高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的分离原理
高效液相色谱法的分离原理（原创版）目录一、高效液相色谱法的基本概念二、高效液相色谱法的分离原理1.流动相与固定相的相互作用2.溶质在两相间的分配3.平衡时的计算公式三、高效液相色谱法的应用领域四、高效液相色谱法的常见故障及其排除方法正文高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种以液体为流动相的色谱分析方法，广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。
其分离原理主要基于溶质在固定相和流动相之间的分配，达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式。
在高效液相色谱法中，流动相与固定相之间应互不相溶，且具有明显的分界面。
当试样进入色谱柱后，溶质会在两相间进行分配。
在达到平衡时，溶质在固定相和流动相中的浓度会达到一定的比例关系。
通过计算公式，我们可以得到溶质在固定相和流动相中的浓度。
高效液相色谱法的应用领域十分广泛，包括但不限于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。
在医药卫生领域，高效液相色谱法可以用于药物分析、药物研发和药品质量控制等；在食品安全领域，可以用于食品成分分析、添加剂检测和农药残留检测等；在环境化学领域，可以用于水质分析、土壤污染检测和空气污染监测等。
在使用高效液相色谱法过程中，可能会遇到一些常见故障，如流动相泄漏、检测器信号不稳定、色谱柱分离效果差等。
对于这些故障，我们可以采取相应的排除和解决方法。
例如，对于流动相泄漏，可以检查流动相输送管路是否破损、接头是否松动等；对于检测器信号不稳定，可以检查检测器是否受到外界干扰、信号线是否接触良好等；对于色谱柱分离效果差，可以检查色谱柱是否损坏、固定相是否流失等。
综上所述，高效液相色谱法是一种分离效果高、速度快、应用广泛的色谱分析方法。
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高效液相色谱法的分离类型
高效液相色谱法的分离类型
高效液相色谱法的分离类型包括以下几种：
1. 正相色谱（RP HPLC）：基于样品与色谱柱中的疏水性相互作用的分离方式。
这种方法适用于非极性和低极性化合物的分离。
2. 反相色谱（RP HPLC）：基于样品与色谱柱中的亲水性相互作用的分离方式。
这种方法适用于极性和高极性化合物的分离。
3. 离子交换色谱（IEC HPLC）：基于样品与固定在色谱柱上的离子交换剂之间的离子交换反应进行分离的方法。
这种方法适用于带有离子性官能团的化合物。
4. 大孔径凝胶过滤色谱（GFC）：基于分子大小的分离方式。
通过色谱柱中的孔隙限制，可将分子分离为大分子和小分子。
5. 亲和色谱（AC）：基于样品与固定在色谱柱上的亲和剂之间的特异性相互作用进行分离。
特定的亲和剂可选择性地结合到目标化合物，将其从混合样品中分离出来。
6. 逆向相变色谱（RPC）：色谱柱填充有亲水性材料，溶剂组成为水相时用于分离非极性或低极性的化合物。
7. 气相色谱-质谱联用（GC-MS）: 气相色谱联用质谱分析仪，用于分析化合物的质量谱。
8. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）：液相色谱联用质谱分析仪，用于分析化合物的质量谱。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
高效液相色谱法的原理及影响因素
高效液相色谱法的原理及影响因素高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种在液相中进行分离和分析的高效分析技术。
它具有高分辨率、高灵敏度、良好的线性范围和广泛的适用性。
以下是关于HPLC的原理和影响因素的详细介绍。
一、高效液相色谱的原理：高效液相色谱的原理基于物质在液态流动相中的分配和吸附特性，通过调节流动相的组成和性质，控制样品成分在固定相中的分离。
高效液相色谱的基本组成包括进样器、流动相系统、柱和检测器。
1.进样器：样品通过进样器引入色谱柱中。
进样器可以分为自动进样器和手动进样器两种类型。
2.流动相系统：流动相系统由溶剂混合器、溶剂泵和压力传递系统组成。
溶剂混合器用于混合不同溶剂的比例，以制备合适的流动相。
溶剂泵用于将流动相以一定的流速送入色谱柱中，常用的泵有恒压泵和梯度泵等。
3.柱：色谱柱是高效液相色谱的核心部件。
分离是通过样品成分在柱中的相互作用和分配系数的差异实现的。
色谱柱常见的填充物包括C18、C8和氨基硅胶等，不同填充物对于不同的样品具有不同的分离效果。
4.检测器：搭配不同的检测器可以对样品成分进行定性和定量分析。
常见的检测器包括紫外可见光谱检测器（UV）、荧光检测器（FLD）、电化学检测器和质谱检测器等。
五、高效液相色谱的影响因素：高效液相色谱的分离和分析结果受多种因素的影响，包括以下几个方面：1.流动相组成：流动相的组成直接影响样品成分在固定相上的分配系数，进而影响分离效果。
流动相的成分要根据样品的性质和需要进行选择。
常用的流动相包括纯溶剂、溶剂混合物和缓冲液等。
2.流动相性质：流动相的性质包括溶液的pH值、离子强度、流速和温度等。
其中，溶液的pH值和离子强度的变化可以影响分析物的离子态，进而影响分离效果。
流速的选择要根据分析物的种类和浓度进行调整。
温度的增加可以提高分子的扩散速度，加快分离过程。
3.色谱柱：色谱柱的类型、填充物和尺寸等也对分离效果有重要影响。
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种广泛应用于物质分离、纯化和定量分析的分析技术。
其高效性能主要得益于其独特的分离模式和工作原理。
在高效液相色谱中，常用的分离模式包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。
本文将逐步解释这些分离模式的工作原理。
首先，我们来介绍反相色谱（RPLC）。
反相色谱是HPLC中最常见的分离模式。
在反相色谱中，固定相是由疏水性的支持物表面进行修饰而得到的。
样品溶液在流动相的推动下，通过与固定相之间的亲疏水相互作用来分离。
疏水性物质在反相色谱中相对亲疏水性中亲水性物质在反相色谱中相对疏水性物质分离的速度更快。
因此，反相色谱可以广泛应用于酚类化合物、脂肪酸、药物和多肽等的分离。
接下来是离子交换色谱（IEC）。
离子交换色谱是基于固定相上的阴、阳离子交换基团与样品中的离子进行离子交换作用来分离的。
在离子交换色谱中，固定相通常是一种离子交换树脂，它具有具体的功能基团，如硫酸基团、胺基团等。
在离子交换色谱中，样品溶液与离子交换树脂之间发生的离子交换反应决定着样品的分离效果。
离子交换色谱广泛应用于离子、氨基酸、蛋白质和核酸等的分离。
第三种常见的分离模式是凝胶过滤色谱（GFC）。
凝胶过滤色谱是基于样品中分子的分子大小来实现分离的。
在凝胶过滤色谱中，固定相是由合适的多孔性材料构成。
较大的分子无法穿过固定相的孔隙，因而会在流动相的推动下被留下，而较小的分子则可以穿过固定相的孔隙并进行解析。
凝胶过滤色谱常用于蛋白质、多肽、寡核苷酸和碳水化合物等的分离。
最后是亲和色谱（AFC）。
亲和色谱是基于样品分离物与固定相之间特定的亲和反应进行分离的。
在亲和色谱中，固定相常常是由一种具有亲和性和特异性的配体进行修饰得到的。
这种配体可以选择性地与目标分析物结合，而其他的干扰物则被保留下来。
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为：K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。
