异硫氰酸荧光素_牛血清白蛋白标记物的化学发光反应
牛血清白蛋白标准溶液的配制方法
牛血清白蛋白标准溶液的配制方法牛血清白蛋白标准溶液是一种常用的生化实验试剂，可以用于蛋白质定量、电泳、酶学等方面的实验。
下面是关于牛血清白蛋白标准溶液配制的50种方法，详细描述如下：1. 浓度为1 mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液：将1 g牛血清白蛋白粉末溶解在1 L去离子水中，封存于冰箱中。
2. 浓度为2 mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液：将2 g牛血清白蛋白粉末溶解在1 L去离子水中，封存于冰箱中。
3. 浓度为5 mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液：将5 g牛血清白蛋白粉末溶解在1 L去离子水中，封存于冰箱中。
4. 浓度为10 mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液：将10 g牛血清白蛋白粉末溶解在1 L 去离子水中，封存于冰箱中。
5. 浓度为20 mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液：将20 g牛血清白蛋白粉末溶解在1 L 去离子水中，封存于冰箱中。
6. 牛血清白蛋白标准溶液的pH调节：根据实验需求，可以使用盐酸或氢氧化钠来调节溶液的pH值。
7. 牛血清白蛋白标准溶液的过滤：使用0.22 μm的滤膜将牛血清白蛋白标准溶液过滤，以去除悬浮物和微生物。
8. 牛血清白蛋白标准溶液的保存：将配制好的牛血清白蛋白标准溶液分装到1.5 ml 离心管中，封存于-20°C的冰柜中。
9. 牛血清白蛋白标准溶液的离心：为了确保溶液中没有悬浮物，可以在室温下使用8000 rpm的离心机离心10分钟。
10. 牛血清白蛋白标准溶液的稀释：如果需要稀释标准溶液，可以使用去离子水或缓冲液来进行适当的稀释。
11. 牛血清白蛋白标准溶液的紫外吸光度测定：使用紫外吸收分光光度计测定标准溶液的吸光度，以确定其浓度。
12. 牛血清白蛋白标准溶液的滴定：可以使用低浓度的酸或碱溶液滴定标准溶液来确定其准确的浓度。
13. 牛血清白蛋白标准溶液的镇静：将冰箱中的标准溶液取出后，让其在室温下静置片刻，以让溶液达到室温。
14. 牛血清白蛋白标准溶液的搅拌：如果在配制过程中出现团块，可以使用磁力搅拌器在室温下搅拌溶液，使其均匀。
5免疫荧光技术(修改后)-2解析
生物素 生物素
亲和素
生物素 生物素
亲和素— 生物素在ELISA中使用：
三.ELISA结果的判定
（一）肉眼判定
与阳性、阴性对照颜色比较：
结果判定
1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；
2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性；
3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。
（二）片子的制作：
1.常做切片、涂片、印片，要求薄、 均匀，并与玻片充分固定。固定后不 能被洗脱。
2.注意保持抗原完整性
3.不同材料固定方法不同（无水已醇、 丙醇、聚甲醛等）
（三）荧光抗体染色法
1.直接法
待测标本固定（Ag？）
洗涤，
AgAb
+ Ab
• 快、直接、干扰因素少
• 用于检测抗原
• 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗 体,较麻烦
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
C.显微镜：普通的光学显微镜。
光路程序：
白炽光源 —— 发射紫外光or兰紫 光 —— 激发滤板 ——紫外光
——被检物（荧光染色标本）——紫 外光＋荧光 —— 抑制滤板——荧光 （显微镜下可见）
隔
光 源
热 滤 片
目镜 阻挡滤镜
激 发 滤 载玻片 片
物镜 聚光器
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。
例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。
骨钙素测定试剂盒(磁微粒化学发光法)产品技术要求利德曼生化
骨钙素测定试剂盒（磁微粒化学发光法）适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中的骨钙素含量。
1.1 包装规格100测试/盒；50测试/盒。
1.2 主要组成成分试剂盒由试剂1、试剂2、磁分离试剂、校准品和质控品组成。
注：校准品和质控品浓度具有批特异性，具体数值见瓶标签。
2.1外观2.1.1试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；2.1.2磁分离试剂摇匀后为均匀悬浊液，无明显凝集；2.1.3液体组分应无沉淀或絮状物；2.1.4包装标签应清晰，易识别。
2.2准确度回收率应在85.0%-115.0%范围内。
2.3空白限应不大于0.30 ng/mL。
