HPV16的新型伪病毒对DNA特异性B细胞的靶向实验研究
人乳头瘤病毒(HPV)16,-18,-58型单克隆抗体的制备分析及初步应用的开题报告
人乳头瘤病毒(HPV)16,-18,-58型单克隆抗体的制备分析及初步应用的开题报告
一、研究背景和目的：
人乳头瘤病毒(HPV)是一种高危性病毒，能引起宫颈癌及其他生殖系统恶性肿瘤。
其中HPV16、18、58型是目前最常见的高危型HPV，对其的防治成为了当前研究的热点。
单克隆抗体技术是一种常见的分子诊断技术，能够对HPV感染的检测和治疗提供有力的支持。
本研究旨在制备人HPV16、18、58型单克隆抗体，并对其在HPV相关疾病中的应用进行初步探究，为其后续的研究提供支持。
二、研究方法：
（一）制备HPV16、18、58型单克隆抗体：
采集HPV16、18、58型阳性的标本，并将其用于免疫Balb/c小鼠。
收集小鼠脾细胞并进行融合细胞的制备。
筛选稳定的单克隆细胞，通过ELISA方法鉴定单抗。
对生产出单克隆抗体的细胞进行库存，以备后续的实验应用。
（二）对单克隆抗体的特性进行检测：
利用Western Blot方法对单克隆抗体的特性进行检测。
同时，通过比较和分析不同型号单克隆抗体间的交叉反应等性质，来评估其特异性和敏感度。
（三）初步应用：
将制备的HPV16、18、58型单克隆抗体应用于HPV相关疾病检测中。
采用ELISA或Western Blot技术进行检测，并通过对样本的结果进行分析，评估单克隆抗体的应用价值和成效。
三、研究意义：
本研究制备的HPV16、18、58型单克隆抗体，在目前的分子诊断技术中具有广阔的应用前景。
其可以应用于HPV感染的检测和治疗，为实现对宫颈癌等恶性疾病的防治提供一条新的途径。
宫颈癌组织中HPV_(16)DNA基因同源序列的检测
宫颈癌组织中HPV_(16)DNA基因同源序列的检测杨平;赵文先;伍欣星;程应雅;胡伦颖【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】1991(18)3【摘要】206例不同病理诊断的宫颈脱落细胞和宫颈组织DNA,同探针杂交,检测HPV_(16)DNA同源性序列。
结果表明:HPV_(16)DNA探针同宫颈癌脱落细胞杂交(65.2％)和同宫颈癌组织DNA杂交(66.7％),其杂交率无显著差别(P>0.05)。
宫颈炎脱落细胞DNA和宫颈炎组织DNA与HPV_(16)DNA探针杂交率间的差异也无统计学意义。
然而,宫颈癌和宫颈炎之间无论是脱落细胞或是组织DNA同探针杂交有显著差异(前者为65.2—66.7％,后者为26.1—28.5％)P<0.01。
宫颈癌和宫颈炎DNA经酶切电泳后,Southern blot杂交结果提示HPV_(16)DNA整合在癌组织基因组中。
【总页数】3页(P142-144)【关键词】子宫颈肿瘤;人乳头病毒;DNA【作者】杨平;赵文先;伍欣星;程应雅;胡伦颖【作者单位】湖北医学院病毒所分子生物学室;湖医附属二医院妇科【正文语种】中文【中图分类】R737.330.4【相关文献】1.宫颈癌组织中人乳头瘤病毒HPV16型基因组同源序列的检测 [J], 林玉纪;等2.宫颈癌组织基因组中C—MYC癌基因同源序列的检测及其临床意义 [J], 魏赛男;杨平3.广西地区子宫颈癌发病与人乳头瘤病毒感染关系的研究Ⅰ.宫颈癌组织的HPV16DNA相关序列检测及HPV型别的分布调查 [J], 古明华;李力;陈心秋;李洁;李菲;吴继宁;林玉纯;刘宝印;唐家龄;赵恒毅;张洁清4.中国妇女宫颈癌组织中HPV_(16)L_1晚期基因克隆及重组质粒的构建 [J], 谷鸿喜;凌虹;隋丽华;钟照华;郭淑元;郭彩玲5.江西地区宫颈癌及癌前病变组织DNA中HPV16型基因组相关序列的检测 [J], 郭韵玉;龚林;曾晓南;杨学志;邓水生;林玉纯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人乳头瘤病毒16型E7基因靶向调控cGAS-STING信号通路抑制宫颈癌细胞免疫功能的研究
人乳头瘤病毒16型E7基因靶向调控cGAS-STING信号通路抑制宫颈癌细胞免疫功能的研究阿尼克孜·阿不都艾尼夏日瓦娜·阿巴斯木则帕尔·太来提程祥许爱敏（喀什地区第一人民医院，喀什 844000）中图分类号R737.33 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）02-0293-06［摘要］目的：探讨HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路对宫颈癌细胞免疫功能的影响。
方法：体外构建HPV16 E7过表达和干扰质粒，转染至SiHa细胞，qPCR检测HPV16 E7 mRNA表达水平，流式细胞术检测CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。
