实验五 人体细胞Barr氏小体的制备与观察
实验5 性染色质
实验5 性染色质：人类X染色质的观察一. 实验目的1. 掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下识别Barr小体的特征及其所在的位置。
2. 了解X染色体失活的有关理论假说以及失活染色体上的基因所控制的遗传性状特点。
二. 实验原理1. Barr小体：雌性哺乳类动物细胞内的X染色体在间期仅有一条呈松散状态，参加细胞生理活动，另一条则保持异固缩状态，从而形成了X染色质，又称Barr小体。
Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致。
它在DNA复制时总落后于其它常染色质，且大多出现在核膜边缘。
性染色质在人类中，正常男性个体不可能出现Barr小体，正常女性的细胞只可能出现一个Barr小体。
对于具有性染色体畸变的个体来说，Barr小体出现的数目等于细胞内X染色体的数目减1。
2. 剂量补偿效应（dosage conpensation）：是指XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。
可通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。
3. X染色体失活的假说（Lyon hypothesis）：在正常的雌性哺乳动物的体细胞中，一条X 染色体在遗传上有活性，而另一条处于失活状态。
这种失活发生在胚胎发育的早期，失活是随机的。
但是一旦发生了失活，这个细胞的后代将处于失活状态。
X 染色体上的杂合基因将出现嵌合（mosaic）现象。
它可以解决一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。
4. 利用X染色质的鉴别技术，可以对性染色体畸形、胎儿早期诊断等提供有益的参考。
三. 实验用具及材料显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、吸水纸、离心机、吸管、固定液（甲醇与冰醋酸二者体积比为3:1）、2.0g/L甲苯胺蓝染色液、生理盐水等。
四. 实验方法及步骤1．取材：先漱口，将口腔内杂物漱出。
人X染色质的观察
实验原理 实验目的 主要仪器、材料及试剂 实验方法及实验步骤
思考题
实验原理
• 1949年，Barr和Bertram在雌猫神经细胞核 内发现了一种浓染小体，直径约1.5um，雄 猫神经细胞核中则没有这种结构。进一步 研究发现，除猫以外，其他雌性哺乳动物 及正常女性间期细胞核中均存在这种结构， 当时称之为Bar小体，又叫X染色质(X chromati)或X小体(X body)。
Lyon剂量补偿学说认为:女性有两条X染色 体，但所表达的绝大部分遗传物质与只有 一条X染色体的男性是一样多的。这是因为 女性的X染色体中只有一条保持活性，而另 一条以巴氏小体的形式存在，遗传上无活 性，结果X连锁基因得到剂量补偿。
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实验目的
第一,初步掌握观察和鉴别染色质的方法,识 别Barr小体的形态特征及所在部位． 第二， 了解Ｘ染色体失活的有关理论假说以及失 活染色体上的基因所控制的遗传性状的特 点。
（1） 清水漱口三次以上，用灭菌牙签的钝 头刮取口腔颊部细胞(将第一次刮取物弃 去），涂于干净的载波片上使成一薄层，空 气中干燥。
（2）固定：60%冰醋酸中固定20min. （3）染色：加几滴改良苯酚品红染液染色
10-15min.清水冲去浮色。
（4）镜检： 在低倍镜下，可见口腔粘膜上皮细胞核为圆形或 卵圆形．细胞质不着色；换油镜，选择典型的可 计数细胞进一步观察，可计数细胞的判断标准是： 核较大、染色清晰、轮廓清楚、无皱褶及缺损， 染色质为细丝状或均匀的细粒，核膜周围无细菌 污染：在可计数细胞内，仔细寻找X染色质：X染 色质的特征是：染色深，轮廓消晰，平凸形、半 圆形、扁平形或三角形，大小为1—1.5um．多位 于核膜内侧缘：统计X染色质的阳性率(至少应观 察100个细胞)。
因此X染色质又称Barr小体
间期核中Barr小体为0; XXX女人的体细胞间期核中Barr小 体为2; XXXX女人的体细胞间期核中Barr小体为3.