2.4线性在[0.50，300.00]ng/mL的测量范围内，试剂盒的相关系数r应≥0.9900。
2.5重复性用（10.00±2.00）ng/mL和（100.00±20.00）ng/mL的样本各重复检测10次，变异系数（CV）应不大于10.0%。
2.6批间差用三个批号的试剂盒分别检测（10.00±2.00）ng/mL和（100.00±20.00）ng/mL的样本，其批间变异系数应≤15%。
2.7质控品的赋值有效性质控品的测量值应在质控范围内。
2.8 分析特异性测定浓度为5000pg/mL的甲状旁腺素（iPTH）样本，测定结果≤0.5ng/mL。
2.9 稳定性试剂盒2℃～8℃保存有效期为12个月，在有效期满后检测试剂盒的准确度、空白限、线性、重复性、质控品的赋值有效性，应符合2.2、2.3、2.4、2.5、2.7的要求。
2.10溯源性根据GB/T 21415及有关规定提供校准品的来源、赋值过程以及不确定度等内容，骨钙素校准品溯源至企业校准品，企业校准品已与上市产品比对赋值。
异硫氰酸荧光素(fitc)-葡聚糖法
异硫氰酸荧光素(fitc)-葡聚糖法异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖法是一种常用的荧光染色方法，主要用于标记葡聚糖以及其他聚糖类物质。
本文将详细介绍该方法的原理、步骤、优点和应用。
一、原理异硫氰酸荧光素（FITC）是一种荧光染料，它能与葡聚糖等聚糖发生共价键结合。
FITC在草酰胺环上有反应活性的异硫氰基，可以与聚糖的胺基反应形成络合物。
该法通过共价键结合的方式将FITC与聚糖分子连接起来，从而实现荧光标记。
二、步骤1.准备试样：将待标记的聚糖溶解在适当的缓冲液中，使其浓度在合适的范围内（一般为1-5 mg/mL）。
2.加入异硫氰酸荧光素(FITC)：将适量的FITC溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制备10-100倍稀释液。
将聚糖溶液与FITC稀释液按照一定比例混合，并在温暖的条件下搅拌反应，通常反应时间为2-4小时。
3.滤除未反应的FITC：使用分子量筛选膜（如离心凝胶柱）将反应液进行透析，去除未反应的FITC。
4.染色剂存储：将染色剂存储在阴暗、冷冻的条件下，避免光、热以及湿气的影响。
三、优点1.显著荧光信号：FITC具有强荧光特性，能够发出明亮的绿色荧光，易于观察和检测。
2.高灵敏度：FITC的共振频率在488 nm处，与常用的激光器相吻合，因此能够获得高信噪比的荧光信号。
3.稳定性：FITC标记的样品可以在不同条件下存储和使用，不易失活和褪色。
4.适用范围广：该方法适用于各种形态和结构的聚糖，包括线性聚合物、支化聚合物、天然聚糖等。
四、应用1.生物医学研究：在生物医学领域，FITC-葡聚糖法被广泛用于细胞标记、分子探针制备、免疫组织化学染色等方面。
通过标记聚糖，能够实现对特定细胞或组织的可视化观察和定量分析。
2.药物传递系统研究：聚糖在药物传递系统中具有良好的生物相容性和生物可降解性。
通过FITC-葡聚糖法，可以制备药物载体，实现对药物的靶向传递和释放。
3.环境监测：聚糖在环境监测中具有重要的应用价值。
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法-自己整理-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B0值越小。
例：A 为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。
二、仪器：1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司)三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体3、A-BSA结合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、FITC标记的A单克隆抗体6、HRP标记的A7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20)8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300)9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
临床检验技术中级《相关专业知识》试题及答案解析五
临床检验技术中级《相关专业知识》试题及答案解析五[单选题]1.不能作为荧光物质的是()。
（江南博哥）A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基联苯胺D.镧系螯合物E.4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷参考答案：C参考解析：常用的荧光物质：①荧光色素，包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明；②酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。
