场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
扫描电镜标本制备技术[资料]
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扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。
冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。
Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。
粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。
SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。
参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。
扫描电镜实验步骤
扫描电镜实验步骤
扫描电镜是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察微小的物体表面结构。
在进行扫描电镜实验时，需要按照以下步骤进行操作。
第一步：样品制备
样品制备是扫描电镜实验的关键步骤之一。
样品应该具有一定的厚度和尺寸，以便于在扫描电镜中进行观察。
通常情况下，样品需要进行固定、切片、染色等处理，以便于观察。
第二步：样品表面处理
在进行扫描电镜实验之前，需要对样品表面进行处理。
这是因为扫描电镜只能观察样品表面的结构，而不能观察样品内部的结构。
常用的样品表面处理方法包括金属喷镀、碳喷镀、真空蒸镀等。
第三步：扫描电镜操作
在进行扫描电镜实验时，需要将样品放置在扫描电镜的样品台上，并调整扫描电镜的参数，如电子束的加速电压、扫描速度、探针电流等。
然后，通过扫描电镜的探针扫描样品表面，将样品表面的结构转化为电子信号，并通过电子显微镜将其显示出来。
第四步：图像处理和分析
在获得样品表面的图像之后，需要对图像进行处理和分析。
常用的
图像处理方法包括增强对比度、去噪、调整亮度和对比度等。
而图像分析则可以通过计算机软件进行，如图像分割、形态学分析、三维重建等。
扫描电镜实验是一项复杂的实验，需要进行样品制备、样品表面处理、扫描电镜操作和图像处理和分析等多个步骤。
只有在严格按照实验步骤进行操作的情况下，才能获得准确的实验结果。
扫描电镜操作规程
扫描电镜操作规程扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种将电子束聚焦在样品表面，通过扫描方式来获得样品高分辨率3D表面形貌和成分信息的仪器。
为了确保SEM操作的有效性和安全性，以下是SEM操作规程。
一、设备准备：1.认真阅读并了解SEM操作说明和安全规范。
2.检查SEM主机和附件是否处于正常工作状态，包括真空度、电源和冷却系统。
3.确保SEM试样台和样品夹具是干净的，无油污和灰尘。
二、样品处理：1.样品制备前，需要了解样品性质和要求，选择合适的样品制备方法。
2.对于生物样品，应优先使用冷冻切片等方法固定样品形态，以避免形变。
3. 样品尺寸应适合SEM观察，常规样品尺寸为10mm×10mm。
三、真空系统操作：1.打开SEM干净室门前，请先关闭室门内的LED灯进行暗室操作。
2.打开真空系统电源，并调节抽真空系统排气阀门，观察真空度是否达到工作要求。
若真空泄漏现象，请通知维修人员。
3.室外样品台安装完成后，请确保样品台和附件干净，并将样品固定到样品夹具上。
4.朝样品夹具上的固体样品均匀喷涂金属薄层来提高导电性。
四、SEM主机操作：1.打开SEM主机电源开关，仪器会进行自检程序，确认系统启动正常后才能进行操作。
2.将SEM控制软件打开，并加载上一次使用的配置文件，确认加热丝和工作功能正常。
3.调节电子枪电流和加速电压，以达到最佳分辨率和清晰度。
4.运用选择二级电子或回散二级电子来实现图像形成，根据具体需求调整像素率和扫描速度。
五、SEM样品观察：1.在获得清晰的样品图像之前，调整样品和悬臂梁的位置，以保证电子束准确的投射到样品表面。
2.调节电子束扫描范围、分辨率和时间，以获得高质量的SEM图像。
六、SEM样品操作结束：1.操作完成后，关闭SEM主机电源开关和控制软件。
2.关闭系统真空排气阀门，并观察真空泵的运行情况，确保真空度恢复正常。
3.清理和保养SEM主机和附件，如清除样品夹具上的残留物。
场发射扫描电子显微镜(S-4800)操作规程
场发射扫描电子显微镜（S-4800）操作规程开机1. 检查真空、循环水状态。
2. 开启“Display”电源。
3. 根据提示输入用户名和密码，启动电镜程序。
样品放置、撤出、交换1. 严格按照高度规定高样品台，制样，固定。