X染色质检查的临床应用
人类卵细胞受精16天后，女性的两条X 染色体随机失活，形成Barr氏小体。
正常女性间期细胞 核中X染色质阳性率 为30％－50％，而 男性则低于1％。
体的研究联系起来；
1971年， Barr body命名为X染色质；
食道癌病人巴氏小体出现率低于10%； 正常人细胞出现率为20-45%
莱昂假说(Lyon hypothesis)
1961年,Mary Lyon 提出了阐明哺乳动物剂量补偿效应和形
成巴氏小体的X染色体失活的假说。
①哺乳动物雌性个体两条X染色体的其中一条在受精后失
染细菌等杂质
头发毛囊细胞个体稍小，观察稍显困难，优点是不受
细菌污染
（三）实验步骤
1．口腔粘膜细胞Barr氏小体显示方法
取口腔上皮细胞并涂于干净的载玻片上，自然干燥5-
10min； 1M HCl水解3-5min； 水洗3次，每次1min； 硫堇染色5-10 min； 水洗去染料，显微镜观察； 若染色过深或有大量染料结晶，可用95%乙醇分色35sec，水洗去酒精，镜检。
X染色质
核 膜
性别的快速鉴定 胎儿性别鉴定
巴氏小体鉴别特征
一般出现在细胞分裂周期的间期；
直径为lμm左右； 靠近核膜的边缘，核膜清晰；
核质是网状或者颗粒状分布；
呈现微凸形、卵形、短棒形、双球形和
三角形等形状。
（二）实验材料
材料：口腔上皮细胞或头发毛囊细胞
巴氏小体染色观察
一、实验目的1.掌握人体性染色质的检测方法；2.观察人体性染色质的形态特征及存在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件；3.了解雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。
二、实验原理人类有23对染色体，其中22对为常染色体，另一对为性染色体。
女性为XX，男性为XY。
X与Y染色体有一部分是同源的，在减数分裂时可以相互配对，其余部分则不同源。
Y染色体含有很少的基因，而X染色体则含有大量的基因。
男性与女性的常染色体数目是一样的，所含有的基因数目也相等；但是女性含有两条X染色体，而男性一条X一条Y，因此女性性染色体所携带的基因剂量远高于男性，然而研究发现女性伴性遗传基因的表达剂量与男性是大体相同的，这是由于剂量补偿效应导致的。
剂量补偿效应(dosage compensation effect)定义: 在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在雌、雄性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。
也就是说，在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的酶或其它蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。
剂量补偿存在两种情况，雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化(失活)，只有一条X染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的；另一种是X染色质的转录速率不同，如果蝇雌性细胞中两条X染色体都有活性，但它们的转录速率低于雄性细胞X染色体的转录速率。
1949年M.L.Barr等研究发现雌猫神经元细胞核膜内有凝缩的深染小体，而雄性个体细胞中则没有，这一结构被称为巴氏小体(Barrbody)。
进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。
巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中X染色质随机失活形成的，在间期细胞核中呈异固缩状态(染色质高度螺旋化),贴近于核膜边缘的染色小体。
三、实验材料1.器材：显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，牙签等。
2.试剂：硫堇染液，1M HCl，蒸馏水、生理盐水。
3.材料：口腔上皮细胞。
人类X染色质的制备与观察
人类X染色质的制备与观察摘要X染色质（巴氏小体）是除一条X染色体外，其余的X染色体常浓缩成染色较深的染色质体。
本实验选取口腔粘膜细胞和毛囊细胞，通过解离、染色、压片等方法观察巴氏小体在细胞核内的分布及形态等特征，并且通过显微观察对巴氏小体进行计数，估计巴氏小体在不同性别和不同性格人体细胞中的出现率。
此外，了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点也是本实验的目的之一。
关键词X染色质（巴氏小体）口腔黏膜细胞毛囊细胞1.引言X染色质小体（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm、贴近于核膜边缘的染色小体。
巴氏小体在细胞分裂间期细胞核中出现异固缩现象，表现出浓缩、染色深、无活性的特点。
