生物科学专业_开题报告范例

XX大学本科生毕业论文（设计）开题报告

毕业论文（设计）题目应用原生质体融合技术构建耐胆盐、耐酸乳酸菌菌株

选题类型应用基础型课题来源自选项目

学院生命科学与理学院专业生物科学

指导教师×××职称××

姓名×××年级2006级学号×××

开题报告（立题依据、研究的主要内容及预期目标、研究方案、论文进度安排、主要参考文献）

1立题依据

2一、选题的理论意义与实践意义：

3选题理论意义: 黄瓜（Cucumis sativus Linn）是我国广泛栽培的夏秋季主要蔬菜之一。它喜温怕热，在胁迫因子当中，夏季高温是影响黄瓜幼苗地上部分生长发育的主要因子，露地和保护地栽培均存在高温热害，高温影响黄瓜的光合作用、呼吸作用和矿质元素的吸收，从而易使黄瓜授粉受精失败，落花落果，严重影响了黄瓜的产量和品质，因此黄瓜耐热性的提高是露地及保护地栽培需要解决的重要问题。

4硒作为谷胱甘肽过氧化物酶系（GSH-Px）的组成成分，参与作物体内自由基的消除，进而提高了植物对逆境的抗性，硒的使用可显著提高黄瓜叶片GSH-Px 的活性，使叶片中丙二醛(MDA)的含量明显降低。高温胁迫下，硒还能中和与衰老相关的氧化胁迫。

5实践意义：高温胁迫使黄瓜的品质下降，严重影响栽培设施的利用效率及黄瓜设施栽培的高效可持续发展。因此，研究硒对高温胁迫黄瓜幼苗地上部的生长调节，可以采取有效措施，对于黄瓜设施生产具有重要意义

牛奶的组成最为接近人体母乳，含有人体所需的全部营养成分，营养最为丰富和均衡，在人们的膳食结构中有其它食品无法替代的地位和作用。由新鲜牛奶发酵成的酸奶由于其丰富的营养、特殊的风味、爽滑的质构和良好的生理功能，倍受人们青睐[1]。在当今社会，酸奶早已成为人们茶余饭后的饮料，酸奶所具有的独特功效备受人们喜爱。1908年俄国诺贝尔奖获得者E．Metchnikof提出“酸奶长寿”理论，认为高加索地区居民长寿者多的原因是由于食用大量的含有乳酸菌的酸奶。

乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的统称，很早就被用来加工和保存食品，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且近年来对乳酸菌的研究表明，乳酸菌还有很多特殊的医疗保健作用，如改善胃肠道功能，提高免疫力，维持维生素供应，降低胆固醇，美容，长寿，降血糖等，益生作用突出[2-4]。另外，乳酸菌能产生一系列具有抗菌活性的有机小分子物质，常见的有乳酸、乙酸、丙酸。除了这些具有抑菌作用的初级代谢产物外，益生乳酸菌还产生如细菌素等多种抗菌物质，其中酸性物质和乳酸菌素是最有效的抑菌物质，并通过减少肠道中有毒物质的形成，来帮助人们的延年益寿。

人类的肠道拥有一个丰富而有活力的菌群，至少含有400～500种细菌，益生菌是通过维持或改善肠道菌群平衡而对消费人群具有确实的保健功能的活菌制剂。然而人体胃环境的低pH（有时pH值小于3）下，不利于微生物的生长；同时胆汁进入小肠，也大大影响肠道微生物的生长繁殖。研究发现，酸奶中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在摄入消化道中后，经受不住强烈的胃酸和胆汁的强烈作用，不能在人体肠道内固定下来和生存增殖。口服乳酸菌若要到达肠道并在肠道内起作用，需要菌体或菌体产生的酶能够通过低pH胃液存活下来，耐受肠道内的胆盐浓度[5]。

因此要求具有一定耐受胆盐、耐受酸度使乳酸菌能够活着到达作用位点，而且它还必须能通过上消化道，并能在肠道中的环境中发挥积极作用[6]；而且益生性乳酸菌可用于治疗肠道菌群失调，以及消化道的通透性增加等症状，而后者是许多肠道失控的主要特征[7]。所以如何构建耐受胆盐和耐受低pH的酸奶发酵剂，是提高酸奶营养价值被机体吸收利用的关键，成为当前研究的重要方向。

近年来，由于乳酸杆菌具有转化率高、产酸快和基因工程可操作性而广泛用于乳酸发酵生产。尤其是基因组洗牌分子技术，此技术是DNA shuffling技术的一个改进，通过改变乳酸菌基因组原有的核苷酸序列，产生新的遗传结构，创造新的基因，并赋予表达产物以新的功能[8]。

目前国内外也做了很多这方面的研究。微生物原生质体融合技术的整个过程包括：原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生。国内外学者在每一个关键技术上都做了大量的工作，取得了可喜的成就[9]。并在工业生产中大量应用，尤其是微生物育种方面应用最为广泛。

2 研究的主要内容及预期目标

原生质体融合技术是构建多突变组合微生物的有效工具，可以在短时间内获得多亲本的良好的菌株性状(耐受胆盐、耐受pH 特性、快速产酸特性、细菌素产生、良好的风味)的遗传基因的重组菌株，每次原生质体融合都能获得一些有用的遗传多样性，对乳酸菌的育种具有重要意义。

进行原生质体融合时，先用酶脱去两个亲本细胞壁，使菌体细胞在高渗环境中释放原生质体，并在高渗条件下混合，再经聚乙二醇促进，两种原生质体凝集而发生融合，获得异核体或重组子。利用杂合菌可以提高发酵制品的特性或发展新的产品[1]。

将从酸奶和牛场中分离筛选具有一定的pH 和胆盐耐受特性的6株乳酸菌进行原生质体的融合，构建耐受高胆盐浓度和低酸度的优良菌株。

在整个实验中，探讨原生质体制备的最优方案成为一个难点，包括菌株预处理时间，酶解条件等；以及用通过互补致死损伤进行原生质体灭活的方案，作为原生质体融合的标记是一个重点；关于原生质体的融合的再生条件是本实验的关键。必须准确把握每个步骤，达到预期目的。

3 研究方案

3.1 实验流程

3.2 实验材料 3.2.1 实验材料

样品及其来源：从牛奶和牛场环境中筛选出6株具有一定耐胆盐和耐酸乳酸菌菌株 1.0ug/ml 青霉素MRS 预处理4h

0.6%Gly +0.5ug/ml 青霉素液体MRS 预处理4h

1.2%Gly 液体MRS 预处理4h

原生质体高温灭活

原生质体紫外线灭活 2mg/ml 溶菌酶酶解1.0-2.0h

耐性筛选

原生质体的融合

再生培养

液体MRS 活化菌

株、370

C 过夜培养