在此基础上分别转染cGAS-siRNA和STING-siRNA至SiHa细胞，CCK8检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡。
qPCR和Western blot分别检测cGAS、STING、IFN-Ⅰ、HPV16 E7的mRNA及蛋白表达。
流式细胞术检测细胞CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。
结果：STING-siRNA+HPV16 E7过表达组CD95和MICA/B水平降低（P<0.05），CD73、CD39、CTLA-4和CD25水平升高（P<0.05）。
cGAS、STING和IFN-Ⅰ蛋白表达水平降低（P<0.05）。
STING-siRNA+HPV16 E7干扰组结果与之相反。
结论：HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路进而抑制宫颈癌细胞免疫功能。
［关键词］HPV16 E7；宫颈癌；cGAS-STING；免疫功能Human papillomavirus type 16 E7 gene targeted cGAS-STING signaling pathway to suppress immune function in cervical cancer cellsANIKEZI Abuduaini，XIARIWANA Abasi，MUZEPAER Tailaiti，CHENG Xiang，XU Aimin. The First People's Hospital of Kashgar， Kashgar 844000， China［Abstract］Objective：To explore the effect of HPV16 E7 targeted cGAS-STING signaling pathway on immune function of cer‐vical cancer cells. Methods：HPV16 E7 overexpression and interference plasmids were constructed in vitro and transfected into SiHa cells. mRNA expression level of HPV16 E7 was detected by qPCR， and expressions of CD95， MICA/B， CD73， CD39， CTLA-4 and CD25 were detected by flow cytometry. On this basis， cGAS-siRNA and STING-siRNA were transfected into SiHa cells respectively. Cell viability was detected by CCK8，and cell apoptosis was detected by flow cytometry. mRNA and protein expressions of cGAS，STING， IFN-Ⅰ and HPV16 E7 were detected by qPCR and Western blot respectively. Expressions of CD95， MICA/B， CD73， CD39，CTLA-4 and CD25 were detected by flow cytometry. Results：Levels of CD95 and MICA/B were decreased in STING-siRNA+HPV16 E7 overexpression group （P<0.05）， while levels of CD73， CD39， CTLA-4 and CD25 were increased （P<0.05）. Protein expression levels of cGAS， STING and IFN-Ⅰ were decreased （P<0.05）. Results of STING-siRNA+HPV16 E7 interference group were opposite. Conclusion：HPV16 E7 inhibits the immune function of cervical cancer cells by targeting cGAS-STING signaling pathway.［Key words］HPV16 E7；Cervical cancer；cGAS-STING；Immune function在全球妇女常见的恶性肿瘤中，宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一［1-2］。
HPV16与宫颈癌发生发现的研究进展
