第七章 高效液相色谱法
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱法原理及其应用ppt课件
+ 固定相——具有生物活性的配基键 合到载体表面上形成
+ 适用于生物样品中酶、抗体、受体 等的分离
+ 分离机制：利用化学反应将固定液 的官能团键合在载体表面，使组分 在吸附－分配的过程中分离
+ 应用较广泛的色谱法：反相键合相 色谱
+ 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
+ 流动相：极性大的甲醇-水或乙腈水
+ 色谱分析法是分析化学中获得广泛应用 的一个重要分支，是一个具有强大生命 力的分离分析技术。
+ 采用高压输液泵将规定的流动相泵入装 有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离 测定的色谱方法。注入的供试品由流动 相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离， 并依次进入检测器，由积分仪或数据处 理系统记录和处理色谱信号，最终得到 各组分的色谱峰。
的缓冲溶 或一定pH 的缓冲溶
液
值的缓冲 液，可加
溶液
入改性剂
分离原理
吸附与解 吸
溶解与挥 发
可逆性的 离子交换
多孔凝胶 的渗透或 过滤
具有锁匙 结构络合 物的可逆 性离解
+ 与气相色谱法的分析方法基本相同 + 定性分析方法：
色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法 + 定量分析方法： 外标法 内标法 面积归一化法（要求每一个组分 都出峰）
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作 用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对
分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余 地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以 上液体作为流动相也可以增大分离选择性。
3．操作条件区别 GC：加温操作（※对气相色谱分离效
+ 适用于生物样品中酶、抗体、受体 等的分离
+ 分离机制：利用化学反应将固定液 的官能团键合在载体表面，使组分 在吸附－分配的过程中分离
+ 应用较广泛的色谱法：反相键合相 色谱
+ 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
+ 流动相：极性大的甲醇-水或乙腈水
+ 色谱分析法是分析化学中获得广泛应用 的一个重要分支，是一个具有强大生命 力的分离分析技术。
+ 采用高压输液泵将规定的流动相泵入装 有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离 测定的色谱方法。注入的供试品由流动 相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离， 并依次进入检测器，由积分仪或数据处 理系统记录和处理色谱信号，最终得到 各组分的色谱峰。
的缓冲溶 或一定pH 的缓冲溶
液
值的缓冲 液，可加
溶液
入改性剂
分离原理
吸附与解 吸
溶解与挥 发
可逆性的 离子交换
多孔凝胶 的渗透或 过滤
具有锁匙 结构络合 物的可逆 性离解
+ 与气相色谱法的分析方法基本相同 + 定性分析方法：
色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法 + 定量分析方法： 外标法 内标法 面积归一化法（要求每一个组分 都出峰）
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作 用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对
分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余 地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以 上液体作为流动相也可以增大分离选择性。
3．操作条件区别 GC：加温操作（※对气相色谱分离效
高效液相色谱技术
高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。
它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。
HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。
色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。
溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。
高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。
2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。
3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。
4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。
5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。
高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。
它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和检测化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
它的高效性和精密度使其成为许多实验室中不可或缺的工具。
下面将介绍高效液相色谱的使用方法，希望能为您的实验工作提供帮助。
首先，准备好实验所需的仪器和试剂。
检查色谱柱、流动相、样品溶液等是否符合要求，确保实验的顺利进行。
接下来，进行仪器的预处理和平衡。
打开色谱仪，设置好检测波长和流速等参数，进行系统的平衡和稳定。
然后，进行样品的处理和制备。
将待测样品溶解于适当的溶剂中，过滤去除杂质，使其达到适合进样的状态。
注意样品处理的过程中要保持样品的纯度和稳定性，避免对实验结果产生影响。
接着，进行进样和分离。
将处理好的样品通过自动进样器引入色谱柱中，流动相将样品分离并通过检测器进行检测。
在此过程中，需要注意流速、温度、压力等参数的控制，以保证色谱分离的准确性和重复性。
最后，进行数据的处理和分析。
根据检测器输出的信号，得到样品的色谱图谱，通过峰面积、保留时间等参数进行定量和定性分析。
同时，对实验结果进行统计学处理，评估实验的准确性和可靠性。
在实验操作的过程中，需要注意以下几点，一是要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性；二是要及时记录实验过程中的关键步骤和参数，以备后续分析和总结；三是要及时清洗和维护色谱仪器，延长仪器的使用寿命和保证实验结果的准确性。
总之，高效液相色谱是一种重要的分析技术，掌握其使用方法对于化学、生物、药学等领域的科研工作者来说至关重要。
希望以上介绍的使用方法能够为您的实验工作提供一些帮助，祝您实验顺利取得理想的结果！。
高效液相色谱法培训课件
一、高压输液系统
8
第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
1
第一节 概 述
11
第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
9
第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀， 密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
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第一节 概 述
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第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
9
第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀， 密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
7高效液相色谱法 ppt课件
1. 在食品分析中的应用
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
2021/2/20
