PCR扩增的原理和操作步骤
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常见的分子生物学方法，它可以快速、特异地扩增指定DNA序列，使其生成高精度的结果。
PCR是一种复杂的反应，但它的操作简单易学，变异及优化也相对简单。
由于它在生物学和医学研究中起着重要作用，因此认识其原理和操作让学者受益匪浅。
一、PCR的原理PCR是一种高效的PCR扩增方法，它利用特定的双螺旋DNA序列上的原核聚合酶作为标记，以及特定的模板序列，来实现对DNA 构建的扩增。
这种扩增过程通过重复建立定向复制来实现，该过程是以三个基本步骤为特征：建立、扩增和重组。
建立步骤是通过原核聚合酶（Taq）将双螺旋DNA序列的3‘端与模板序列上的5’端配对的过程。
这个过程被称为primer平衡，它利用模板序列前后的双链DNA，通过配对合成特定序列的核苷酸，从而形成一个新的DNA二聚体。
扩增步骤利用聚合酶的功能，以双螺旋DNA为模板，合成一条短的DNA条带。
在这个过程中，聚合酶将给定的核苷酸与模板序列上的一对核苷酸配对，并将front end在模板序列上已配对的核苷酸复制一次。
这一步骤可以重复多次，从而形成一条由少量核苷酸构成的DNA条带。
重组步骤是扩增过程中最后一步，是DNA双螺旋在高温条件下重新组装的过程。
当DNA双螺旋分裂，重新组装时，其中一个螺旋将配到模板序列上的DNA另一螺旋上，从而形成一对正反对称的DNA。
此外，这一步还会导致重组的DNA序列崭露出来，形成双聚体，并伴随着一些特异性多聚体的形成。
二、PCR的步骤PCR的步骤大体如下：1.样本准备：在实验中，要使用的样本是由某种实验物质（如DNA，RNA等）组成的混合液，因此需要将实验物质分离并准备好。
2.DNA扩增：在DNA扩增步骤中，混合液中的DNA片段将在指定温度下经历几次复制，从而形成大量的高精度的DNA片段。
3.电泳：在电泳步骤中，将DNA片段放入泳管中，然后电压按照指定的条件施加，以分离不同长度的DNA片段。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增DNA片段，能在短时间内从极少量的DNA样本中大量产生目标DNA片段。
PCR的原理和操作步骤如下：PCR原理：PCR是通过逐渐增加的方式在体外复制DNA片段的技术，它包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将含有目标DNA的样本加热至94-96℃，使DNA双链解开，产生两个单链DNA。
2. 退火（Annealing）：将温度降至50-65℃，引入一对寡核苷酸引物/引模，它们在目标DNA的两个末端特异性结合。
引物的设计与目标DNA的序列互补。
其中的一段是在目标DNA序列的正向链上引物，另一段是在反向链上的引物。
3. 延伸（Extension）：将温度升至72℃，引入热稳定的DNA聚合酶，使其延伸引物，生成新的DNA链。
延伸的速度约为300-1000个碱基每分钟。
如此一来，经过一次PCR循环，两条由引物引导的DNA链将被复制一次，重复进行多次PCR循环，DNA量会呈指数增长。
PCR操作步骤：1.DNA模板制备：从细胞中提取DNA，常用方法有裂解法和酶切法。
通过这些方法获得的DNA片段可作为PCR的模板。
2.引物设计：根据所需扩增的DNA序列设计引物。
引物通常由15-30个核苷酸组成，选择引物时要注意避免二聚体形成和引物之间的副产物形成。
3.反应体系设置：将PCR反应液配置至PCR试管或96孔板中，反应体系一般包括PCR缓冲液、dNTPs、模板DNA、引物、Mg2+离子和聚合酶等成分。
4.PCR循环程序：通常包括初步变性程序、循环变性程序和末端延伸程序。
初步变性程序为94-96℃，1-3分钟；循环变性程序为94-96℃，10-30秒；退火温度为50-65℃，20-60秒；延伸温度为72℃，20-60秒，延伸时间根据目标片段的长度确定，每一循环的延伸时间通常为片段长度的1-2秒。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学中广泛应用的技术，用于快速扩增特定的 DNA 片段。
这项技术的发明极大地推动了生物学、医学、遗传学等领域的研究和发展。
PCR 扩增的原理基于 DNA 的半保留复制机制。
简单来说，就是通过模拟细胞内 DNA 复制的过程，在体外实现特定 DNA 片段的大量扩增。
在 PCR 反应中，需要以下几个关键的要素：1、模板 DNA：这是我们想要扩增的目标 DNA 片段。
2、引物：是一小段与模板 DNA 两端特定序列互补的寡核苷酸，它们决定了扩增的起始位置和范围。
3、四种脱氧核苷酸（dNTPs）：分别是 dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，作为合成新 DNA 链的原料。
4、 DNA 聚合酶：能够催化新的 DNA 链合成。
5、缓冲液：提供适宜的反应环境，维持 pH 值和离子强度等条件的稳定。
PCR 扩增的过程通常包括三个主要步骤，即变性、退火和延伸，这三个步骤不断循环，使得 DNA 片段得以指数级扩增。
第一步是变性。
将反应体系加热至 94 98℃，使模板 DNA 的双链解开，变成两条单链。
第二步是退火。
降低温度至 50 65℃，引物与模板 DNA 单链上的互补序列结合。
第三步是延伸。
将温度升高到 72℃左右，DNA 聚合酶以引物为起点，按照碱基互补配对原则，将 dNTPs 逐个连接到引物的 3'端，合成新的 DNA 链。
经过一轮这样的循环，一个 DNA 分子变成了两个。
然后再重复这三个步骤，新合成的 DNA 分子又可以作为模板进行扩增，经过多次循环，目标 DNA 片段的数量就会呈指数级增长。
接下来，我们详细了解一下 PCR 操作的具体步骤。
首先是准备阶段。
1、设计引物：根据目标 DNA 片段的序列，使用专业的软件或在线工具设计合适的引物。
引物的长度一般在 18 25 个碱基之间，GC 含量适中，避免形成二级结构等。
PCR基因扩增原理
PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。