HPV16与宫颈癌发生发现的研究进展摘要：宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内有着较高的发病率。
现有医学证据表明，HPV（高危型人乳头状瘤）持续感染是宫颈癌前病变的必要条件，而相关数据显示，有超过99%的宫颈癌患者可检测出高危型HPV DNA的存在。
本文就HPV16与宫颈癌的发生、发现相关的研究成果进行综述。
关键词：宫颈癌；HPV16；E2基因/蛋白；研究进展宫颈癌为15-44岁女性高发的一种恶性肿瘤，在中国，宫颈癌具有较高的发病率与死亡率，有关宫颈癌的发病机制、病理改变以及诊治方案的研究备受关注。
基于现有的医学研究与文献资料来看，在宫颈癌前病变以及宫颈癌的发生、发展中，HPV持续感染是其必要条件。
HPV为鳞状上皮细胞细胞核内的小DNA病毒，具有无囊膜以及可复制等特性。
围绕HPV感染与宫颈癌发生之间的关系，有研究数据表明，在高危型HPV中，HPV16型的占比相对较高，而宫颈癌患者以及癌前病变患者也有超过半数可检测出HPV16型感染。
1 HPV16变异与宫颈癌HPV16基因组长约7900bp，一般将其分为早期区、晚期区、长期控制区以及小非编码区。
在所有宫颈癌患者中，HPV16感染型的占比相对较高。
回顾既往有关HPV16的研究，2001年，Hildesheim指出，HPV16不同变异体与宫颈癌之间的相关性存在一定的差异，HPV16变异影响着病毒的一系列活动（如持续感染、组装等），并参与到宫颈癌的发病进程之中。
2013年，Cornet等人对有关HPV16与肿瘤发生发展相关性的研究进行了Meta分析，并提出了欧洲型（E）变异体是占比最高的亚型，且此种变异与HPV持续感染、宫颈癌的进展之间有着密切关联。
上述研究表明，HPV的不同变异体与女性的宫颈癌风险相关。
2017年9月7日，Cell上的一份报道指出，并非所有的感染都是平均的：相关研究人员对5570例人类细胞、组织样本的HPV16基因组进行了分析，结果显示，该病毒由大量独特基因组组成。
HPV16 E7c与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究的开题报告
HPV16 E7c与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究的开题报告
研究背景与意义:
人类乳头瘤病毒(HPV)感染是导致宫颈癌和其他妇科癌症的主要原因之一。
感染HPV16和18型病毒株增加了罹患宫颈癌的风险，并且这两
种病毒占所有宫颈癌的70％以上。
因此，发展HPV16和18预防和治疗
新策略至关重要。
人β防御素2(DEFB2)是一种天然免疫反应分子，具有广谱抗病毒和
抗肿瘤活性。
因此，将HPV16 E7c与DEFB2基因融合可能会提高病毒病和肿瘤的免疫保护作用。
因此，本研究旨在构建HPV16 E7c和DEFB2基因的融合质粒，并研究其免疫功能，以寻求一种新的HPV16相关疾病的预防和治疗策略。
研究方法:
1.利用PCR扩增HPV16 E7c和DEFB2基因序列，并进行DNA连接。
2.将E7c-DEFB2融合基因克隆到表达载体pUC57中。
3.转化大肠杆菌DH5α菌株，并筛选获得重组融合质粒。
4.提取重组质粒进行限制性酶切和测序验证。
5.将重组质粒转染入HEK293T细胞，用Western blot检测蛋白表达。
6.合成E7c、DEFB2和E7c-DEFB2的多肽，用于实验分析多肽的免
疫反应。
预期结果和意义:
预计成功构建HPV16 E7c和DEFB2基因的融合质粒，并在
HEK293T细胞中成功表达融合蛋白。
使用合成的多肽对小鼠进行免疫，
并通过检测小鼠的免疫反应来评价E7c-DEFB2多肽的免疫效果。
如果本研究成功，本研究将提供一种新的HPV16相关疾病预防和治疗策略。
一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法[发明专利]
![一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f5a12f005b8102d276a20029bd64783e09127daa.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201511018981.3(22)申请日 2015.12.29C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)(71)申请人中国医学科学院医学生物学研究所地址650118 云南省昆明市茭菱路935号(72)发明人孙强明 席珏敏 陈俊英 潘玥王晓丹 赵玉娇 邱丽娟 姜黎明罗佳(74)专利代理机构昆明正原专利商标代理有限公司 53100代理人徐玲菊 蒋文睿(54)发明名称一种16型、18型HPV 病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法(57)摘要本发明提供一种16型、18型HPV 