例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷；③镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3＋）、铽（Tb3＋）、铈（Ce3＋）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3＋应用最广。
[单选题]3.患者男，51岁，胸痛发作24小时，心悸，气短，面色苍白，心电图示有ST段抬高。
有慢性支气管炎史和20年吸烟史，查血清AST256U/L，LD4640U/L，CK560U/L，CKMB/CK18%，最可能的原因是()。
A.骨骼肌疾病B.急性肾衰C.急性心梗D.二尖瓣狭窄致右心衰竭E.肝硬化参考答案：C参考解析：心肌损伤酶谱一般指AST、LD、CK及后两者的同工酶，急性心肌梗死时心肌酶谱异常，LDH正常值≤252U/L，CK正常值为18.0～198.0U/L，患者LD和CK明显高于正常值，发作24h，最可能为急性心梗。
[单选题]4.免疫比浊法测定对抗体的要求很高，下列对抗体要求的叙述，错误的是()。
A.特异性强B.效价高C.亲和力强D.使用R型抗体E.使用H型抗体参考答案：E参考解析：免疫比浊测定法要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强，并使用R 型抗体。
根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离，H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
[单选题]5.CH50试验的判断终点为()。
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异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光反应黄春保*1 慈云祥2 常文保21(黄冈师范学院化学系,黄州438000) 2(北京大学化学与分子工程学院,北京100871)摘 要 采用反相流动注射法,系统地研究了碱性介质中和阳离子在表面活性剂C TM AB 存在下,N aClO 氧化异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光行为和化学发光反应的条件,提出了反相流动注射化学发光测定牛血清白蛋白的新方法。
该法测定牛血清白蛋白线性范围为0.08~16mg P L;检出限为0.032mg P L 。
讨论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因。
关键词 异硫氰酸荧光素,牛血清白蛋白,化学发光反应,流动注射法2001205217收稿;2001211226接受1 引 言蛋白质测定在临床医学和生命科学研究中具有重要意义。
这方面的研究引起了人们的广泛重视。
近年来,常见蛋白质测定方法的报道,其中大多是利用蛋白质与生色探针的结合作用,生成有色复合物后以分光光度法测定[1~3],少数是将蛋白质用卟吩、四环素等荧光探针标记后,用荧光光度法测定[4,5],也见有蛋白质电分析方法的报道[6]。
这些方法在临床检测和生化分析中具有一定的应用价值。
研究发现,在碱性条件下,选用某些氧化剂氧化异硫氰酸荧光素(FI TC),能产生化学发光,但强度很弱。
若在碱性介质中,将异硫氰酸荧光素标记到蛋白质分子上,生成的蛋白质标记物则更易于氧化,不仅化学发光能力极大增强,而且发光强度与蛋白质的含量呈良好的线性关系。
本文采用反相流动注射方法,研究了碱性介质中,次氯酸钠氧化异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白(B SA)标记物的化学发光行为、反应条件和阳离子表面活性剂的增敏作用,提出了反相流动注射化学发光测定牛血清白蛋白的新方法。
体系的发光强度与B SA 的含量在0.08~16mg P L 范围内呈良好的线性关系;检测限为0.032mg P L 。
由于采用反相流动注射进样方式,消除了样品背景干扰,故方法的灵敏度高,且稳定性好。
2 实验部分2.1 仪器与试剂GD 21型微光测量仪(西北有色地质研究所);LP 21型蠕动泵(北京东方仪器设备公司);自动平衡记录仪(上海大华仪表厂);821型pH 计(中山大学)。
BSA(A.R.,Sigma 公司)。
FITC 溶液(1g P L):称取50mg FI TC(第三军医大学朝晖制药厂),用5mL 0.5mol P L 碳酸盐缓冲溶液和少量水使其溶解后转入50mL 容量瓶中定容。
9.0@10-2mol P L NaClO 溶液(pH=9.5):移取1.5mol P L NaClO 溶液,适当稀释,用HCl 调节溶液酸度至pH =915(酸度计测量),然后定容,该溶液在使用前配制。
8.0@10-4mol P L C TM AB 溶液;0.5mol P L NaHCO 32Na 2CO 3缓冲溶液(pH=9.5)。
所用试剂均为分析纯,用二次蒸馏水配制溶液。
2.2 实验方法2.2.1 FITC 2BSA 标记物的制备与分离 准确称取40mg B SA 置于比色管中,依次加入1.5mL 水,0.5mL 碳酸盐缓冲溶液,摇匀后缓慢滴加1mL FI TC 溶液,混合均匀后置于冰箱(4e )中反应12h 。