2. 按交换舱上“Air”键放气，蜂鸣器响后将样品台放入，旋转样品杆至“Lock”位，合上交换舱，按“Evac”键抽气，蜂鸣器响后按“Open”键打开样品舱门，推入样品台，旋转样品杆至“Unlock”位后抽出，按“Close”键。
观察与拍照1. 根据样品特性与观察要求，在操作面板上选择合适的加速电压与束流，按“On”键加高压。
2. 用滚轮将样品台定位至观察点，拧Z轴旋钮（3轴马达台）。
3. 选择合适的放大倍数，点击“Align”键，调节旋钮盘，逐步调整电子束位置、物镜光阑对中、消像散基准。
4. 在“TV”或“Fast”扫描模式下定位观察区域，在“Red”扫描模式下聚焦、消像散，在“Slow”或“Cssc”扫描模式下拍照。
5. 选择合适的图像大小与拍摄方法，按“Capture”拍照。
6. 根据要求选择照片注释内容，保存照片。
关机1. 将样品台高度调回80mm。
2. 按“Home”键使样品台回到初始状态。
3. “Home”指示灯停止闪烁后，撤出样品台，合上样品舱。
4. 退出程序，关闭“Display”电源。
注意1. 每天第一次加高压后，进行灯丝Flashing去除污染。
2. 冷场发射电镜一般不断电，如遇特殊情况需要大关机时，依次关闭主机正面的“Stage”电源、“Evac”电源，半小时后关闭离子泵开关和显示单元背面的三个空气开关，关闭循环水。
开机时顺序相反。
3. 每半个月旋开空压机底阀放水一次。
4. 待测样品需烘干处理，不能带有强磁性，不能采用铁磁性材料做衬底制样。
5．实验室温度限定在25±5℃，相对湿度小于70% 。
仪器维护1. 每月进行电镜离子泵及灯丝镜筒烘烤。
2. 每半年进行一次机械泵油维护或更新。
扫描电镜 样品制备方法
扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。
二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。
用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。
三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。
＊整个过程，样品不要暴露于空气。
1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。
四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。
五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。
用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。
玻片过大或者过厚影响观察效果。
2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。
3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。
离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。
样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。
4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。
将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。
（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。
5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。
磷酸盐缓冲液(PBS)a.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。
扫描电镜流程
扫描电镜样品制备流程
1.样品准备与固定（实验室完成）
a)固体培养样品：在固体琼脂平板上培养至合适阶段，用刀片切5mm*5mm大小样
品2至4块，置于预冷的2.5%戊二醛-PBS溶液中，4℃固定2小时以上或过夜；
b)液体培养样品：在液体培养基中摇培至合适阶段，离心去上清，加入预冷的2.5%
戊二醛-PBS溶液，轻轻弹起混匀，4℃固定2小时以上或过夜；
2.样品梯度脱水（实验室或平台）
a)准备50%，70%，85%，95%，100%乙醇溶液；
b)梯度脱水操作：
i.固体样品可以直接置于2ml EP管中操作，液体样品离心后去上清，将样品取
出置于滤纸中包好；
ii.分别用50%，70%，85%，95%乙醇脱水15分钟；
iii.用100%乙醇脱水3次；
3.样品超临界流体干燥（平台）
