细菌菌落 计数 (1)资料讲解
003菌数报告规则
（一）菌落计数1．细菌培养时间为72小时（3天），、分别在24小时及48小时，72小时，点记菌落数，一般以72小时菌落数为准，2：霉菌、酵母菌培养时间为120小时（5天），分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以小时菌落数为准。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
3．一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。
勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。
注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。
【必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。
如仍难区别，可延长培养时间4～7天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。
】（4．供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。
排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
）5．供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别），培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。
（为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。
或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。
［0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），TTC即为：2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1％TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延］。
）有些软膏等非水溶性供试品：经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，【为防止这种情况，也可用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。
】若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若片状菌落不到平板的一半,而余下的一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2代表全平板菌落数.若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。
菌落总数计数方法
菌落总数计数方法菌落总数计数是一种常见且重要的实验方法，用于评估菌落的数量和密度。
菌落总数计数方法有多种，常见的包括平板计数法、薄层计数法、过滤膜计数法等。
下面将详细介绍这几种方法的原理和步骤。
平板计数法是最常见的菌落总数计数方法之一。
它的原理是将待测菌液均匀涂布在含有固体营养培养基的平板上，通过菌落的生长扩散形成可见的单个菌落，再通过对菌落进行计数并乘以稀释倍数，最后得到待测菌液的菌落总数。
具体步骤如下：1. 准备固体培养基。
根据所要检测菌落的要求，选择适当的培养基并准备好。
固体培养基一般含有琼脂或明胶等物质，可以提供营养物质和支持菌落的生长。
2. 制备合适浓度的菌液。
将待测菌种培养在含有适宜营养物质的液体培养基中，利用培养箱或摇床进行恒温、恒湿的培养，待菌液呈现合适浓度时即可使用。
3. 稀释菌液。
根据待测菌液的预估浓度，将适量的菌液和无菌生理盐水按一定比例进行稀释，以获得合适浓度的菌液。
4. 涂布菌落。
取一定数量的稀释后的菌液，利用灌注器或鱼鳞划线法将菌液均匀涂布在固体培养基的平板上。
为了保证菌液的均匀分布，可以采取旋转、摇动等方法。
5. 培养菌落。
将涂布好的平板置于恒温、恒湿的培养箱中进行培养。
根据菌种的不同，一般在30-37的温度下培养24-48小时。
6. 计数菌落。
在培养好的平板上，通过肉眼或借助显微镜仔细观察菌落的形态、大小、颜色等特征，并使用菌落计数器或放大镜进行计数。
根据菌落的密度和分布情况，可以选择在整个平板上计数，或者在特定区域计数后进行推算。
7. 乘以稀释倍数。
由于菌液在进行稀释时常用不同倍数的生理盐水进行稀释，所以在计算菌落总数时需要将计数结果乘以稀释倍数，以获得准确的结果。
薄层计数法是另一种常见的菌落总数计数方法。
它的原理是将含有待测菌液的液体培养基均匀地倒入培养基皿中，使其能够覆盖整个底面。
待液体凝固后，菌落会在培养基表面生长，并且可以通过视觉或显微镜观察和计数菌落。
微生物限度检查法名词解释(一)
微生物限度检查法名词解释(一)微生物限度检查法1. 介绍微生物限度检查法（Microbiological Limit Test）是用于评价药品、食品和化妆品等产品中微生物质量的检验方法。
它能够确定样品中是否存在对人体有害的微生物，并对其数量进行定量评估。
2. 相关名词以下是与微生物限度检查法相关的一些常见名词：•微生物限度：指产品中允许存在的微生物或菌群的数量上限。
不同产品类型有不同的微生物限度标准，例如菌落数、霉菌数和大肠菌群数等。
–例如，某药品的微生物限度为每克不超过10个细菌。
•菌落总数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的微生物菌落的总数。
–例如，通过菌落总数检验，发现某食品样品中每克菌落总数为100个。
•霉菌数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的霉菌菌落的数量。
–例如，某化妆品样品中每克霉菌数为5个。
•大肠菌群数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的大肠菌群的数量。
–例如，某食品样品中每克大肠菌群数为0。