病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过检索NCBI 16型、18型HPV 基因组序列，获取HPV E6/E7基因序列信息，分别以31-934位点区域和41-980位点区域构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒，参照所得16型、18型HPV E6/E7目的基因序列，分别在上述位点区域内设计16型、18型HPV E6、E7荧光定量PCR 特异性引物，利用所得16型、18型HPVE6/E7标准品质粒分别检测宫颈癌患者组织样品的16型、18型HPV 病毒拷贝数。
该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，来达到对宫颈癌患者组织中的HPV DNA 拷贝数进行绝对定量的目的，从而对宫颈癌的早防、早治提供参考。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书14页 附图6页CN 105483249 A 2016.04.13C N 105483249A1.一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒：a．根据NCBI数据库中16型HPV （NCBI Reference Sequence： NC_001526.2）和18型HPV （GenBank：AY262282.1）基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物：16型HPV E6/E7的PCR正、反向引物：HPV16 E6/E7For：5'-CGT AAC CGA AAT CGG TTG AAC-3'HPV16 E6/E7Rev：5'-CAG CCT CTA CAT AAA ACC ATC-3'18型HPV E6/E7的PCR正、反向引物：HPV18 E6/E7For：5'-AAC CGA AAA CGG TCG GGA CC-3'HPV18 E6/E7Rev：5'-TAG CTT GTA CAT AAA ACC AGC-3'；b．宫颈癌组织中总DNA的提取：先将1 mL HPV组织保存液吸入1.5 mL灭菌的EP管中，以13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，向沉淀中加入1mL Tris-HCl 洗涤缓冲液，以13000rpm 在4℃下离心5min；弃上清，再加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4℃下离心5min，弃上清；向沉淀中加入200 µL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再以13000rpm在4℃下离心5min，将上清转移至0.5 mL EP 管中，在-70℃下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA；c．将步骤b所得16型、18型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别扩增16型、18型HPV E6/E7基因，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得16型、18型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得16型、18型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定16型、18型HPV标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×1023)/（Length×1×109×650）其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；（2）参照步骤（1）c所得16型、18型HPV目的基因序列分别设计下列16型、18型HPV E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：16型：HPV16 E6For：5'-TGC GAC GTG AGG TAT ATG ACT TTG-3'HPV16 E6Rev：5'-ACG GTT TGT TGT ATT GCT GTT CTA-3'16型：HPV16 E7For：5'-TTA GAT TTG CAA CCA GAG ACA-3'HPV16 E7Rev：5'-GCA CAA CCG AAG CGT AGA GTC-3'18型：HPV18 E6For：5'-ACA TTG GAA AAA CTA ACT AAC-3'HPV18 E6Rev：5'-TGC AGC ACG AAT GGC ACT GG-3'18型：HPV18 E7For：5'-AAT TCC GGT TGA CCT TCT ATG-3'HPV18 E7Rev：5'-GCT CAA TTC TGG CTT CAC ACT T-3'（3）利用步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别检测宫颈癌组织中的E6和E7拷贝数，具体检测方法如下：a．