基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质
超高效液相色谱-串联质谱联用法同步检测抗生素生产废水中螺旋霉素与新螺旋霉素残留
超高效液相色谱-串联质谱联用法同步检测抗生素生产废水中螺旋霉素与新螺旋霉素残留白辉;贲伟伟;周维芝;强志民【摘要】采用超高效液相色谱-串联质谱法同步测定了抗生素生产废水中残留的螺旋霉素( SPM-Ⅰ)和新螺旋霉素(NSPM-Ⅰ).考察了萃取溶剂种类、水样pH值、萃取次数、水样与萃取溶剂的体积比等因素对目标物回收率的影响.以ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm ×2.1 mm i.d.,1.7 μm)为分析柱,0.1％甲酸水溶液和乙腈为流动相梯度淋洗,流速0.2 mL/min,电喷雾正离子多重反应监测模式检测.标准曲线在0.02～1.00mg/L范围内线性关系良好,r2均大于0.999.方法回收率为70％～ 88％,相对标准偏差小于10％,检出限(S/N=3)分别为0.03 μg/L( SPM-Ⅰ)和0.06 μg/L( NSPM-Ⅰ).该方法应用于无锡市某制药厂抗生素生产废水中SPM-Ⅰ和NSPM-Ⅰ的检测,检出质量浓度分别为(115.6±2.7) mg/L和(5.3±0.4)mg/L.%An ultra performance liquid chromatog raphy - tandem mass spectrometric ( UPLC - MS/ MS) method was developed for the simultaneous determination of spiramycin ( e. G. Spiramycin I , SPM- I ) and neospiramycin ( e. G. Neospiramycin I , NSPM- I ) residues in antibiotic production wastewater. The factors influencing the recoveries of antibiotics, including organic extractant type, water sample pH value, extraction time and ratio of water sample to organic extractant, were investigated. The target compounds were separated on an ACQUITY UPLC BEH C18 column (100 mm X 2. 1 mm I. D. , 1. 7 μm) by gradient elution using 0. 1% formic acid(A) and acetonitrile( B) as mobile phases at a flow rate of 0. 2 mL/min. The qualification and quantification of target antibiotics were carried outby MS/MS with positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring (MRM) mode. The calibration curves were linear over an antibiotic concentration range of 0. 02 -1.00 mg/L with correlation coefficients ( r2) more than 0.999. The recoveries of antibiotics ranged from 70% to 88% with relative standard deviations(RSD, n =6) less than 10% . The detection lim-its(S/N = 3) for SPM- I and NSPM- I were 0. 03 |xg/L and 0. 06 |xg/L, respectively. The developed method was applied in the determination of antibiotic production wastewater from a pharmaceutical manufacturing factory in Wuxi City, with SPM- I of (115. 6 ± 2. 7 ) mg/L and NSPM- I of (5.3 ±0.4) mg/L.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2012(031)001【总页数】6页(P90-95)【关键词】抗生素生产废水;螺旋霉素;新螺旋霉素;超高效液相色谱-串联质谱法【作者】白辉;贲伟伟;周维芝;强志民【作者单位】山东大学环境科学与工程学院,山东济南250100;中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京100085;中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京100085;山东大学环境科学与工程学院,山东济南250100;中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京100085【正文语种】中文【中图分类】O657.63;S859.796抗生素生产废水是环境中抗生素污染的主要来源之一，废水中残留的抗生素药物成分排入环境中将导致具有抗药性的微生物产生［1］。