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/2/20
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
2021/2/20
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2021/2/20
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
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五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
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(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
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(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
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五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
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(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
郑州大学药物分析课件：第七章色谱法
② 极性小，用量体积小可溶解样品。
洗脱剂：极性适中使各组分分开 极性：石油醚（烷烃）＞苯＞乙醚＞氯仿＞丙酮 ＞醇＞水＞酸，必要时采用混合溶剂或梯度洗脱。
二、实验步骤：
（1）柱均匀不能有气泡裂缝 干法 1、装柱 湿法 注意事项 （2）上层盖脱脂棉、滤纸 （3）上端保持一段溶剂 （4）吸附剂高度为
2、加样及洗脱 混合物 分段收集洗脱液 纯品
使待测离子形成中性离子对 如：阴离子型 庚烷磺酸 R-SO3十二烷基磺酸钠 钠 R SO R H RSO3 分离碱用 N 3 RN3 阳离子型：磷酸四基铵 （C4H9N+
3
·
4 9 N 分离酸时用 R COO 4 ( CH)
4 +
用途：分离在溶液中为形成离子的化合物，如：生物碱、胺类 举例：对氨基水杨酸钠中，间氯基酚的检查
分别收集 荧光
分段
影响分离因素： （1）各组分极性 （2） 洗脱剂极性
（3）吸附剂的活性
3、吸附剂和洗脱剂的选择 （1） 吸附剂
色谱专用 粘度：100-150目 碱性：PH=9~10用于烷烃、胺、生物碱 氧化铝 中性：PH=7.5 用于醛、酮、醌、酯
酸性：PH=4-4.5 用于有机酸的分离
（2）溶剂和洗脱剂 溶剂的要求：①不与吸附剂起化学反应
第三节
气相色谱法
一、概述 1、气相色谱：以气相为流动相的色谱
2、分类：固定相 重点：气-液色谱 3、分离原理：
载体+固定液 （高沸点液体）
分配型
4、应用特点： （1）高灵敏度 （2）高选择性 （3）高效能 （4）分析速度快（5）自动化程度高
5、应用范围：分析对热稳定，具有一定挥发性的样品，
二、气相色谱仪的组成 1、构成 色谱柱：U型或螺旋型 金属管、 固定液、
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轻化工程学院食品教研室
张
忠
仪器分析
高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，发展趋势是减小 填料粒度和柱径以提高柱效。
轻化工程学院食品教研室
张
忠
仪器分析
（4）检测系统
作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后 的流出物的组成和含量变化的装置。
在液相色谱中，有两种基本类型的 检测器。一类是溶质性检测器，它仅对 被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、电化 学检测器等。
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分 析气体和沸点较低的化合物，它们仅占 有机物总数的20％。对于占有机物总数 近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩 尔质量大的物质，目前主要采用高效液 相色谱法进行分离和分析。
轻化工程学院食品教研室 张 忠
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
②液相色谱固定相类型多，如离子交换 色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择 余地大；而气相色谱并不可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的 温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
轻化工程学院食品教研室
张
忠
仪器分析
（3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率 慢，柱外效应就显得特别重要；而在气 相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
例如分离苯的羟基化合物，7个组分 只需1min就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长 约170cm，柱径0.9cm，流动相速度 为30cm3· h-1，需用20多小时才能分 离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法， 只需lh之内即可完成。 又如用25cm× 0.46 cm 的 Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用 梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分。
+ Cl-
+
NR3+X张 忠
轻化工程学院食品教研室
仪器分析
一般形式： R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离 子交换反应的选择系数）：
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
硬胶主要用于离子交换和尺 寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与 二乙烯苯基交联而成。可承受压 力上限为3.5×108Pa。固定相 按孔隙深度分类，可分为表面多 孔型和全多孔型固定相两类。
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
流动相及流动相的极性
（ 1 ）可显著改变组分分离状况的流动相
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
（2）液相色谱能完成难度较高的分离 工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和 作用，样品分子只与固定相相互作用。而 在液相色谱中，流动相液体也与固定相争 夺样品分子，为提高选择性增加了一个因 素。也可选用不同比例的两种或两种以上 的液体作流动相，增大分离的选择性。
第八章 高效液相色谱法
仪器分析
知识点 １、掌握液相色谱法的基本原理及操作 ２、了解仪器结构及作用 ３、掌握定性与定量分析方法 技能点 １、掌握液相色谱仪及色谱工作站的使用方法 ２、了解其基本操作技能与日常养护 3、学会利用设备测定溶液的浓度
轻化工程学院食品教研室 张 忠
背景知识
仪器分析
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年 代发展起来的一种以液体做为流动相的分 析技术。是在气相色谱和经典色谱的基础 上发展起来的。 根据分离机制不同，分为：液固吸附色谱、 液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换 以及分子排阻色谱等类型。
轻化工程学院食品教研室 张 忠
仪器分析
轻化工程学院食品教研室
张
忠
仪器分析
（二）化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合相的液相色谱称为化 学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键 合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适 用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子 k 值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官 能团可以是各种极性的，因此它适用于种类 繁多样品的分离。
