植物原生质体培养与体细胞杂交
合集下载
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类 等。
➢ 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定 剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更 为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和 出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
PPT文档演模板
•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异 为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异 特征。
漂浮法 不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
沉降法
• 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤， 再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂：甘露醇。 • 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径
44~169μm，依原生质体大小来定。 • 离心：900~4500r/min。
PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
（二）酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果
胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质 酶，浓度为0.5%~2%。
➢ 温度： 一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。
PPT文档演模板
细胞工程植物原生质体培养和体细胞 杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体的培养与体细胞杂交
。异变因基和体色染、异变征特态形为现表要主。代后给递传地定稳能 �异变因基和体色染及涉因异变传遗�征特异变其失丧而变改的件条境环随它�异变传遗非 为异变性应适 。异变性传遗和异变性应适括包 �异变的泛广着在存中程过养培体离物植 异变传遗�二� 。株植成育发接直后构结体 状胚成形或根定不和芽定不成形可 �中基养培化分到移转织组伤愈的成形养培体质生原 生再株植、3 。致所衡平不的裂分质胞和裂分核是能可这 �象现裂分丝有的常正不生发会中程过养培体质生原 。大很化变率板植体质生原此因 �裂分丝 有胞细行进能都定一不胞细生再但 �提前的裂分丝有则规行进是在存的壁胞细体质生原 裂分胞细、2 。大增积体或芽现出会常 体质生原的全不育发壁胞细而 �裂分丝有胞细的常正行进步一进体质生原的壁胞细整完生再 。成完生再壁胞细天数至天两 �壁胞细生再始开后时小数养培经体质生原 �下况情常正 。件条 决先的裂分胞细是生再的壁胞细而 �力能在潜的裂分和生再有具都体质生原的力活有具 生再壁胞细、1 程过生再体质生原�一� 。程过的株植整完 出化分体状胚过通或织组伤愈过通或后最 �团胞细成形裂分续持胞细生再 �壁胞细复恢快很 �下件条养培的好良和法方养培的当适在体质生原的化纯、离分指是程过生再体质生原 异变传遗与程过生再体质生原、六 。法方种一的养培荡震�后珠糖脂琼成形待�中 液养培入滴滴液的右左 lm5.0 以后然 �匀均合混液体质生原的纯提与液糖脂琼的温适用 养培珠糖脂琼、4 。法 方的面表基养培脂琼体固在布涂 �合混液浮悬体质生原的度浓定一与脂琼的积体等将指是法 养培层双体固-体固�散扩的分成害有和放释步逐的分成养营于利又�长生的体质生原于利 既�合结的养培体固与养培体液是。法养培层双体固-体液为法方养培的面表基养培脂琼体 固在布涂液浮悬体质生原度浓定一将。养培层双体固-体固和养培层双体固-体液为分又 养培层双、3 。法方的 养培止静层浅中皿养培于置 lm4—3 出取�度密胞细定一到整调液养培用体质生原将是 养培层浅体液、2 。察观点定于便 �动游其免避�定固置位体质生原使。法方的板平体固层薄成制内皿养培在�合混基养培脂 琼的℃54 于处的积体等与度密胞细定一照按体质生原的积体定一将指�养培板平叫又 养培层薄体固、1
【生物技术】第六讲(2)植物体细胞杂交技术
3.1.1 根据可见标志选择 主要用于非绿色原生质体与含有叶绿体的 原生质体的融合.(半绿半白) 3.1.2 根据荧光标记选择 将2种原生质体群体分别用不同的荧光染料 标记,然后通过荧光显微镜鉴别异核体. 3.1.3 低密度植板选择 对细胞进行追踪选择.
3.2 突变互补选择
3.2.1 隐性突变互补选择 3.2.2 显性抗性互补选择 3.2.3 隐性突变与野生型互补选择 3.2.4 显-隐性双突变体选择
植物体细胞杂交技术
周口师范学院生命科学系
植物体细胞杂交的意义
有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段. 作用空间:主要限于种内的品种之间. 种及种以上分类单位之间的杂交,例如 种间或属间杂交,则常常遭遇有性不亲和性 障碍.
在无性繁殖植物和性不育植物中,如在 马铃薯,甘薯,木薯,甘蔗和香蕉中,更是 难以通过有性杂交进行遗传改良. 因此,建立在原生质体全能性基础上的 体细胞杂交和胞质杂交技术,对于植物的遗 传改良具有重要的意义.