其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。
这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
2.退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR扩增的原理和步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段，是现代生物学研究中不可或缺的重要工具。
PCR 扩增技术的原理和步骤对于理解和应用PCR技术具有重要意义。
本文将详细介绍PCR扩增的原理和步骤，帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、PCR扩增的原理。
PCR扩增的原理基于DNA的复制和酶的作用。
PCR反应体系包括DNA模板、引物（primer）、四种dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、DNA聚合酶和缓冲液。
PCR反应通过热循环的方式，使DNA 模板在不断变化的温度条件下进行DNA链的解旋、引物的结合和DNA聚合酶的合成，最终实现目标DNA片段的扩增。
二、PCR扩增的步骤。
1. 反应体系的准备。
将DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液按照一定比例混合，得到PCR反应体系。
反应体系中的DNA模板可以是基因组DNA、cDNA或其它DNA样本，引物是用于引导DNA聚合酶合成DNA链的短寡核苷酸序列。
2. Denaturation（变性）。
将PCR反应体系加热至94-98°C，使DNA双链解旋成两条单链。
3. Annealing（退火）。
将反应体系降温至50-65°C，使引物与目标DNA序列互补结合，形成引物-模板复合体。
4. Extension（延伸）。
将反应体系温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链，延伸至整个DNA模板。
5. 循环扩增。
通过以上三个步骤的循环，每个循环使目标DNA片段的数量翻倍，扩增出大量目标DNA片段。
三、PCR扩增的应用。
PCR扩增技术在生命科学研究、医学诊断、法医学鉴定、种群遗传学等领域有着广泛的应用。
例如，在基因克隆、基因突变分析、病原体检测、DNA指纹鉴定等方面发挥着重要作用。
总结，PCR扩增技术通过热循环反应，实现对DNA片段的快速扩增。
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR扩增的原理和步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速复制DNA片段，使之成倍增加。
PCR技术的发明为分子生物学、医学诊断和法医学等领域的研究提供了重要工具。
本文将介绍PCR扩增的原理和步骤。
一、PCR扩增的原理。
PCR扩增的原理是通过DNA聚合酶酶的作用，将DNA片段在体外进行反复的复制，从而实现DNA的倍增。
PCR扩增主要包括三个步骤，变性、退火和延伸。
1. 变性。
PCR反应开始时，将待扩增的DNA双链解旋成两条单链。
这一步需要高温（通常为94-98摄氏度）来打开DNA双链，使之变性成两条单链。
2. 退火。
在变性后，降温使引物与目标DNA序列结合。
引物是一小段与待扩增DNA序列互补的寡聚核苷酸链，它们分别结合到目标DNA序列的两端。
这一步通常在50-65摄氏度进行。
3. 延伸。
在退火后，DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
它从引物的3'端开始合成DNA链，向引物的5'端延伸。
这一步需要适当的温度（通常为72摄氏度）和四种脱氧核苷酸（dNTPs）。
通过不断重复这三个步骤，可以在较短的时间内获得数以百万计的DNA片段。
二、PCR扩增的步骤。
PCR扩增的具体步骤如下：1. 反应体系的准备。
首先需要准备PCR反应体系，包括目标DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和辅助物质。
将这些成分按照一定比例混合均匀，制备PCR反应液。
2. 变性。
将PCR反应液放入PCR仪中，进行变性步骤。
一般情况下，变性温度为94-98摄氏度，时间约为1-3分钟。
3. 退火。
变性后，将温度降至50-65摄氏度，使引物与目标DNA序列结合。
这一步通常持续30秒至1分钟。
4. 延伸。
在退火后，将温度升至72摄氏度，开始DNA聚合酶的延伸作用。
延伸时间的长短取决于所扩增DNA片段的长度，通常为1-2分钟。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+(镁离子作用是酶的催化剂，没有镁离子酶就没办法扩增)。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
三部曲：变性、退火、延伸1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR 扩增反应的操作第一节PCR 扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。
PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。
1．模板DNA 的变性模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。
2．模板DNA 与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。
退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。
一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1〜2min。