（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺 基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。
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(四）离子交换色谱法（IEC）
此法是利用离子交换原理和液相色
谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离
子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够
电离的物质，通常都可用离子交换色谱法
进行分离。它不仅适用无机离子混合物的
流路中为高压力工作状态，通常使用耐 高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
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（3）分离系统—色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包 括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、 不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其 他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得 较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内 径较大，可达25mm 以上。
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2.荧光检测器
许多有机化合物，特别是芳香族化合 物、被一定强度和波长的紫外光照射后， 发射出较激发光波长要长的荧光。 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择 性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量 级，特别适合于药物和生物化学样品的分 析。
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高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意见 图，一般可分为4个主要部分：高压 输液系统，进样系统，分离系统和 检测系统。此外还配有辅助装置： 如梯度淋洗，自动进样及数据处理 等。
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其工作过程如下：首先高压泵 将贮液器中流动相溶剂经过进样器 送入色谱柱，然后从控制器的出口 流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离，然后依先 后顺序进入检测器，记录仪将检测 器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
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（－）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能 力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大 类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承 受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成 直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果 在二氧化硅表面键合各种官能团，就是 键合固定相，可扩大应用范围，它是目 前最广泛使用的一种固定相。
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目前最常用的检测器主要有：
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器
蒸发光散射检测器
质谱检测器
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1.紫外-可见检测器
检测室
光栅
光源
二极管阵列检 测器
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紫外光度检测器（ UV ）：最小检测 量10-9g· mL-1，对流量和温度的波动不 敏感，可用于梯度洗脱。
（4）液相色谱中制备样品简单， 回收样品也比较容易，而且回收是定量 的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格 昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术 是互相补充的。
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目前高效液相色谱法已被广泛 应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、 核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、 高聚物、染料及药物等物质的分离 和分析。 高效液相色谱法的仪器设备 费用昂贵，操作严格，这是它的主 要缺点。
选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色
谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。
（2 ）亲水性固定液常采用疏水性流动相 ，即流动相的极性小于固定相的极性，称 为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。
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（ 3 ）若流动相的极性大于固定液的 极性，则称为反相液液色谱，非极 性柱也称为反相柱。组分在两种类 型分离柱上的出峰顺序相反。
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对于紫外吸收检测器，应注意选用检 测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波 长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生 强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明 的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2 列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分 折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达 最高灵敏度。
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5.示差折光率检测器
几乎所有物质都有各自不同的 折射率，因此差示折光检测器是 一种通用型检测器。灵敏度可达 10-7g· cm-3。主要缺点是对温度变 化敏感，并且不能用于梯度淋洗。
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高效液相色谱的固定相和流动相
固定相及分离柱：气相色谱中的固 定液原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。但在高效液相 色谱中，分离柱的制备是一项技术要求 非常高的工作，一般很少自行制备。
分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基
酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，
应用范围较广。
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当待分析物质电离后产生的离子可与
树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换， 其交换反应通式如下： 阳离子交换：
R
R
SO3-H+
NR3+Cl-
+ M
+ X