分子生物学实验方法(1)
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。
常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。
提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。
常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。
2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。
反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。
PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。
3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。
转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。
转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。
表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。
以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。
这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验方法(1)
分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系实验1 植物总DNA的提取和紫外分析一、实验目的了解植物DNA提取的主要方法及其原理，掌握SDS法或CTAB法抽提植物总DNA的基本程序和操作要求。
二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。
核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA 为双链环状分子。
一般地说，总DNA主要是指基因组DNA（genomic DNA），即细胞核内的染色体DNA分子。
植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和CTAB法。
CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mM NaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70％～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高。
三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等）2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。
CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）、氯仿/异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液。
四、实验方法与步骤（一）CTAB法提取植物叶片DNA1、植物组织的破碎：取0.1g新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。
分子生物学实验-实验1 DNA重组和细胞转化2015
1. 平端连接
增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率
2. 粘端连接
效率较高，加入连接酶后可立即转化，即有转化子 出现
3. 粘-平连接
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连接酶的选择：
T4 DNA连接酶：适用粘端、平端连接 可用于DNA-RNA，RNA-RNA杂交体
大肠杆菌DNA连接酶：适用粘端连接（也可用于平端， 效率低）
4
2. 实验试剂： 常规试剂通常3人一组放在桌上，部分试剂一大桌放一管
需要低温放置的试剂在讲台，需到讲台来加样，特别是酶， 加完及时放回原位
有些常规用试剂（如水，加样buffer），可室温保存，多 次使用
5
3. 离心机的正确使用：（注意安全和仪器保护）
➢ 平衡—— 15ml连同托架一起平衡，
➢
1.5ml目测体积，对应位置放置
走廊左侧有饮水机
3
实验注意事项
1. 实验用品分组（3人一组）标记，放于实验桌上。实验开 始时清点；实验结束，请各组同学将用品归于原位，整理好 本组桌面后再离开。需要回收的器皿初步冲洗后浸泡在水槽 内的盆中（如玻璃耗材等，有疑问请咨询带教老师）
实验开始前请勿乱翻动！
每组2个盆，1个桶，分别放冰，液体垃圾， 固体垃圾，结束时每组自行清理
如：Amp抗性平板
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四、实验步骤
（详见实验讲义）
1. 目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端)
注意：
1. 加样前短暂离心 2. 加样顺序 3. 保证每个样品加
入其中 4. 加样完成后混匀
后离心
目的基因片段（4.8kb），20ng/μl 4.5 μl
载体DNA（3.5kb）， 12ng/μl
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分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系实验1 植物总DNA的提取和紫外分析一、实验目的了解植物DNA提取的主要方法及其原理，掌握SDS法或CTAB法抽提植物总DNA的基本程序和操作要求。
二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。
核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA 为双链环状分子。
一般地说，总DNA主要是指基因组DNA（genomic DNA），即细胞核内的染色体DNA分子。
植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和CTAB法。
CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mM NaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70％～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高。
三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等）2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。
CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）、氯仿/异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液。
四、实验方法与步骤（一）CTAB法提取植物叶片DNA1、植物组织的破碎：取0.1g新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。
2、细胞的破碎：迅速加入1ml预热（65℃）的CTAB提取缓冲液，65℃水浴中保温30min 以上，每5min上下颠倒1次。
3、核酸的分离：12000g离心5min，吸取上清液约600µl，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。
重复操作2次。
4、12000g离心5min，取上清于一新1.5ml离心管，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇溶液，混匀，-20℃放置10-30min。
5、12000g离心10min，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。