3．引物的延伸DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。
重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。
在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40〜60个碱基/秒。
经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。
在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。
每完成一个循环需2〜4min, —次PCR 经过30〜40次循环，约2〜3h。
扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。
PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR反应的五个元素变性TTTTTTr-rrrτττ-r退火延伸图PCR的反应历程参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1．引物引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模板DNA 在体外大量扩增。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 。
引物的选择将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm 值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR 中也能识别cDNA 或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
(1)引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-3ObP,常用的是18〜27bp,但不应大于38bp。
引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74 C ,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。
( 2)引物碱基构成引物的G+C含量以40〜60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5〜10C。
若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T )估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55〜80C ,其Tm值最好接近72 C以使复性条件最佳。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
( 3)引物二级结构引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。
这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。
对于引物的3'末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5'端的要求可适当放宽。
引物自身形成的发卡结构，也以3'端或近3'端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。
应尽量避免3'末端有发卡结构的引物。
( 4)引物3'端序列引物3'末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3'末端最后 5 到6 个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3'末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3'末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补，尤其是在3' 末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3'末端的稳定性由引物3'末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG°?G值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。
应当选用3'端?G值较低(绝对值不超过9),负值大，则3'末端稳定性高，扩增效率更高。
引物的3'端的？G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
需要注意的是，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。
（5）引物的5端弓I物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；弓I入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
2 .酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（ThermUS aquaticus）中分离的。
Taq DNA 聚合酶是一个单亚基，分子量为94 000 Da。
具有5'-->3的聚合酶活力，5'-->3'的外切核酸酶活力，无3'-->5'的外切核酸酶活力，会在3'末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为 A ,故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-4〜10-5。