螺旋霉素发酵工艺的研究
文章编号:100128689(2002)1220720202螺旋霉素发酵工艺的研究王欣荣 刘淑奎 夏永 谢丽芳(四川抗菌素工业研究所, 成都610051) 摘要: 螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌变种A .sp 9924经紫外光照射、光回复突变及螺旋霉素耐受等复合处理,使摇瓶发酵效价提高30%;在摇瓶发酵培养基中加入正丙醇及FH 12,使发酵效价进一步提高40%;并初步研究了工艺的中试放大。
关键词: 螺旋霉素; 紫外光处理; 光回复突变; 螺旋霉素耐受试验; 发酵中图分类号:TQ 465.5 文献标识码:A收稿日期:2002201208作者简介:王欣荣,男,生于1973年,助理研究员。
螺旋霉素(SPM )是十六元大环内酯类抗生素,其乙酰化后的衍生物2乙酰螺旋霉素,具有组织浓度高、毒性低、体内疗效长等特点,对急性乳腺炎、淋巴结炎和牙周炎等都有很好的疗效。
作者根据其代谢机理,研究了螺旋霉素的菌种理论选育及发酵工艺。
1 材料与方法1.1 菌种1.1.1 菌种 螺旋霉素链霉菌(S trep to m y ces sp ira 2m y cetrcus )A .sp 9924。
1.1.2 培养基孢子斜面培养基:可溶性淀粉、黄豆饼粉、硫酸镁、碳酸钙、琼脂,pH 614～617。
种子培养基:淀粉、黄豆饼粉、玉米浆、氯化钠、蛋白胨、磷酸二氢钾等。
发酵培养基:淀粉、黄豆饼粉、玉米浆、氯化钠、蛋白胨、磷酸二氢钾、鱼粉等。
1.2 方法1.2.1 培养方法 螺旋霉素产生菌斜面于27℃培养16～18d ,种子27℃培养48h ,二级培养24h ,发酵27℃培养110h 放瓶测效价。
摇床转速220r m in 。
1.2.2 菌种处理 将斜面孢子用生理盐水洗下,于紫外光(370nm ,25W ,30c m )下照射90s ,光回复60s ,如此重复两次,稀释涂布到含螺旋霉素2000Λg m l 的平板上。
1.2.3 分析方法 用八叠球菌杯碟法测定生物效价。
螺旋霉素发酵液不同过滤洗涤方式的对比研究
螺旋霉素发酵液不同过滤洗涤方式的对比研究 亓平言Ξ 张文玉 赵玉坤 丁绪芹(清华大学化工系,北京100084) (山东济宁鲁抗集团) 用板框压滤机进行发酵液的过滤是目前发酵液处理的主要手段。
但国内各厂家在过滤洗涤时都采用置换洗涤法,大大增加了洗涤水的用量,也影响了收率。
研究表明,改用横穿洗涤法进行洗涤可以使洗涤液体积减少一半,提高了过滤收率,同时减少了溶媒损耗和产品损失,并降低了滤饼含水量,取得了明显综合经济效益。
关键词:发酵液 板框过滤机 横穿洗涤法 置换洗涤法 发酵是生物工程的重要方法,在利用发酵生产抗生素过程中,发酵液中存在大量菌丝体、菌种代谢物、剩余培养基以及抗生素主组分以外的其他复杂组分。
所以在抗生素提取精制之前,必须进行过滤,以除去这些干扰物质[1,2]。
对于发酵液的处理方法,特别是不经过滤而进行提取的方法,许多学者对其进行了广泛的研究[3]。
如用倾析机(D ecan ter )进行带菌丝体萃取[4]、带菌丝体上柱进行离子交换[5]、膜分离[6,7]以及双水相萃取[8]等。
这些方法为抗生素的提取开辟了新的途径。
但是,由于他们各有缺点,工业化推广应用还有困难,因而目前广泛采用的还是用过滤的方法进行固液分离,再进行溶剂萃取[9]。
国内抗生素发酵液的过滤,多数厂家采用明流式板框压滤机,但滤渣的洗涤,却选择了置换洗涤法,使水循着与滤浆相同的路径通过滤饼进行洗涤。
此法简单易行,但水容易走短路,洗涤不均匀,使滤渣中残留的抗生素较多,影响过滤收率。
而且需要的洗涤水量大,稀释滤液单位,也造成一些损失,需要进行改进。
为此,我们对横穿洗涤法进行了实验和工业应用研究。
1 横穿洗涤法的原理和安装 目前工厂常用的板框过滤机是BM Y 702810 25型,由非洗涤板、洗涤板和板框组成。
非洗涤板记为一钮,洗涤板记为三钮,板框记为二钮。
装合时,洗涤板、板框、非洗涤板、板框等要交替地置于机架上,洗涤板滤液出口安有旋塞。
螺旋霉素生物合成中间代谢物的LC_ESI_MS定性分析
完成后用超声波脱气备用 。 流动相流速 : 0. 8 mL/ min ; 柱温 : 35 ℃; 检测波长 : 232 nm; 进样量 : 5
μL ; 梯度洗脱程序见表 1。