3. 检验流程微生物限度检查法的具体流程包括以下几个步骤：1.样品准备：从被检测产品中取样，按照一定的方法进行样品的准备和处理，以便进行后续分析。
2.菌落计数：将样品分别接种在适当的培养基上，并在一定的条件下孵育。
孵育结束后，利用显微镜和计数板等设备，对培养出的微生物菌落进行计数和记录。
3.菌种鉴定：根据菌落的形态、生理特性和生化反应等，对菌落进行鉴定，以确定菌落的种类和数量。
4.结果评价：根据相关的微生物限度标准，将检测结果与标准进行比较，评价样品是否符合质量要求。
5.结果记录：将检测数据和结果进行记录，并生成相应的报告。
4. 应用领域微生物限度检查法广泛应用于以下领域：•药品：验证药品是否符合微生物限度，确保药品的安全和有效性。
•食品：检测食品中是否存在致病菌乃至变质微生物，保障食品的卫生和质量。
•化妆品：评价化妆品中的细菌、霉菌等微生物是否超过限度，确保产品的质量和安全性。
以上就是关于微生物限度检查法的相关名词和解释，以及检验流程和应用领域的简要介绍。
细菌的计数法
CFUCFU (Colony-Forming Units)经培养所得菌簇形成单位的英文缩写。
cfu:colonyformineunit,菌落形成单位，将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。
意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！传统上就叫“个”。
但是，我们知道，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。
就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。
cfu代表“colony forming units”。
cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。
但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。
目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。
另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
微生物 菌落总数 测定详细讲解
菌落总数测定详细讲解一、茵落总数的概念和测定意义菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。
菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．二、茵落总数测定的几项说明1．菌落总数的测定。
是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。
由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。
3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。
因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。
但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
菌落形态观察并计数
稀释度
10-3
10-4
10-5
菌落数
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
3
平均
1克样品总菌落数
• 作业： 1.记录土壤中细菌，放线菌，真菌的数量。 2.比较细菌，放线菌，丝状真菌，酵母菌
的菌落特征。
3.细菌纯化
结束语
谢谢大家聆听！！！
11
• 霉菌菌落大而疏松或棉絮状或蜘蛛网状， 其表面颜色(因分生孢子有多种颜色)，与基 质结合较牢，往往具有霉味。
• 酵母菌菌落与细菌菌落相近，但较大而厚， 并且不透明。四大类微生物菌落比较表
各种微生物菌落形成的特征
1.细菌菌落形态观察
2.细菌纯化和保种
3.微生物活菌测数
• 1）真菌菌落的形态
菌落形态观察并计数
• 细菌一般有臭味，其菌落为小点状，多为 圆形（个别为呈根状或辐射状）较小，菌 落的颜色多样，但正反面颜色相同。菌落 表面隆起，有光滑湿润的、粘稠的、也有 粗燥干燥的，它们与基质结合不牢，容易 被挑起，其生长速度很快。
• 放线菌菌落早期酷似细菌菌落，至晚期表 面出现粉状（即形成了分生孢子）呈同心 圆，辐射状，干燥、菌丝与培养基紧密结 合，不易挑取，产生各种色素和泥腥味， 正反面颜色一般不同。
• 2）真菌菌落数：
稀释度
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菌落数
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平均 1
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1克样品总菌落数
微生物活菌测数(附稀释平板 计数法)
• 1）细菌菌落的形态
• 2）细菌菌落数：
细菌菌落 计数 (1)资料讲解
间 板法
• 方法：
1.以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 0.9 ml 生理盐水，分别 加入6支灭菌EP管中。
2.以无菌操作方法吸取0.1ml充分混匀的待 检样本，注入盛有0.9ml灭菌生理盐水的 试管中，混匀成1:10稀释液。
3.吸取1:10的稀释液0.1ml注入盛有0.9ml 灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀 释液。按同法依次稀释成1:1000， 1:10000稀释液等备用。（如此递增稀 释一次，必须更换一支1ml灭菌吸管）
4.用灭菌吸管取2～3个适宜稀释度的稀释菌 液0.1ml，分别注入灭菌平皿内，每个稀 释度重复做两个平板，涂布均匀后，置 37℃，培养24-48h。
12
3
4
5
6
0.1ml
1
样本
0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
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0.1ml
0.1ml
0.1ml
• 适用领域：
• 结果：
稀释度 菌落数 每毫升中 总活菌数
10-4
10-5
10-6