巴氏小体在不同细胞中呈现不同的形态，有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。
一般来说，正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。
1949年，加拿大学者Barr在雌性猫神经元核仁附近发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现，Barr称这种小体为“核仁随体”，并推测小体是由两条性染色体的异染色质衍化来的。
1955年，Barr在女性的口腔细胞中发现Barr body（巴氏小体），Moor与Barr 用口腔黏膜上皮细胞检测Barr body，制作出日后被广泛使用的颊涂片。
1959年，人们把性染色体异常造成的畸形与巴氏小体的研究联系起来。
1960年，Ohno和Hauschka发现，X染色质小体实际上是一条在细胞分裂间期，收缩的、异染色质化的X染色体，与核仁并无关系，也不是Barr推测的那样由两条性染色体各贡献一部分异染色质形成。
受此启发，Lyon（1961，1962）研究了小鼠X染色体连锁的皮毛颜色基因突变体，进一步指出异染色质化的X染色体可以来自父方，也可以来自母本；异染色质化的染色体在遗传上没有活性（后来的研究表明异染色质化的染色体中还是有部分基因保持活性）；这种随机失活是性别决定为XX-XY的动物为平衡两性之间性染色体上的基因剂量而采取的一种特殊的调控方式（因为Y染色体上的基因数量很少，因此雌性个体必须通过减少X染色体上基因剂量的方式使两性个体间基因剂量取得均衡），即所谓的“剂量补偿”，这是X染色体失活的意义所在。
人X染色质的观察
染色质是细胞间期核周期不同阶段的存在形式。染色质主 要有两种类型：在细胞分裂期凝缩而在间 期松散(成为弥散状)的称为常染色质；在所 有时期一直凝缩着的称为异染色质。
• 实际上异染色质又可分为两类：一类是在 各种细胞中都处于凝缩状态，最晚进行复 制的异染色质，这类异染色质不含有结构 基因，没有什么“功能”，称之结构异染 色质；另一类则是在有些细胞或在一定的 发育时期和生理条件下才表现为凝缩状态 的异染色质，这类异染色质虽含有结构基 因，但从生理上讲，绝大多数基因是失活 的，称为兼性异染色质。如X染色质就是一 种兼性异染色质
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主要仪器、材料及试剂
（１）材料 口腔上皮细胞
（２）主要仪器 显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸、 吸管。
（３）主要试剂 ①固定液 ②染色液
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主要仪器、材料及试剂
（１）材料 口腔上皮细胞
（２）主要仪器 显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸、 吸管。
（３）主要试剂 ①固定液 ②染色液
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实验方法及实验步骤
（1） 清水漱口三次以上，用灭菌牙签的钝 头刮取口腔颊部细胞(将第一次刮取物弃 去），涂于干净的载波片上使成一薄层，空 气中干燥。
（2）固定：60%冰醋酸中固定20min. （3）染色：加几滴改良苯酚品红染液染色
10-15min.清水冲去浮色。
（4）镜检： 在低倍镜下，可见口腔粘膜上皮细胞核为圆形或 卵圆形．细胞质不着色；换油镜，选择典型的可 计数细胞进一步观察，可计数细胞的判断标准是： 核较大、染色清晰、轮廓清楚、无皱褶及缺损， 染色质为细丝状或均匀的细粒，核膜周围无细菌 污染：在可计数细胞内，仔细寻找X染色质：X染 色质的特征是：染色深，轮廓消晰，平凸形、半 圆形、扁平形或三角形，大小为1—1.5um．多位 于核膜内侧缘：统计X染色质的阳性率(至少应观 察100个细胞)。
7巴氏小体
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XX
XY
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五 作业、思考题 1、绘制巴氏小体图片 2、掌握概念：巴氏小体、性染色质、X小体、
剂量补偿效应 3、巴氏小体一般位于核膜附近，为什么？ 4、请查阅相关文献指出巴氏小体研究的新进展。
4）多X个体的发现 无论有几个X，巴氏小体的数量是 N-1，也就是说只有一个X有活性。
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F/S型女人G-6PD的电泳检测
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5、研究进展
如在人类的X染色体上有大约1500万个碱基对。涉及 到几千个基因，究竟是如何调节表达的呢？进入90年代 以来取得了令人欢欣鼓舞的结果。