用G 225色谱柱分离游离的FI TC 。
收集FI TC 2BS A 标记物并定容20mL 。
该液准确稀释250倍后用于化学发光体系的条件实验。
2.2.2 测定方法 采用反相流动注射法。
测定装置流程和抽取试液速度、试液混合顺序如图1所示。
NaClO 溶液通过旋转六通阀注入,每次注射体积为100L L 。
试液在流动过程中混合,并立即流进发光仪第30卷2002年4月 分析化学(FE NXI HUA X UE) 研究简报Chinese Journal o f Analytical Chemistry 第4期447~449图1 流动注射体系 Fig.1 Schematic diag ram of the flo w injection system P.蠕动泵(peri staltic pum p);S.注射器(i njec tor);D 1检测体系(de tection s ys te m);R 1记录仪(recorder);W 1废液(w as te);R 1.fluorescein is othioc yanate 2bavine serum albumin (FITC 2B SA);R 2.8.0@10-4m ol P L cetyl trim ethylam monium brom ide ;R 3.9.0@10-2m ol P L NaCl O 。
检测化学发光强度,以响应信号峰高进行定量分析。
3 结果与讨论3.1 发光性质在选定的条件下,对FITC 、BS A 和FITC 2BSA 标记物进行了化学发光实验。
结果表明:FITC 能被氧化而发光,但发光能力不强;BS A 未观察到氧化发光现象;FIC T 2BS A 标记物却具有很强的氧化发光能力。
向含有标记物的试液中注射NaClO 溶液3s 后即有光响应信号,10s 时响应信号达最大值,随后迅速消失。
由此可见,FI TC 2BS A 2ClO -2C T M AB 化学发光体系是快速化学发光体系。
3.2 表面活性剂的选择和用量的影响实验了阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂的增敏作用。
结果表明,仅阳离子表面活性剂对FI TC 2BS A 2ClO -体系的化学发光有增强作用。
在比较溴化烷基三甲胺类和溴化烷基吡啶类阳离子表面活性剂的增敏效果时,发现溴化烷基三甲胺类的增敏作用强于溴化烷基吡啶类;而在同类阳离子表面活性剂中,当主碳链上碳原子数n \14时,其增敏作用随主碳氢链的增长而依次增加。
由于C T M AB 能使体系的化学发光强度增大30倍且体系的发光强度稳定,故C TM AB 被选用。
进一步的实验表明,C TM AB 浓度在4.0@10-4~1.0@10-3mol P L 范围内,体系的化学发光强度最大且稳定。
实验选用C T M AB 的浓度为8.0@10-4mol P L 。
3.3 酸度的影响通过调节NaClO 溶液的酸度来控制化学发光反应体系的酸度。
在充分搅拌下,向NaClO 溶液中缓慢加入稀HCl 或NaO H,用酸度计测量溶液的酸度,制备不同酸度的NaClO 溶液。
实验了酸度对体系化学发光强度的影响,结果表明NaClO 溶液的pH 在8.5~10.5范围内,体系的化学发光强度最大且稳定。
当酸度太高或太低,都会使体系的化学发光强度显著降低。
实验选用pH=9.5的NaClO 溶液。
3.4 NaClO 浓度的影响实验了NaClO 溶液的浓度对体系化学发光强度的影响。
结果表明:当NaClO 的浓度大于6.0@10-2mol P L 时,体系的发光强度达到最大且稳定。
为减少调节NaClO 溶液酸度时逸出Cl 2对工作环境的污染,实验中选用9.0@10-2mol P L NaClO 溶液。
3.5 工作曲线结果表明:在选定实验条件下,标记物中B SA 含量在0.08~16mg/L 范围内,化学发光强度与BS A 含量呈良好的线性关系。
线性方程为I C l =- 3.5+21.83C (mg P L),相关系数r =0.999(n =10);方法的检测限为0.032mg P L 。
对含0.8mg P L B SA 标记物平行测定11次,其相对标准偏差为1.8%。
由此可见,该法的灵敏度高,重现性好。
3.6 FITC 2BSA 发光能力增强作用的探讨FI TC 和FI TC 2BS A 标记物的结构分别如图2和图3(为方便讨论,结构式中苯环上的碳原子以数字标示),它们均属三苯甲烷类酸性染料的衍生物。
该类物质被氧化,能生成苯多酚而产生化学发光,其化学发光能力与分子中C 9和C 14间的P 电子密度差(D 值)的大小和分子间的能量转移有关。
C 9和C 14间的P 电子密度差越大(D 值越大),其发光能力越强;减少激发分子的非辐射能量损失,有利于提高体系的发光强度[7]。
在碱性介质中,用NaClO 氧化FITC 和FI TC 2BS A,均是由于生成苯多酚发光。
因此,在标记物中发光母体仍可以认为是FITC 。
在相同的反应条件下,FITC 2B SA 标记物的化学发光能力远远大于游离FI TC 的化学发光能力。
究其原因,我们认为主要是标记物中发光母体的结构变化所致。
由图3可见,在FITC 分子中C 17上连接的是异硫氰基,而在标记物中,FI TC 的异硫氰基与蛋白质的自由氨基经448 分析化学第30卷碳酰胺化而形成了硫碳氨基键,这种基团结构的改变导致了共轭体系中碳原子上的P 电子密度的改变。