1 2 平均 1 2 平均 1 2 平均
总活细菌数（CFUs/ml）=某一稀释度的平均菌落数 ×10×稀释度
*注意事项见实验讲义
细菌菌落计数
▪直接法
✓血球记数板 ✓活菌染色：美蓝、吖啶橙、TTC
▪间接法
直接法—血球记数板
细菌计数板和血球计数板都用来侧微生物的总菌数。血球计数板用来测 较大微生物如酵母菌和霉菌孢子的总数，细菌计数板用来测细菌的总菌 数。两种计数板的构造相似，不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数 板深度的1/5。
（2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定 标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状 菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
水质 细菌总数的测定 菌落计数
水质细菌总数的测定菌落计数1.适用范围本方法适用于测定饮用水、水源水、地表水细菌总数的测定。
2.原理平板计数法是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。
因为细菌在水中能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基或一套物理、化学条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求。
所以，由此法所得的菌落数可能要低于真正存在的活细菌的总数。
3.仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱解剖镜。
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121°C（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
培养基营养琼脂培养基：市售营养琼脂培养基，按说明配制，装于三角烧瓶中，经121C高压蒸汽灭菌15min,经无菌性检验和标准菌株检验后，贮存于暗处备用。
4.步骤4.1选择稀释度稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30〜300之间。
大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1mL,所得的菌落总数可适于计数。
4.2水样的稀释方法①将水样用力振摇20〜25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。
②以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。
按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。
注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。
4.3操作方法①以无菌操作方法用1mL灭菌吸管吸取充分混匀的水样或2〜3个适宜浓度的稀释水样ImL，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每个水样应倾注两个平皿。
②待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37C恒温箱内培养24h,进行菌落计数。
4.4菌落计数培养之后，立即进行平皿菌落计数。
如果计数必须暂缓进行，平皿需存放于5〜10C冰箱内，且不得超过24h。
但是不可以使这种做法成为常规的操作方式。
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• 适用领域：
细菌菌落计数
▪直接法
✓血球记数板 ✓活菌染色：美蓝、吖啶橙、TTC
▪间接法
直接法—血球记数板
细菌计数板和血球计数板都用来侧微生物的总菌数。血球计数板用来测 较大微生物如酵母菌和霉菌孢子的总数，细菌计数板用来测细菌的总菌 数。两种计数板的构造相似，不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数 板深度的1/5。
1.广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料 和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。 2.疾病诊断
*泌尿系感染性疾病的诊断------尿培养 3.细菌感染及药物治疗效果
*临床病人 *实验动物
3、菌落计算方法 （1）菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜 检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释 度的各平板平均菌落总数。
（2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定 标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状 菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
间 接 法—平板菌落计数法
浇注平板法
Байду номын сангаас
涂布平板法
• 方法：
1.以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 0.9 ml 生理盐水，分别 加入6支灭菌EP管中。
2.以无菌操作方法吸取0.1ml充分混匀的待 检样本，注入盛有0.9ml灭菌生理盐水的 试管中，混匀成1:10稀释液。
3.吸取1:10的稀释液0.1ml注入盛有0.9ml 灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀 释液。按同法依次稀释成1:1000， 1:10000稀释液等备用。（如此递增稀 释一次，必须更换一支1ml灭菌吸管）
• 结果：
稀释度 菌落数 每毫升中 总活菌数
10-4
10-5
10-6
1 2 平均 1 2 平均 1 2 平均
总活细菌数（CFUs/ml）=某一稀释度的平均菌落数 ×10×稀释度
*注意事项见实验讲义