1. 2. 2 MS 条件 电离方式 API - ES; 碰撞诱导解离 (CID) 电压 70 V ; 干燥气 (N2) 流速 7. 0 L/ min ; 干 燥气 (N2) 温度 300 ℃; 喷雾电压 : 3. 45 Pa ; 扫描范围 : 55～1 000 m/ z 。 1. 3 实验方法
螺旋霉素属中谱抗生素 , 主要对葡萄球菌 、链球菌 、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌及脑膜炎双球 菌等革兰氏阴性菌有高度敏感性 , 在现代生活中有着广泛的用途 。 它在临床应用 30 余年后的今天 , 对于感染性疾病治疗仍具有临床应用和推广价值 。 在个别领域 , 还具有进一步拓展的空间 [ 1 ]。 长 期以来对螺旋霉素的研究主要集中在对下游生产工艺的优化[ 2 ] , 近年来主要集中在进行上游基因工 程的改造 [ 3 ] , 而对螺旋霉素生物合成的代谢网络及其流量分布方面的研究很少 。 代谢工程的研究既 能对上游基因的改造进行指导 , 又是下游工艺优化的基础 , 对其进行研究具有理论和实践意义 。 但 在螺旋霉素生物合成的发酵液中 , 除了中间代谢物 、最终代谢物外 , 还有很多其它杂质 , 给分析工作 带来很大的困难 。
基于低共熔溶剂高效萃取液质联用快速定量检测养殖水中氯霉素类抗生素残留方法的研究
DOI:10.20041/ki.slbl.2023.03.005基于低共熔溶剂高效萃取液质联用快速定量检测养殖水中氯霉素类抗生素残留方法的研究李凯华，张杨，徐媛原，张微，肖曼，林敏霞，林英扬，吴丹，魏芝芝，张兵*（深圳市质量安全检验检测研究院，广东深圳518055）摘要：为建立一种养殖水中氯霉素类抗生素残留的微量低共熔溶剂高效萃取液质联用快速定量检测的方法，将养殖水经滤纸过滤，取10mL水样，加入适量内标物质，混匀取1mL水样置于微量离心管中，加入适量低共熔溶剂，旋涡混匀静置提取上层清液，用乙腈定容至1mL，过0.22μm滤膜，然后用高效液相色谱进行分离，电喷雾串联四级杆质谱进行检测，用内标物进行定量。
结果显示：氯霉素的线性范围为0.1~5.0μg·kg-1，相关系数为0.9994，平均检出限达到0.0053μg·kg-1，方法的回收率为80.3%~103.6%，相对标准偏差为3.5%~8.3%；氟苯尼考的线性范围为1.0~20.0μg·kg-1，相关系数为0.9998，平均检出限达到0.0228μg·kg-1，方法的回收率为63.4%~85.2%，相对标准偏差为2.2%~6.2%。
结果表明该方法萃取及检测试剂消耗少、时间短、灵敏度高、准确性好，适用于养殖水中氯霉素类抗生素的检测。
关键词：低共熔溶剂；萃取；养殖水；氯霉素类抗生素；液质联用中图分类号：S859.79+6文献标志码：A文章编号：1001-0084（2023）03-0025-06Research on Rapid Quantitative Determination of Chloramphenicol Antibiotics and Veterinary Drug Residues in Aquaculture Water Based on Deep Eutectic Solvents High Performance Extraction Liquid Chromatography-Mass SpectrometryLI kaihua,ZHANG Yang,XU Yuanyuan,ZHANG Wei,XIAO Man,LIN minxia,LIN Yingyang,WU Dan,WEI Zhizhi,ZHANG Bing*(Shenzhen Institute of Quality and Safety Inspection and Research,Shenzhen518055,Guangdong China) Abstract:To establish a rapid and quantitative method for the determination of chloramphenicol antibiotics residues in aquaculture water by liquid chromatography mass spectrometry(LC-MS)with micro eutectic solvent extraction and enrichment,the culture water was filtered by filter paper,10mL of water sample was added with proper amount of internal standard substance,1mL of water sample was mixed evenly in a micro-centrifuge tube, adding proper amount of eutectic solvent,vortex mixing and standing to extract the top layer clear liquid, acetonitrile was fixed to1mL,and filtered by0.22μm.The sample was separated by high-performance liquid chromatography,and the internal standard was quantified by electrospray ionization tandem mass spectrometry.The 收稿日期：2023-02-08作者简介：李凯华（1980—），男，水产工程师，研究方向为水产品检测分析。