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.2 细胞学和分子细胞学鉴定 通过确定杂种染色体数和染色体形态
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.3 生化鉴定 同工酶谱分析法: 将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱 比较: 杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和 可能只出现双亲的部分酶带 或缺少双亲的某些酶谱而出现新的谱带.
在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中,两 个来源不同的染色体组常常不能完全结合在 一起. 在动物体细胞杂种细胞系中,已知双亲之 一的染色体会逐渐消除,在植物中也看到这 种现象.
3 杂种细胞的选择系统
3.1 根据物理特性选择 3.2 突变互补选择 3.3 根据生长和再生能力的差别选择
3.1 根据物理特性选择
3.3 根据生长和再生能力的差别选择
3.2 突变互补选择
3.2.1 隐性突变互补选择 3.2.2 显性抗性互补选择 3.2.3 隐性突变与野生型互补选择 3.2.4 显-隐性双突变体选择
植物体细胞杂交技术
周口师范学院生命科学系
植物体细胞杂交的意义
有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段. 作用空间:主要限于种内的品种之间. 种及种以上分类单位之间的杂交,例如 种间或属间杂交,则常常遭遇有性不亲和性 障碍.
在无性繁殖植物和性不育植物中,如在 马铃薯,甘薯,木薯,甘蔗和香蕉中,更是 难以通过有性杂交进行遗传改良. 因此,建立在原生质体全能性基础上的 体细胞杂交和胞质杂交技术,对于植物的遗 传改良具有重要的意义.
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.2 细胞学和分子细胞学鉴定 通过确定杂种染色体数和染色体形态
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.3 生化鉴定 同工酶谱分析法: 将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱 比较: 杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和 可能只出现双亲的部分酶带 或缺少双亲的某些酶谱而出现新的谱带.
在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中,两 个来源不同的染色体组常常不能完全结合在 一起. 在动物体细胞杂种细胞系中,已知双亲之 一的染色体会逐渐消除,在植物中也看到这 种现象.
3 杂种细胞的选择系统
3.1 根据物理特性选择 3.2 突变互补选择 3.3 根据生长和再生能力的差别选择
3.1 根据物理特性选择
3.3 根据生长和再生能力的差别选择
原生质体培养与体细胞杂交
看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
01
但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
点击此处添加副标题
原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
202X
原生质体的获得
点击此处添加副标题
原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
202X
原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
01
03
02
原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
protoplasts from the cut enzymes on the metabolism
ends of the cell.
of the protoplasts are eliminated.
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分
一、发展简史及其意义
1、发展史
❖ 1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；
❖ 1960年：英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌 纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼 根细胞原生质体；
❖ 1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；
❖ 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟 草叶肉原生质体，两步法和一步法。
二、原生质体分离
（一） 分离方法
机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
陈传红 制作 2007 / 5
1、机械分离（Machanical isolation）
高度液泡化的细胞
• Cut plasmolyzed tissue • In practice this technique is
and subsequent
difficult and the yield of
deplasmolysis results in expansion and release of the
viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading
第十一章原生质体培养和体细胞杂交
养中的细胞生长和分裂有影响。 温度25~27℃。 3) 渗透浓度 应试验不同渗透压浓度的细胞反应，找出适
宜的渗透浓度。广泛使用的山梨醇和甘露醇浓度为 0.4~0.8 mol·L-1。
5.4 原生质体的收集和纯化
过滤和离心的方法进行收集和纯化。 过滤: 用40~100目去除杂质。 离心：75~100g离心3~5min，弃去上清液， 纯化：
本章教学目的与要求
(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑。
一节 原生质体培养