对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
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高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)流动相和固定相都是液体。
流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。
当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。
达到平衡时，服从于下式：式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。
LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。
上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。
现在应用很广泛（70~80%）。
2 ．液—固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。
这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。
其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm + nSa ====== Xa + nSm式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K为吸附平衡常数。
[讨论：K越大，保留值越大。
]3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)IEC是以离子交换剂作为固定相。
IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)当交换达平衡时：KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]分配系数为：DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-][讨论：DX与保留值的关系]凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)离子对色谱法是将一种( 或多种) 与溶质分子电荷相反的离子( 称为对离子或反离子) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。
其原理可用下式表示：X+水相+ Y-水相=== X+Y-有机相式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。
当达平衡时：KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相根据定义，分配系数为：DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相[讨论：DX与保留值的关系]离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。
以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。
试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。
当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：抑制柱上发生的反应：R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2OR-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。
也可用于阳离子分析。
6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)空间排阻色谱法以凝胶(gel) 为固定相。
它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。
溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。
分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。
试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。
在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。
1．进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。
这对提高分析样品的重复性是有益的。
2．输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。
高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。
流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。
这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。
3.分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。
色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。
因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。
例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。
基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。
这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。
根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。
这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。
再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
4．检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。
（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。
其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。
（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。
目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。
这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g ／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。
（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。
因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。