菌种保存、传代、使用、销毁管理规程_操作规程完整

菌种管理制度 1、 目的 建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的 管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的 准确可靠。

2、 适用范围 本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及 销毁等。 3、 定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干 燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种 ，用于传代 及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后 ，作为日常工作 使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌 种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第 0代。 4、 职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、 规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购 流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省 （市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或 传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整 性，同时将菌种的所有信息，填写在标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编 号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其 暂贮存于4〜8°C冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上 ，待菌生长 充分以后，转移至4〜8C冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查 其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类 而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种 . 学习参考学习参考

一次。 532传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 5.3.2.1甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔 ，并通过接 种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中 ，调整 菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油 (浓 度20%)，即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在 -30 C冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第 2代(G2)。可以每隔2年转种一代。使用 时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏 ，挑取纯菌落传代或工作 用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏 (如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙 型副伤寒沙门菌)。 5.322液体石蜡保存法 5.322.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用 牛皮纸包好，在121C灭菌30分钟，置40C恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。 5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下 培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内 ，并使石 蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20C冷冻或2〜8C冰箱 中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽抱杆菌的保存(如枯草芽抱杆菌、白 色念珠菌、黑曲霉菌等)。 5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1

表1传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限 菌种名称 保存方法 保存温度 保存期限

大肠埃希菌CMCC(B)44102〕

甘油冷冻管 -30C 2年 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003〕 铜绿假单胞菌(CMCC (B) 10104) 枯草芽抱杆菌CMCC(B)63501 : 乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094〕 白色念珠菌CMCC(F)98001〕 液体石蜡管 2-8C 1年 黑曲霉菌CMCC(F)98003 学习参考

5.4菌种的处理和保藏 541标准菌株的复苏、确认、传代 5.4.1.1标准菌株的复苏 5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。 5.4.1.1.2培养基 改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮； 液体硫乙醇酸盐培养基：用于生抱梭菌复苏、复壮； 营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙 门菌、短小芽抱杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮； 改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮 5.4.1.1.3标准菌株的复苏操作步骤： 以下操作均在生物安全柜内进行。 a） 在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 b） 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因 为安瓿遇热时可能会破裂）。 c） 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.5〜0.8 ml到安瓿中。 d） 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解 。 e） 用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基 。 f） 根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度 （细菌培养温度 30〜 35 C,培养18〜24小时；真菌培养温度23〜28 C,培养3〜5天。观察是否浑浊，浑 浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至 7天，真菌应延长培养时间 至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 g） 若黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体 1〜2滴滴 在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23〜28C培养5〜7天，斜面正面为黑 褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确 认后用含有0.05% （ml/ml ）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。 h） 取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以 无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20%的无菌甘油混匀，1~2ml/管，分装于冻存 管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进 行相应的确认，其余作为储备管在-30 C冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下方法进行 复壮，制成复壮后的抱子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中 1~2ml/管 加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于 -20 C冷冻或2〜8 C冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管 进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘 贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条 件、有效期至等。 i）储备菌种管制备成功,储存于-30 C,有效期为两年。 541.2标准菌株的确认 学习参考

a） 用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂 （TSA）培养基（细菌）或沙氏葡 萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板 上。 b） 然后在30〜35 CT培养3天（细菌）；20〜25 CT培养5天（真菌和酵母菌）。 c） 培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落， 划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进 行保存和鉴定。 d） 鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进 一步鉴定该菌种。 e） 若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了 的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。 f） 菌种的确认结果，记录在〈菌种鉴定记录》上。 g） 各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见〈菌种复活、划线用培养基、培养条件》 （附件2）。 5.4.1.3菌种的传代 5.4.1.3.1标准菌株的传代 a） 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后 转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代 （G2）。 b） 菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管 ，作 为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作 用菌种，此为第3代（W3 ）。 c） 将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后 用于日常检验。 d） 取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种制成 冷冻保存管第3代（G3）;斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作 用菌种，此仍为第3代（W3 ）。 e） 将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭 活处理后丢弃。 f） 按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操 作，保存和使用菌种。 g） 当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下 一代工作用菌种。 54132传代用菌的传代 将购回无异常的传代用菌种 （一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取 纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种（为第4代），同时，结合菌种的代数和最长保 存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按 “5.3.2 •的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支 ， 作为传代用菌种（仍为第3代）。