将步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10-6，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得16型、18型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log10作为Y轴分别绘制16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线，进而得到16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线方程：所述PCR反应体系如表1：表1 荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）成分体积模板 1 μl步骤（3）的荧光定量PCR特异性正向引物（10μM） 1 μl步骤（3）的荧光定量PCR特异性反向引物（10μM） 1 μl2×SYBR green Master Mix10 μl双蒸水7 μl采用的反应程序如下：b．按步骤（3）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织DNA，分别根据步骤（3）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌组织中HPV DNA的拷贝数。
HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表达载体的构建及鉴定
HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表达载体的构建及鉴定方芳;胡尔西旦·尼牙孜;武贵臻;阿布力孜·阿布杜拉;盛磊【摘要】Objective To construct the eukaryotic expression vector for human papillomavirus (HPV)E6 and E7 genes.Methods We amplified the full-length HPV-16 E6 and E7 genes from the total RNA of the SiHa cell line by RT-PCR technique and sub-cloned the gene into pLenti6/V5vector,which was identified and confirmed by DNA sequencing.The construction of E6 and E7 transfected viruses was used to package cells.Then we harvested viral supematant and determined the titer.Results The plasmid sequencing was completely consistent with E6,E7 gene sequence,which showed that the vector was successfully construc-ted.The titer of E6 was 1.5×108 TU/mL,and 2×10 8 TU/mL of E7,satisfying the requirements of the subsequent researches.Conclusion The successful construction of HPV-16 E6 and E7 gene eukaryotic ex-pression vector could lay the material foundation for furthering study of the pathogenesis of HPV E6 and E7 genes.%目的：构建人乳头瘤病毒（HPV）E6、E7基因慢病毒真核表达载体。
HPV16E7多肽对抗原特异性CTL免疫表型及其功能的影响的开题报告
HPV16E7多肽对抗原特异性CTL免疫表型及其功
能的影响的开题报告
题目：HPV16E7多肽对抗原特异性CTL免疫表型及其功能的影响
研究背景和意义：
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，人类乳头瘤病毒16型（HPV16）是其主要致病因素。