4.样品喷金（平台）
5.扫描电镜观察（平台）。
场发射电子显微镜的样品制备方法
场发射电子显微镜的样品制备方法场发射电子显微镜（Field Electron Microscope，简称FEM）是一种常用于观察材料微观结构的高分辨率显微镜。
在使用FEM进行样品观察前，必须进行样品制备，以确保得到清晰且可靠的图像。
本文将介绍一些常见的场发射电子显微镜样品制备方法，并探讨它们的优缺点。
首先，常见的样品制备方法之一是机械研磨。
这种方法适用于较硬的材料，如金属和陶瓷。
制备过程中，需要使用砂纸、研磨液和研磨机等工具。
首先，用较粗的砂纸对样品进行粗磨，以去除表面污物和不平整处。
然后，逐渐使用精细砂纸进行研磨，直到得到平滑的表面。
最后，使用亮度研磨材料进行最后的抛光，以减少表面粗糙度。
然而，机械研磨方法有一定的局限性。
首先，它对材料的要求较高，只适用于较硬的材料。
其次，研磨过程中难免会产生机械变形和残留应力，可能导致样品结构的改变。
除此之外，机械研磨法还需要较长时间，且对操作人员的技术要求较高。
另一种常见的样品制备方法是电解抛光。
该方法适用于各种材料，特别是对于软材料和易氧化的材料具有较好的效果。
制备过程中，需要将样品置于电解槽中，通过在电解液中加入适当的抛光剂，通过电流控制和短时间的抛光，有效地去除样品表面的氧化物和不均匀物质。
然而，电解抛光方法也存在着一些问题。
首先，由于电解液中的化学成分和操作条件的不同，可能导致样品表面的化学成分和形貌发生改变。
因此，在选择电解液和抛光条件时，需要根据具体要求进行合理的选择。
其次，电解抛光需要关注电流的选择和控制，以避免过度抛光或抛光不均匀的问题。
此外，电解抛光需要较为复杂的设备和操作步骤，对操作人员的技术要求较高。
除了机械研磨和电解抛光之外，还有一些其他的样品制备方法，如离子刨削、化学刻蚀等。
离子刨削是利用离子束撞击样品表面，去除表面原子层的方法。
这种方法适用于各种材料，可以得到较低表面粗糙度和较少的机械变形。
然而，离子刨削过程中可能会导致样品表面的化学变化和电荷效应，需要进行相应的补偿和处理。
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场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy）是一种高分辨
率的电子显微镜技术，可用于观察和分析各种材料的表面形貌和微观结构。
为了获得清晰的显微图像，样品制备和操作步骤非常重要。
一、样品制备
1. 样品的选择：场发射扫描电镜适用于不同种类的材料，如金属、陶瓷、聚合
物等。
选择合适的样品很关键，它应具备研究对象的特性，并且能够承受电子束的辐照。
2. 样品的固定：为了保持样品的形状和结构不变，通常需要将其进行固定。
对
于固态材料，可以使用金属夹片或导电胶进行固定。
对于液态材料，可以将其冷冻或凝胶化，以保持其形状。
3. 样品的切割和打磨：有时候，需要将样品切割成适当的尺寸，以便放入样品
架中。
这可以通过使用金刚石切割机、电解或机械研磨仪器等设备来完成。
4. 样品的真空处理：在将样品放入场发射扫描电镜前，通常需要将其进行真空
处理。
这可以通过将样品放入真空干燥器中、在低压下进行加热或冷冻干燥来完成。
真空处理有助于去除空气中的水分和气体，以减小背景干扰。
二、操作步骤
1. 打开电镜系统：在开始操作前，需要将场发射扫描电镜系统打开并进行预热。
预热时间通常需要几十分钟，以保证系统内部达到稳定的工作温度。
2. 放置样品：将样品放置在样品架上，并确保其良好接触。
对于粉末状样品，
可以使用导电胶将其固定在样品支架上。
对于固态样品，可以使用金属夹片固定在样品架上。
3. 调整显微镜参数：通过调整电子束能量、聚焦、工作距离等参数，来优化扫描电子显微镜的成像质量。
这些参数的选择取决于样品的特性和所需的分辨率。
4. 开始观察：一切准备就绪后，可以开始观察样品。
通过控制电子束的扫描和探测系统，可以获得样品的表面形貌和微观结构的信息。
在观察过程中，要注意避免样品表面的污染和损坏。
5. 数据分析：场发射扫描电镜获得的图像可以进一步进行数据分析。
可以通过对图像进行增强、测量尺寸和形状、进行结构分析等手段，来得到更详细的样品信息。
总结：
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤决定了获得高质量图像的能力。
正确的样品制备过程可以提供清晰的表面形貌和微观结构信息，而精确的操作步骤可以优化电镜成像效果。
在进行场发射扫描电镜实验前，研究人员需要充分了解样品的特性和所需的分辨率，并且严格按照操作步骤进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
通过场发射扫描电镜技术，我们可以更深入地探索材料的微观世界，为科学研究和工业应用提供有力支持。