1 概念 2 设备与用具 3 化学试剂 4 酶类
5 原生质体的分离与纯化
6 原生质体培养
第一节 原生质体培养
1 概念： 1.1 原生质体（Protoplast） 指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生
易造成局部原生质体密度过高或粘聚，影响再生细胞 的分裂和进一步生长发育。
2) 悬滴培养法：用滴管以小滴接种到培养皿上，由 于表面张力，小滴以半球形保持在培养皿表面。底皿 加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养。
优点：材料少，生长快，不易污染，易加入培养基， 有利于低密度培养；
缺点：原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且 与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。
显微镜下的细胞融合过程
第二节 原生质体融合
1 概念 2 细胞融合的方法 3 细胞融合的程序 4 应用
2 细胞融合的方法
自发融合：去壁的裸细胞具有彼此融合的能力， 在酶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合 形成同核体，
原因：由于不同细胞的胞间连丝扩展和粘连造成 的。
自发融合是无意义， 诱导融合：不同来源的原生质体细胞用物理和化
宜的渗透浓度。广泛使用的山梨醇和甘露醇浓度为 0.4~0.8 mol·L-1。
5.4 原生质体的收集和纯化
过滤和离心的方法进行收集和纯化。 过滤: 用40~100目去除杂质。 离心：75~100g离心3~5min，弃去上清液， 纯化：
本章教学目的与要求
(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑。
一节 原生质体培养
1 概念 2 设备与用具 3 化学试剂 4 酶类
5 原生质体的分离与纯化
6 原生质体培养
第一节 原生质体培养
1 概念： 1.1 原生质体（Protoplast） 指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生
易造成局部原生质体密度过高或粘聚，影响再生细胞 的分裂和进一步生长发育。
2) 悬滴培养法：用滴管以小滴接种到培养皿上，由 于表面张力，小滴以半球形保持在培养皿表面。底皿 加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养。
优点：材料少，生长快，不易污染，易加入培养基， 有利于低密度培养；
缺点：原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且 与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。
显微镜下的细胞融合过程
第二节 原生质体融合
1 概念 2 细胞融合的方法 3 细胞融合的程序 4 应用
2 细胞融合的方法
自发融合：去壁的裸细胞具有彼此融合的能力， 在酶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合 形成同核体，
原因：由于不同细胞的胞间连丝扩展和粘连造成 的。
自发融合是无意义， 诱导融合：不同来源的原生质体细胞用物理和化
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
新细胞
2-7d 第一次分裂 2w后 低渗透压 约6w后 3w后
多细胞的细胞团
小细胞克隆
直径1mm的小愈伤组织
3 植株再生 将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养。
愈伤组织将通过形态发生的两条途径即器官 发生或胚胎发生形成再生植株。
Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose （夜来香）
成分 数量（mg· L-1） 成分
KNO3 CaCL2· 2H2O H3BO3 Na2MO4· 2H2O NaFe· EDTA 甘露糖 果糖 山梨醇 丙酮酸钠 延胡索酸 生物素 盐酸吡哆醇 抗坏血酸 叶酸 维生素B12 椰子汁 1900 600 3.00 0.25 28 125 125 125 5 10 0.005 1 1 0.2 0.01 10
胞质环流检测法：
以胞质环流作为进行活跃代谢的指标
（二）原生质体培养
原生质体制备 好后，用培养 基将原生质体 调至一定的密 度（最低起始 细胞密度以 上），及时地 进行培养。
1 、培养基 原生质体培养基基本上是参照植物组织或细胞 培养所用的培养基。 茄科植物：MS、NT 十字花科和豆科：B5、KM8P 禾本科：MS、N6 、KM8P
体细胞杂交主要集中以下植物
茄科植物 十字花科 禾本科 豆科
体细胞杂交过程：
原生质体的制备； 原生质体的融合； 杂种细胞的筛选和培养； 杂种植株的再生和鉴定
1、原生质体的制备
2、原生质体的融合： 自发融合：在原生质体分离过程中发生 诱发融合：人为手段诱导原生质体融合的方法
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶
酶 Enzyme
纤维素酶类 Onozuka Meicelase P Cellulysin Driselase 果胶酶类 Pectinase Pectolyase Y-23 Macerozyme R-10 半纤维素酶类 Rhozyme HP-150 Hemicelluase
第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交
原生质体概括 原生质体的培养 体细胞杂交
一、 原生质体概况
植物原生质体
(protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
亚原生质体
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的 断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细 胞核，也可不具有细胞核。
5d
1d
7d 10d
4周
5周
7周
苜蓿 原生 质体 分裂
苜蓿原生质体
形成细胞团 6 weeks after isolation
8 weeks after isolation
苜蓿原生质体 再生植株
三 体细胞杂交