螺旋霉素提取工艺的研究
螺旋霉素提取工艺的研究螺旋霉素是一种广谱抗生素，被广泛应用于医疗和农业领域。
其提取工艺的研究至关重要，可以有效提高螺旋霉素的产量和纯度。
本文将讨论螺旋霉素提取工艺的研究。
螺旋霉素的提取过程可以分为以下几个步骤：发酵、细胞破碎、固液分离、纯化和结晶。
首先是发酵过程，选择合适的培养基和发酵条件可以提高螺旋霉素的产量。
常用的培养基包括玉米浸出液、糖蜜和豆粕等，发酵条件包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
细胞破碎是提取过程中的关键步骤，主要通过物理或化学方法破坏菌体细胞壁，释放出螺旋霉素。
常用的方法包括超声波处理、高压处理和酶解等。
这些方法可以选择性地破坏细胞壁，减少对螺旋霉素的损伤和降解。
固液分离是将发酵液中的菌体残渣和可溶性物质分离的过程。
常用的方法包括离心、滤过和沉淀等。
离心是最常用的方法，可以快速将菌体残渣和发酵液分离，但效果较差，往往需要结合其他方法进行。
纯化是提取过程中的关键步骤之一，可以通过离子交换、凝胶层析和亲和层析等方法进行。
离子交换是最常用的方法，通过选择性吸附和洗脱，将螺旋霉素与其他杂质分离开来。
凝胶层析和亲和层析则是通过分子大小和亲和力实现纯化。
最后是结晶过程，通过合适的溶剂和温度，将螺旋霉素从溶液中结晶出来。
结晶过程的选择会影响螺旋霉素的晶体形态和纯度。
通常使用醇类、酮类和水等溶剂进行结晶，控制温度和搅拌速度可以获得良好的结晶效果。
总结起来，螺旋霉素提取工艺的研究包括发酵、细胞破碎、固液分离、纯化和结晶等步骤。
通过优化这些步骤的条件和方法，可以提高螺旋霉素的产量和纯度。
未来的研究方向可以包括新型发酵工艺、高效破碎方法和晶体工艺的改进等。
螺旋霉素生物合成代谢流量分析
[ 11 ] K itao C , Om u ra S. B ioconversion and b io syn thesis of 162 m em bered m acro lide an tib io tics. X : R egu la tion of sp iram ycin 32hyd roxyl acla se fo rm a tion by g luco se, bu tyra te and ceru len in [J ]. J A n tib io t, 1979; (6) : 593
关键词: 螺旋霉素; 生物合成; 代谢流量分析 中图分类号: R 978. 1+ 5 文献标识码: A
螺旋霉素主要对葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等 革兰氏阳性菌及脑膜炎双球菌等革兰氏阴性菌有高度 敏感性, 在现代生活中有着广泛的用途。它在临床应用 30 余年后的今天, 对于感染性疾病治疗仍具有临床应 用价值。 在个别领域, 还具有进一步拓展的空间[1], 因 此有必要对进一步提高生产效率进行更深入的研究。 传统的方法是对生产菌株进行诱变和随机的或理性化 的筛选[2, 3 ], 同时对发酵生产工艺进行优化[4 ]。 随着基 因工程研究的发展, 用基因扩增技术改造菌株的方法 亦成功[5, 6]。而对螺旋霉素生物合成的代谢网络及其流 量分布方面的研究很少。 近几年来代谢工程方法在代 谢网络上的应用日趋广泛[7, 8], 代谢工程的研究既能对 菌种基因的改造进行定位, 又是发酵工艺优化的基础, 因此, 对其进行研究有一定的理论和实践意义。
[ 7 ] Jo rgen sen H , N ielsen J , V illad sen J. M etabo lic flux d istri2 bu tion s in P en icillium ch ry sog enum du ring fed2ba tch cu lti2 va tion s [J ]. B io techno l B ioeng, 1995; 46: 117
螺旋霉素生物合成中间代谢物的LC-ESI-MS定性分析
螺旋霉素生物合成中间代谢物的LC-ESI-MS定性分析
李友元;陈长华;陶萍
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2002(021)003
【摘要】利用液相色谱-电喷雾离子化质谱联用技术定性分析了螺旋霉素生物合成的中间代谢物,在螺旋霉素发酵液中共检出7个中间代谢物,分别是:forocidinⅠ、forocidinⅡ、neospiramycinⅠ、neospiramycinⅡ、spiramycinⅠ、spiramycinⅡ、spiramycinⅢ.