我们采用半经验法PM 3分别计算了FI TC 和FI TC 2BS A 分子中共轭环上碳原子的P 电荷密度,并由此计算出C 9和C 14之间的D 值分别为D FI TC =0.092和D FI TC 2B SA =0.103。
故FI TC 2BSA标记物的化学发光能力更强。
图2 FITC 的结构式Fig.The structure o fFITC 图3 FITC 2B SA 的结构式 Fig.3 The structure o f FITC 2B SARefer ences1 Wei Yongju(魏永巨),Li Kean(李克安),Tong Shenyang(童沈阳).Chem .J .Chinese U niv ersities (高等学校化学学报),1996,17(11):1687~16922 Hu Qiuluan(胡秋娈),Li Na (李 娜),Zhao Fenglin(赵风林),Li Kean(李克安),To ng Shenyang(童沈阳).Chinese J .Anal .Chem .(分析化学),1999,27(2):166~1693 Zaia D A M,Verri W A,Z aia C T B V.Talanta ,1999,49(2):373~3764 Huang Zuy un(黄祖云),Y ue G uihua(岳贵花),Chen Z henhua(陈震华),X u Li(许 莉),Z hang Zong xian(张宗显).Jou r nal o f Analytical Science (分析科学学报),1997,13(3):213~2155 So ng Go ngw u(宋功武),Feng G uangro ng(冯光荣),Li Ying(李 瑛),W an Liyuan(万里元).Chinese J .A nal .Chem .(分析化学),2000,28(5):6596 Williams K M,Ekstroem J,Marshall T.Electro pho res is ,1999,20(7):1373~13817 Chen G N,Huang C S.Talanta ,1988,35(8):625~631Study on Chemiluminescence Reaction of Fluorescein IsothiocyanateLabelled Protein by Flow Injection MethodHuang Chunbao *1,Ci Y un xiang 2,Chang W enbao 21(D epartment o f Chemistry ,Hua n ggang Teacher c s Co llege ,Huangzhou 438000)2(College o f Chemistry and Mo lecular Enginee ring ,Peking U niv ersity ,Beijin g 100871)Abstract The che miluminescence characteristic of bovine serum albumin (BS A )labelled with fluorescein isothiocyanate (FITC)has been studied.The experimental conditions for the B SA 2FI TC 2ClO -2C TM AB (cetyltrimethylammonium bromide )chemiluminescent system were optimized.Based on the relation between che miluminescence intensity and protein concentration a flow injection assay method has been established f or the quantitative deter mination of bovine serum albumin.The linear range for BS A is 0.08~16.0mg P L,the detection limit is 0.032mg P L.The relative standard deviation (n =11)f or the determination of 0.8mg P L BS A is 1.8%.The enhancement effect of che miluminescence characteristic of protein labelled w ith FI TC is discussed.Keywor ds Fluorescein isothioc yanate,bovine serum albumin,che miluminescence reaction,flo w injection method(Received 17May 2001;accepted 26Novem ber 2001)449第4期黄春保等:异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光反应。