植物体细胞杂交（somatic hybridization） 又称为原生质体融合（protoplast fusion）， 指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养， 使其再生杂种植株的技术。
植物原生质体研究进展
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体 获得成功。 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。 1985年，Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养获得再生植株。
二、原生质体培养 （一）原生质体分离与收集 （二）原生质体的培养
酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行 灭菌，并且随配随用
⑵ 酶解 将无菌材料放入酶解液中处理以释放出原生 质体的过程 原则：利用尽可能低的酶浓度和酶解时间获 得大量而有活力的原始质体 条件：材料与酶解液的比例为1g/10-20ml酶 解液；一般在pH5.4 ~ 6.0、25-30℃、黑暗 中振荡（30～50r/m）酶解30min~几十 hours。
② 高钙高pH法
高钙高pH法诱导原生质体融合的步骤与
PEG 法基本相同，只是诱导剂是 Ca2+ 浓度较 高 的 强 碱 溶 液 ， 诱 导 融 合 时 要 保 温 （ 3037℃）。
③电融合法（electric fusion） 电融合诱导原生质体融合是在电融合仪上进行的。 通过高频（500K Hz～2MHz）电场脉冲处理原生 质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最 终导致原生质体融合 优点：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融 合技术操作简便 缺点：电融合仪较昂贵，给实际使用带来限制
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
苜蓿叶 片的原 生质体
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（ fluorescein diacetate ， FDA）染色法
活细胞
紫外光照射
FDA
脂酶分解
有极性荧光素积累
绿色荧光
原生质体活力（ % ） = 发荧光的原生 质体数/原生质体总数×100%
⑵液体浅层培养 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使 其成一薄层，封口后进行培养。 特点： 操作简单，对原生质体的损伤小，而且方便 以后添加新鲜培养基和转移培养物 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之 间粘连，从而影响其进一步的生长、分裂 原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
核质体:由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的
小原生质体。也称为微小原生质体。
胞质体:不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用： 1.体细胞杂交（somatic hybridization）： 实现远缘物种的体细胞杂交，再通过植株 再生就可能创造出新的植物个体 2.遗传转化：实现外源DNA或细胞器的导入， 通过植株再生就可以得到转基因植物 3.分离细胞器的理想材料 4.无性系变异及突变体的筛选
3、细胞融合种类及杂种细胞的筛选
⑴融合种类
非必须融合： A-A； B-B（同核体） 必须融合： A-B（异核体） 对称融合：细胞质和细胞核均发生融合 非对称融合 只有细胞质融合（正常细胞＋胞质体） 只有细胞核融合（正常细胞＋核质体）
ห้องสมุดไป่ตู้
⑵筛选杂种细胞
①机械选择法 利用融合亲本的物理特性差异进行筛选 eg：可见标志or荧光标记 ②互补选择法 利用融合双亲原生质体在生理和遗传特性上的 互补性进行杂种细胞筛选 如生长互补选择，显性抗性互补选择。
3、培养条件
⑴植板密度：104 ～ 105个/mL
⑵散射光或黑暗
⑶温度：25 ～30 ℃
（三）原生质体的发育和植株再生
原生质体→ 形成新的细胞壁→ 第一次分裂 →小细胞团 →愈伤组织 →再生苗
1 细胞壁再生 原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，一至 数天内便可形成完整的细胞壁 2 细胞分裂和生长 在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山 梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继 续生长、分裂。
主要步骤如下：
①融合液配制 ②融合原生质体的密度和比例 将两亲本A和B调整到1×104个/mL，并按1：1混合， 静置2min后开始融合 ③融合 向原生质体混合液中加入等体积的PEG诱导融合剂， 轻轻摇匀后，放置10 min。 离心（100×g，10min），弃去上清液，用培养基悬 浮原生质体。 重复（３）２－４次，最后用培养基调至适当的密度 培养（液体浅层培养、平板培养等）
（一）原生质体的分离与收集
高产量、高质量的原生质体是进行原生质 体培养和操作的前提。 步骤： 1.材料的选择； 2.酶解处理； 3.原生质体的分离、纯化； 4.原生质体的活力检测。
1、材料的选择
1）取材
细胞分裂旺盛的材料 双子叶植物：幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶 单子叶植物（禾本科植物）：愈伤组织或悬浮细 胞
苜蓿叶片 的酶解法 分离原生 质体
3、原生质体的收集与纯化
⑴目的：除去未去壁的细胞、细胞碎片、叶绿体、微
管成分和细胞团等组织残渣；残余酶液
⑵ 预 处 理 ： 酶 解 结 束 后 ， 将 酶 解 物 通 过 孔 径 为 2070µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块 和细胞团，收集滤液于离心管中
数量（mg· L-
KCL 300 KH2PO4 170 ZnSO4· 7H2O 2.00 CuSO4· 5H2O 0.025 蔗糖 纤维二糖 木糖 苹果酸
125 125 125 10
尼克酰胺 核黄酸 D-泛酸钙 维生素D3
1 0.1 0.5 0.005
KM-8P
