生物学实验课程还注重培养学生的实验设计和创新能力。
学生需要在老师的指导下，根据实验目的和问题，设计实验方案，确定实验变量和控制组，合理安排实验步骤。
在实验过程中，学生还需要灵活调整实验方法和参数，解决实验中的问题和困难。
分子生物学实验课程的学习不仅仅是为了掌握实验技术和方法，更重要的是培养学生的科学研究思维和解决实际问题的能力。
在实验中，学生需要思考实验结果的原因和意义，探索实验结果背后的生物学机理。
通过实验课程的学习，学生可以深入了解生物学的基本原理和现代研究进展，为今后的科学研究和职业发展打下坚实的基础。
分子生物学实验课程是生物学专业中非常重要的一门实践课程。
通过这门课程的学习和实践，可以使学生掌握分子生物学的基本理论和实验技术，培养学生的实验操作能力、科学研究思维和解决实际问题的能力。
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（本科）生物科学专业分子生物学实验2013年制订课程代码：学分：1总学时：17先修课程：《生物化学》，《有机化学》等。
开课对象：生物科学专业（本科）一、课程的性质、目的与任务分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。
目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。
为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。
除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。
通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作机能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。
二、实验内容与学时分配实验一实验器材清洁灭菌与试剂配制一、学习分子生物学实验室规则与注意事项二、熟悉相关仪器的使用及操作规程超净工作台、PCR仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、恒温培养箱、摇床、冷冻离心机、涡旋振荡器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、重蒸水装置、移液枪三、器材的清洁与包装消毒（每组一份）1.试管清洗与包装灭菌：用清洁液刷洗后自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗两遍，晾干或烘干使用。
取棉花与纱布，制成棉塞，塞好试管口。
3只一组用报纸包裹、细绳扎紧，高温蒸汽灭菌。
2.培养皿清洗与包装灭菌：将培养皿清洗干净，晾干或烘干，盖好，4套一组用报纸包裹，灭菌。
3.离心管的包装与灭菌：将100ml烧杯清洗干净，晾干或烘干。
取1.5ml及10ml 离心管装入烧杯中，包口灭菌。
4.枪头的灭菌：将10ul、200 ul和1000 ul枪头装入配套的枪头盒，包好灭菌。
5.清洗250ml、100ml和蓝口瓶盖盖。
装好灭菌。
6.灭菌完毕后取出烘干或晾干，保存备用。
四、试剂的配制与灭菌：1. LB培养基：酵母提取物 5g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 15～20g；定容至1000mL（NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌）。
有时需在培养基中添加抗生素，琼脂凝固点为40℃，所以添加抗生素最好在50～55℃。
2.电泳缓冲液：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA （pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。
将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。
室温保存。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。
-20℃保存。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖3. 0.05mol/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
4. 含15%甘油的0.05mol/l CaCl2：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。
5. 取锥形瓶装好双蒸水，包口、灭菌，即无菌水，存放于室温。
6.用脱脂棉制成棉球，配制75%酒精浸泡，置于广口试剂瓶中备用。
实验二 PCR扩增目的DNA及电泳鉴定一、实验目的：掌握PCR技术的原理、方法和实验注意事项二、实验原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验用品PCR仪、台式离心机、电泳装置与凝胶成像系统、移液枪、PCR管、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、一对引物、无菌水、模板（DNA或cDNA）四、实验步骤在一灭菌的0.2ml PCR管中加入：2µl RT产物2.5µl 10×Buffer(终浓度为1.5mM)1.5µl 25mM MgCl20.5µl 10mM dNTPs (终浓度各为0.2mM)2.0µl 10µM上下游引物混合物（终浓度各为0.8µM）0.5µl 1U/µl Taq DNA聚合酶16µl灭菌双蒸水总体积为25µlPCR反应程序为94℃/5min预变性；94℃/20s变性、50℃/40s退火、72℃/40s 延伸，循环35圈；72℃/10min再延伸。
反应结束后，取5μL扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
实验三核酸的琼脂糖凝胶电泳与分析一、实验目的学习并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。
把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。
在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。
本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。
三、实验用品1.仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、移液枪及配套枪头、点样板或保鲜膜、一次性手套、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒等。
2.试剂及配制：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。
将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。
室温保存。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。
-20℃保存。
其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖四、实验方法1. 制备1％琼脂糖凝胶(50ml)：称取0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。
取少量琼脂糖凝胶液将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3. 加样：在保鲜膜上混合8.3μl质粒DNA样品和1.7μl上样缓冲液，用10 μl移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序）。
4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5. 电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。
6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
7. 常见问题及注意事项①.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。