研究表明，CTL对于清除HPV感染和预防宫颈癌的发生和发展具有重要作用。
HPV16E7是HPV16的关键抗原之一，在CTL的免疫监视和清除HPV感染中发挥着重要作用。
因此，调节HPV16E7多肽对抗原特异性CTL的免疫功能和表型，对于预防和治疗宫颈癌具有重要意义。
研究方法：
本研究采用细胞培养技术，将人体外周血中的CTL分离、培养，并经HPV16E7多肽处理后收集细胞、血清和文化液，进行流式细胞术、ELISA及其他免疫学实验，分析HPV16E7多肽对抗原特异性CTL的免疫表型和功能等方面的影响。
研究内容：
1. 确定HPV16E7多肽的最佳处理浓度和处理时间。
2. 通过流式细胞术监测HPV16E7多肽处理后CTL的免疫表型。
3. 通过ELISA测定HPV16E7多肽处理后CTL的细胞因子水平。
4. 通过细胞增殖检测HPV16E7多肽处理后CTL的功能改变。
5. 探究HPV16E7多肽处理的抗原特异性CTL的免疫学机制。
预期结果：
本研究将进一步探究HPV16E7多肽对抗原特异性CTL的免疫表型和功能的影响，为研究宫颈癌的免疫治疗提供理论和实验依据。
研究预计能够得出HPV16E7多肽对抗原特异性CTL的免疫监视和清除HPV感染的影响，为临床治疗提供实验依据。
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ＨＰＶ16的新型伪病毒对ＤＮＡ特异性Ｂ细胞的靶向实验研究
【摘要】目的：构建人乳头状病毒( human papilloma virus，HPV) 16型的新型伪病毒，并检测其对DNA特异性B细胞（R4A）的靶向性。
方法：利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白，在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装绿色荧蛋白EGFP表达型质粒，形成伪病毒。
透射电镜观察病毒样颗粒( virus-like particle，VLP)的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。
结果：透射电镜观察证实病毒蛋白可自我组装成VLP，在转染R4A细胞后，荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到荧光的表达。
结论：HPV16的新型伪病毒能成功转染R4A细胞，为系统性红斑狼疮（SLE）的靶向治疗提供了理想的策略。
【关键词】人乳头状瘤病毒16型；伪病毒；靶向性
系统性红斑狼疮（SLE）主要是由多克隆自身反应性B细胞介导的自身免疫性疾病，其直接的致病因子是多克隆自身抗体，并以免疫复合物的形式造成多种组织器官损伤。
抗双链DNA抗体不仅具有诊断学价值，而且是触发SLE的主要致病性抗体[1，2]。
作为抗双链DNA抗体来源的DNA特异性B细胞，在SLE 发病中扮演关键角色[3]。
目前临床上主要使用糖皮质激素及其它广谱免疫抑制剂防治SLE，但是不良反应明显，效果有限。
因此寻求新的治疗手段成为临床上的迫切需求，以DNA特异性B细胞为靶标的干预治疗策略现已成为学者们探索的热点[4，5]。
最新研究表明人类乳头状病毒16型（Human Papillomavirus type-16，HPV16）的主要衣壳蛋白（L1）具有自身装配成病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLP）的特性，HPV16 L1还能将外源DNA分子包装成伪病毒，具有高效的细胞转染活性[6]。
另外Gaynor等[7]以抗ds-DNA抗体为亲和配基，从噬菌体随机肽库中筛选得到了多个表位肽，可模拟DNA分子与抗ds-DNA抗体结合。
其中一个序列为DWEYSVWLSN的10肽（我们命名为PD肽），与ds-DNA抗体有高亲和力。
因此PD肽在理论上可用来引导融合蛋白或基因载体对DNA特异性B细胞进行杀伤或干预。
根据以上发现，我们选择绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒与包含PD肽的病毒蛋白HPV16 L1包装成新型伪病毒。
研究用透射电镜观察病毒样颗粒的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。
我们希望该伪病毒能具有很好的靶向活性，为SLE的高效治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株：dsDNA特异性B细胞杂交瘤细胞（R4A）由美国Putterman 教授惠赠，小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，小鼠T淋巴瘤细胞（EL-4）由本研究所保存。