（3）激素： 培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。
来 源
绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens 黑曲霉 日本黑曲霉 根霉 黑曲霉 黑曲霉
② 酶溶剂(CPW溶液:细胞-原生质体清洗液 )
成分 用量（mg· L-1） KH2PO4 27.2 KNO3 101.0 CaCl2· 2H2O 148.0 MgSO4· 7H2O 246.0 KI 0.16 BSA（牛血清白蛋白） MES pH=5.8
⑶液体—固体结合培养
①液体浅层—固体平板培养双层培养法 培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再 将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基 表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到 液体培养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸 附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体 的生长和分裂。
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基， 滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
2）预处理：
有菌材料，必须进行表面消毒处理； 暗处理； 叶片萎蔫处理，撕去下表皮； 质壁分离处理； 悬浮细胞or愈伤组织预培养。
2-7d 第一次分裂 2w后 低渗透压 约6w后 3w后
多细胞的细胞团
小细胞克隆
直径1mm的小愈伤组织
3 植株再生 将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养。
愈伤组织将通过形态发生的两条途径即器官 发生或胚胎发生形成再生植株。
Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose （夜来香）
成分 数量（mg· L-1） 成分
KNO3 CaCL2· 2H2O H3BO3 Na2MO4· 2H2O NaFe· EDTA 甘露糖 果糖 山梨醇 丙酮酸钠 延胡索酸 生物素 盐酸吡哆醇 抗坏血酸 叶酸 维生素B12 椰子汁 1900 600 3.00 0.25 28 125 125 125 5 10 0.005 1 1 0.2 0.01 10
胞质环流检测法：
以胞质环流作为进行活跃代谢的指标
（二）原生质体培养
原生质体制备 好后，用培养 基将原生质体 调至一定的密 度（最低起始 细胞密度以 上），及时地 进行培养。
1 、培养基 原生质体培养基基本上是参照植物组织或细胞 培养所用的培养基。 茄科植物：MS、NT 十字花科和豆科：B5、KM8P 禾本科：MS、N6 、KM8P
体细胞杂交主要集中以下植物
茄科植物 十字花科 禾本科 豆科
体细胞杂交过程：
原生质体的制备； 原生质体的融合； 杂种细胞的筛选和培养； 杂种植株的再生和鉴定
1、原生质体的制备
2、原生质体的融合： 自发融合：在原生质体分离过程中发生 诱发融合：人为手段诱导原生质体融合的方法
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶
酶 Enzyme
纤维素酶类 Onozuka Meicelase P Cellulysin Driselase 果胶酶类 Pectinase Pectolyase Y-23 Macerozyme R-10 半纤维素酶类 Rhozyme HP-150 Hemicelluase
第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交
原生质体概括 原生质体的培养 体细胞杂交
一、 原生质体概况
植物原生质体
(protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
亚原生质体
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的 断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细 胞核，也可不具有细胞核。
5d
1d
7d 10d
4周
5周
7周
苜蓿 原生 质体 分裂
苜蓿原生质体
形成细胞团 6 weeks after isolation
8 weeks after isolation
苜蓿原生质体 再生植株
三 体细胞杂交
植物体细胞杂交（somatic hybridization） 又称为原生质体融合（protoplast fusion）， 指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养， 使其再生杂种植株的技术。
植物原生质体研究进展
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体 获得成功。 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。 1985年，Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养获得再生植株。
二、原生质体培养 （一）原生质体分离与收集 （二）原生质体的培养
酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行 灭菌，并且随配随用
⑵ 酶解 将无菌材料放入酶解液中处理以释放出原生 质体的过程 原则：利用尽可能低的酶浓度和酶解时间获 得大量而有活力的原始质体 条件：材料与酶解液的比例为1g/10-20ml酶 解液；一般在pH5.4 ~ 6.0、25-30℃、黑暗 中振荡（30～50r/m）酶解30min~几十 hours。
② 高钙高pH法
高钙高pH法诱导原生质体融合的步骤与
PEG 法基本相同，只是诱导剂是 Ca2+ 浓度较 高 的 强 碱 溶 液 ， 诱 导 融 合 时 要 保 温 （ 3037℃）。
③电融合法（electric fusion） 电融合诱导原生质体融合是在电融合仪上进行的。 通过高频（500K Hz～2MHz）电场脉冲处理原生 质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最 终导致原生质体融合 优点：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融 合技术操作简便 缺点：电融合仪较昂贵，给实际使用带来限制