6、核酸的溶解：加入20µlTE缓冲液或无菌水，混匀即可。
（二）DNA的定量分析核酸的纯度和浓度可以用紫外分光光度计测定，OD值代表光密度，下标数字表示光波长，DNA样品OD260/OD280值为1.8，RNA样品OD260/OD280值为2.0，表明样品纯度较好。
若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染。
OD260的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA或40μg/ml单链RNA。
1、取DNA原液5µl稀释至3.0ml，用紫外分光光度计测定230nm、260nm及280nm的吸光值。
2、DNA浓度（mg/mL）=50×（260nm的读数）×稀释倍数分光光度法是测定物质浓度的常用方法，DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强的吸收能力，因而在260nm处具有一个强烈的吸收峰；蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在280nm波段有一强烈的吸收峰，利用上述特点可以测定物质含量。
教材的公式中“50”的含义是：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260（OD是光密度optical delnsity的缩写）为1相当于50mg/mL的dsDNA（双链DNA），40mg/mL的RNA，37mg/mL的ssDNA（单链DNA）以及30mg/mL的寡核苷酸，因此若是测定RNA的含量，50应该换为40，其他物质以此类推。
3、DNA纯度：1.7<A260/A280<1.9五、实验结果处理记录提取的DNA样本的OD值并计算样本浓度。
实验2 总RNA的提取和尿素变性胶电泳一、实验目的通过本实验，学生了解RNA的结构和特点，学会使用Trizol法提取植物总RNA，学习和掌握总RNA的检测实验技术和实验原理。
二、实验原理RNA的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。
但RNA很容易被内源及外源的RNase降解，所以要得到未被降解的、不含DNA与其它杂质的RNA是进行分子生物学研究的前提。
目前较为成熟的分离RNA的方法有许多，用于植物细胞总RNA的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、SDS/酚抽提法，或应用商品化的Trizol试剂和Qiagen 等各类试剂盒进行提取。
但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，内含较多的多糖、脂质、多酚等次生代谢物，同种植物的不同组织和不同植物的同种组织材料，其RNA的提取方法也会有很大差异。
适宜的RNA提取材料处理方法也不尽相同。
Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。
三、主要仪器、试剂、耗材1、无RNA酶的1.5mlEppendorf管、枪头、研钵，微量高速离心机，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，一次性手套等。
2、实验材料：植物新鲜叶片3、实验试剂：Trizol；电泳缓冲液：0.025M柠檬酸（pH3.5）；制胶缓冲液：6M尿素+0.025M 柠檬酸（pH3.5）；上样缓冲液：6M尿素+0.025M柠檬酸（pH3.5）+20%蔗糖+0.0025%溴酚蓝四、实验步骤（一）总RNA的提取1、取0.1g左右新鲜植物叶片置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2、将粉末移入预冷的1.5ml离心管中，加入1.0mlTrizol，轻轻摇动离心管使混合均匀，室温放置5min。
3、加入0.5ml氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min后，12000rpm，4℃离心15min，上层水相移到新管中。
重复操作2次。
4、加入0.6倍体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置20min。
5、12000rpm，4℃离心15min，弃上清。
6、加入1ml 75%乙醇，12000rpm，4℃离心5min，弃上清。
7、超净台内干燥10min左右（切忌完全干燥，否则不易溶解）。
8、加20ul的0.1%DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存。
（二）尿素变性胶电泳分析1、制备2%的琼脂糖凝胶电泳。
2、上样量为5µl左右。
3、电压通常为75V左右。
实验3 RT-PCR一、实验目的通过本实验，学生了解小麦18SrRNA的特点，学会使用PCR进行反转录获得cDNA技术，学习和掌握RT-PCR的实验技术和实验原理。
二、实验原理RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR），是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。
三、器材与试剂1、实验仪器：PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，枪头等。
2、小麦18S rRNA扩增引物序列为(5'–3')：18SL：CTTCTTAGAGGGACTATGGC18SR：TACGGAAACCTTGTTACGAC四、实验步骤（一）cDNA的合成1、在冰浴的无RNA酶的PCR管中加入如下溶液：2、70℃加热3、混匀后，424、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
5、加入如下溶液，PCR扩增目的基因片段：反应程序为：94℃5min94℃30S54℃30S 30次72℃1min72℃10min4℃保存（二）1%琼脂糖电泳检测分析实验4 动物组织总DNA提取与电泳分析一、实验目的：掌握动物DNA提取的原理及步骤。
二、实验原理：动物DNA提取的材料来源可以是培养的细胞、血液、肝、脾、肾等组织，通常的方法是在有EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚/氯仿/异戊醇抽提，可以得到动物基因组DNA。
用此方法得到的DNA长度为100-150Kb。
（注：核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。
用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，其作用为：1. 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2. 解聚细胞中的核蛋白；3.与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来；4.对RNAase、DNAase有一定的抑制作用）。
三、实验材料与试剂：1、材料：蝗虫后腿股节；2、器材：移液器、水浴锅、台式离心机等；3、试剂：A液：Tris 0.05 mol/L，NaCl 0.1 mol/L，Na2EDTA 0.1 mol/L，pH 7.0~8.0；B液：5% SDS；C液：2 mg/ml Proteinase K。
酚、氯仿、异戊醇，冰乙醇（提取所用试剂）；10*TBE缓冲液、0.7%琼脂糖、上样缓冲液、EB。
4、实验方法：蛋白酶K法（酚-氯仿抽提法）四、实验步骤:配制DNA提取消化液→取蝗虫腿节肌肉→加600μl抽提液，在离心管中将肌肉磨碎→65 ℃水浴3~5 h→加入等体积的酚，8000 rpm离心10 min，取上清→加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），8000 rpm离心10 min，取上清→加入2倍体积的冰无水乙醇沉淀DNA，在冰箱中放置20 min，10000~15000 rpm离心15 min，弃上清→加入1 ml的70%冰乙醇洗涤DNA，10000 rpm离心5 min，弃上清→真空干燥→电泳检测实验5 微生物基因组DNA提取与分析一、实验目的：掌握微生物基因组DNA提取的原理及步骤。