1）大多数X连锁的基因在胚胎发育早期的过程中表现为 稳定的失活，但是并非整条X染色体上的基因全部失活。 如xist基因，他的表达可以导致并维持它所在的染色体失 活。
XB和Xb随机失活，有活性的基因表现出相应的斑块，形 成黑黄相间的斑块。如为雄性，其基因型为XXY。
2）毛色镶嵌小鼠，黑白斑毛色镶嵌雌性小鼠 基因型为XBXb , B基因产生黑斑，b基因产生白斑。 XB和Xb随机失活，有活性的基因表现出相应的斑块，形 成黑白相间的斑块。
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毛 色 镶 嵌 小 鼠 的 成 因
生理盐水
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四 、实验步骤
（1） 取材用灭菌的牙签轻刮口腔上皮，（第一遍弃去 ，注意不要刮破上皮）涂3-4个玻片，晾干。（或刮取 发根毛囊置于载玻片上，晾干）。 （2） 加1N的盐酸水解10-15分钟。轻轻水洗，晾干。 （3） 硫瑾染色15-20分钟。 （4） 压片。 （5） 显微镜观察。巴氏小体靠近核膜边缘，染色较深 ，实际大小1-1.5μm，放大400x 后大约0.4-0.6mm 。
实验十：barr小体的观察
班级:14级生物1班姓名:王堽学号:20140322142 实验六:体细胞Barr小体的观察一．目的1.了解Barr小体的发现及其形态；2.学习人类Barr小体的检测方法；3.认识雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制；4.了解性别决定机制。
二．原理（一）异染色质及barr小体1.异染色质的介绍及其功能（1）在细胞周期中，间期、早期或中、晚期，某些染色体或染色体的某些部分的固缩常较其他的染色质早些或晚些，其染色较深或较浅，具有这种固缩特性的染色体称为异染色质（heterochromatin）。
具有强嗜碱性，染色深，染色质丝包装折叠紧密，与常染色质相比，异染色质是转录不活跃部分，多在晚S期复制。
异染色质分为结构异染色质和功能异染色质两种类型。
结构异染色质是指各类细胞在整个细胞周期内处于凝集状态的染色质，多定位于着丝粒区、端粒区，含有大量高度重复顺序的脱氧核糖核酸（DNA），称为卫星DNA（satel-lite DNA）。
功能异染色质只在一定细胞类型或在生物一定发育阶段凝集，如雌性哺乳动物含一对X染色体，其中一条始终是常染色质，但另一条在胚胎发育的第16～18天变为凝集状态的异染色质，该条凝集的X染色体在间期形成染色深的颗粒，称为巴氏小体（Barr body）。
（2）区别常染色质易被碱性染料染成浅色，或对孚尔根反应呈弱阳性。
异染色质易被碱性染料染成深，或对孚尔根反应呈阳性。
（3）功能关于异染色质的功能，目前还未深入了解。
但以下的几点是明显的。
①结构型异染色质可以加强着丝点区，使着丝粒稳定，以确保染色体分离。
②可以隔离和保护重要基因（例如NOR区的18S和28S基因），防止或减少基因突变和交换。
③促进物种分化，同源染色体可通过其异染色质区的重复序列在减数分裂时配对，这种配对能帮助染色体全长的联会。
重复序列中可以容纳突变，进而形成新的不同重复序列，由此而促进物种的分化和形成。
④有利于非必要基因在生存竞争中被淘汰。
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三、材料
人口腔黏膜细胞
四、方法步骤——人体细胞Barr氏小体的制备与观察 用灭菌牙签刮取口腔黏膜细胞； 涂片与风干（涂抹一下，不要来回涂）； 染色及压片（滴卡宝品红压片）： 染色10min后，盖上盖玻片，一头蒸馏水冲 洗，另一头用滤纸吸干。
五、观察结果——Barr body
观察人不同形态的X-染色体，并绘图
实验五 人体细胞Barr氏小体的制备与观察
一、实验目的
掌握 X - 染色质鉴别方法，识别 X - 染色质的 形态特征及部位。
二、原理
巴氏小体，又叫巴尔体（Barr body），指雌性动物的体细胞在间期 时，在核膜内面的一块染色很深的染色质。巴氏小体实际上是浓缩 了的X染色体，其上的基因不转录。 哺乳动物的雌性细胞有两个X染色体，其中一条来自母方，另一条 来自父方，在胚胎发育的早期，这两个X染色体中的一条浓缩形成 巴氏小体，因此雌性哺乳动物的体细胞中都含有一个巴氏小体和一 个能转录的X染色体，而雄性哺乳动物的体细胞有一条可转录的X 染色体和一条Y染色体。随着细胞分裂，巴氏小体也要复制，但上 面的基因从不转录。如果这个动物是三倍体，体细胞中也只有一个 能转录的X染色体，其余的X染色体都会浓缩形成巴氏小内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强 的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果 可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核 膜较远或接近核中央部位）。