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
苜蓿叶 片的原 生质体
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（ fluorescein diacetate ， FDA）染色法
活细胞
紫外光照射
FDA
脂酶分解
有极性荧光素积累
绿色荧光
原生质体活力（ % ） = 发荧光的原生 质体数/原生质体总数×100%
⑵液体浅层培养 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使 其成一薄层，封口后进行培养。 特点： 操作简单，对原生质体的损伤小，而且方便 以后添加新鲜培养基和转移培养物 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之 间粘连，从而影响其进一步的生长、分裂 原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
核质体:由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的
小原生质体。也称为微小原生质体。
胞质体:不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用： 1.体细胞杂交（somatic hybridization）： 实现远缘物种的体细胞杂交，再通过植株 再生就可能创造出新的植物个体 2.遗传转化：实现外源DNA或细胞器的导入， 通过植株再生就可以得到转基因植物 3.分离细胞器的理想材料 4.无性系变异及突变体的筛选
3、细胞融合种类及杂种细胞的筛选
⑴融合种类
非必须融合： A-A； B-B（同核体） 必须融合： A-B（异核体） 对称融合：细胞质和细胞核均发生融合 非对称融合 只有细胞质融合（正常细胞＋胞质体） 只有细胞核融合（正常细胞＋核质体）
ห้องสมุดไป่ตู้
⑵筛选杂种细胞
①机械选择法 利用融合亲本的物理特性差异进行筛选 eg：可见标志or荧光标记 ②互补选择法 利用融合双亲原生质体在生理和遗传特性上的 互补性进行杂种细胞筛选 如生长互补选择，显性抗性互补选择。
3、培养条件
⑴植板密度：104 ～ 105个/mL
⑵散射光或黑暗
⑶温度：25 ～30 ℃
（三）原生质体的发育和植株再生
原生质体→ 形成新的细胞壁→ 第一次分裂 →小细胞团 →愈伤组织 →再生苗
1 细胞壁再生 原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，一至 数天内便可形成完整的细胞壁 2 细胞分裂和生长 在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山 梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继 续生长、分裂。
主要步骤如下：
①融合液配制 ②融合原生质体的密度和比例 将两亲本A和B调整到1×104个/mL，并按1：1混合， 静置2min后开始融合 ③融合 向原生质体混合液中加入等体积的PEG诱导融合剂， 轻轻摇匀后，放置10 min。 离心（100×g，10min），弃去上清液，用培养基悬 浮原生质体。 重复（３）２－４次，最后用培养基调至适当的密度 培养（液体浅层培养、平板培养等）
（一）原生质体的分离与收集
高产量、高质量的原生质体是进行原生质 体培养和操作的前提。 步骤： 1.材料的选择； 2.酶解处理； 3.原生质体的分离、纯化； 4.原生质体的活力检测。
1、材料的选择
1）取材
细胞分裂旺盛的材料 双子叶植物：幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶 单子叶植物（禾本科植物）：愈伤组织或悬浮细 胞
苜蓿叶片 的酶解法 分离原生 质体
3、原生质体的收集与纯化
⑴目的：除去未去壁的细胞、细胞碎片、叶绿体、微
管成分和细胞团等组织残渣；残余酶液
⑵ 预 处 理 ： 酶 解 结 束 后 ， 将 酶 解 物 通 过 孔 径 为 2070µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块 和细胞团，收集滤液于离心管中
数量（mg· L-
KCL 300 KH2PO4 170 ZnSO4· 7H2O 2.00 CuSO4· 5H2O 0.025 蔗糖 纤维二糖 木糖 苹果酸
125 125 125 10
尼克酰胺 核黄酸 D-泛酸钙 维生素D3
1 0.1 0.5 0.005
KM-8P
（3）激素： 培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。
来 源
绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens 黑曲霉 日本黑曲霉 根霉 黑曲霉 黑曲霉
② 酶溶剂(CPW溶液:细胞-原生质体清洗液 )
成分 用量（mg· L-1） KH2PO4 27.2 KNO3 101.0 CaCl2· 2H2O 148.0 MgSO4· 7H2O 246.0 KI 0.16 BSA（牛血清白蛋白） MES pH=5.8
⑶液体—固体结合培养
①液体浅层—固体平板培养双层培养法 培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再 将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基 表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到 液体培养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸 附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体 的生长和分裂。
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基， 滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
2）预处理：
有菌材料，必须进行表面消毒处理； 暗处理； 叶片萎蔫处理，撕去下表皮； 质壁分离处理； 悬浮细胞or愈伤组织预培养。