1.1.2 质粒、菌株和衣壳蛋白：绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒为本研究所保存。
HPV16 L1委托上海生工表达并纯化。
1.1.3 主要试剂：细胞培养基RPMI1640购自GIBCO公司，小牛血清购自华美公司。
1.1.4 主要仪器：流式细胞仪，FACS Calibur型，BD公司。
荧光显微镜NikonTE-2000。
1.2 方法
1.2.1 伪病毒的构建：将纯化的HPV16 L1 1 mg于1 ml的PBS中溶解。
溶解后的蛋白溶液在终浓度为5%的2-巯基乙醇中变性，4 ℃，16 h。
在变性的蛋白溶液中加入2 mg的表达质粒。
并将变性蛋白与质粒的混合物放于透析带中，在PBS溶液中于4 ℃透析过夜，使变性蛋白逐渐复性。
1.2.2 透射电镜观察实验：将新鲜制备的疫苗滴于200目铜网上，吸附3 min。
吸水纸吸干，晾干30 s。
以1%质量体积分数的水溶性醋酸铀负染30 s，吸水纸吸干，晾干30 s。
80 kV透射电镜观察。
1.2.3 细胞转染实验：6孔板中用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养R4A、SP2/0、EL-4，培养至融合率为50%时，加入伪病毒15μl，继续培养48 h。
1.2.4 细胞转染检测实验：转染的各组细胞于荧光显微镜下观察荧光情况，并用流式细胞仪检测转染效率。
2 结果
2.1 透射电镜观察结果：L1具有自我组装成颗粒样结构的特性。
在变性剂2-巯基乙醇的作用下，L1解离成细小的分子结构，并在PBS溶液中能逐渐复性，恢复成为原来的颗粒样结构。
在该过程中，L1能充分包装质粒分子，形成模拟病毒样结构的伪病毒，见图1。
2.2 荧光显微镜观察结果：实验用荧光显微镜观察伪病毒对R4A细胞的靶向转染能力，实验结果见图2。
在转染48 h后，荧光显微镜检测到伪病毒转染R4A组中的细胞内有绿色荧光蛋白的表达，伪病毒转染SP2/0和EL-4对照组中的细胞内只有微量绿色荧光蛋白的表达。
2.3 流式细胞仪检测结果：实验用流式细胞仪检测伪病毒对R4A细胞的靶向转染百分率，实验结果见图3。
在转染48 h后，荧光显微镜检测到伪病毒转染R4A组中的荧光阳性百分率为41.62%，伪病毒转染SP2/0组中的荧光阳性百分率为1.37%，伪病毒转染EL-4组中的荧光阳性百分率为1.64%。
3 讨论
SLE是一种潜在致命的自身免疫性疾病，其致病因素多，发病机制复杂，引起肾脏和神经系统等多器官、系统损害，已经严重危害着人类的健康。
目前对SLE的发病分子机制还不完全清楚。
在SLE患者体内能检测到许多自身抗体，
包括循环抗体和可能来源于凋亡细胞及坏死细胞的双链DNA抗体。
免疫复合物沉积在各个器官的血管壁，诱导微血管损伤，同时伴有血栓形成和炎症表现，引起血管炎，导致心、肺、肾等重要器官组织的严重并发症[8]。
目前临床上主要使用的免疫抑制剂不良作用明显、效果局限，因此科研工作者已将目光转向能特异靶向DNA特异性B细胞的治疗策略，希望能通过特异靶向杀伤DNA特异性B细胞，降低dsDNA抗体滴度，从而达到控制或治疗SLE 的目的。
当前的治疗策略有干扰DNA特异性B细胞的活化，重组免疫毒素杀伤病理性B细胞等。
但是以上方案存在着体内易降解，其血清半衰期短，其它细胞吞噬后可能造成非特异性损伤，可能诱发机体的免疫应答等不足。
因此容忍了病理性B细胞克隆的持续存在，而且其治疗效果不太稳定和持久。
最新有研究发现一种能模拟天然病毒结构的转染系统能够有效转染细胞，并介导基因的成功表达。
由于该系统具有天然病毒的结构，所以被科研人员命名为“伪病毒”。
研究证明在众多表达系统中，伪病毒具有以下特点：（1）在自然环境中并不存在，而是完全源自人工设计、构建，并且可以优化改造；（2）“病毒基因组”比较简单，不含自我复制或潜在的致癌序列，较其它病毒载体更安全；（3）病毒衣壳免疫原性弱，仅诱导机体微弱的体液免疫和细胞免疫应答，特别是产生的中和性抗体滴度很低。
因此，基于上述的成熟理论和安全可靠的方法，本研究选择伪病毒的形式来探索对DNA特异性B细胞的作用。
实验将多价串联PD肽插入到HPV16 L1中，构建暴露PD肽的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16 L1-PD，并结合绿色荧光蛋白表达质粒，制备模拟天然病毒样结构的伪病毒，希望该伪病毒能高效特异地靶向dsDNA特异性B细胞杂交瘤R4A。
透射电镜证明，在自然状态下L1具有自我组装成颗粒样结构的特性。
在变性剂2-巯基乙醇的作用下，L1解离成细小的分子结构，并在PBS溶液中能逐渐复性，恢复成为原来的颗粒样结构。
在该过程中，L1能充分包装质粒分子，形成模拟病毒样结构的伪病毒。
在转染细胞实验中，荧光显微镜和流式细胞仪检测观察到该伪病毒疫苗能高效转染R4A细胞，并介导绿色荧光蛋白的表达，而对照组细胞SP2/0、EL-4几乎没有绿色荧光蛋白的表达。