【总页数】4页(P40-43)
【作者】李友元;陈长华;陶萍
【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;上海交通大学分析测试中心,上海,200030
【正文语种】中文
【中图分类】TQ465.92
【相关文献】
1.不同种类植物油及脂肪酸对螺旋霉素生物合成影响 [J], 曾俊;叶蕊芳;管莹;梁鸿;朱德育
2.锌离子对螺旋霉素生物合成的影响 [J], 武培;张小红;刘守强;谢婷;孙玉杰
3.螺旋霉素生物合成中的分子、基因及发酵调控技术 [J], 郑育青
4.丙三醇对螺旋霉素生物合成过程的影响 [J], 胡蓉; 陈长华; 张琪; 刘迎宾
5.铵离子对必特螺旋霉素生物合成的调控 [J], 李桢林; 王永红; 郝玉有; 储炬; 张嗣良
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21卷2期2005年3月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.21 N o.2March 2005Received :September 2,2004;Accepted :October 12,2004.3C orresponding author.T el :86221264252324;E 2mail :leeyy @基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质LC 2ESI ΠMS Identification and R eduction of Impurities inSpiramycin Fermentation李友元13,陈长华1,顾熠峰1,李晓勇2LI Y ou 2Y uan 13,CHE N Chang 2Hua 1,G U Y i 2Feng 1and LI X iao-Y ong 21.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 2002372.河南天方药业股份有限公司,河南 4630031.ECUST State K ey Laboratory o f Bioreactor Engineering ,Shanghai 200237,China2.H enan top fond Pharmaceutical CO .,Ltd .,H enan 463003,China摘 要 目前螺旋霉素生物合成的发酵杂质含量过高,导致成品收率过低,杂质含量不符合药典规定。
为解决这一问题,首先利用LC 2MS 联用技术定性分析了4种螺旋霉素发酵杂质的结构,结合螺旋霉素生物合成途径分析,它们都起因于螺旋霉素生物合成糖基化过程的紊乱。
氮源尤其是铵盐对螺旋霉素生物合成糖基化过程有重要的调节作用。
进一步的氮源优化使螺旋霉素发酵液中4种杂质含量降低22%～88%,杂质含量全部低于欧洲药典标准。
关键词 液质联用,螺旋霉素,杂质,优化中图分类号 T Q92 文献标识码 A 文章编号100023061(2005)022*******Abstract There are several im purities in the spiramycin fermentation broth which leads to a lower yield and lower quality of the product.F our im purities in spiramycin broth have been simultaneously separated and identified by LC 2ESI ΠMS.The generation of these im purities was attributed to the fluctuation of glucosylation in spiramycin biosynthesis.Nitrogen sources ,amm onium in par 2ticular ,were found to play an im portant role at the glucosylation.Aided with the in formation of LC 2ESI ΠMS analysis and subse 2quent optim ization of the culture medium ,better culture medium of shake flask was designed ,which leads to reduction of im puri 2ties by 22%～88%.K ey w ords LC 2ESI ΠMS ,spiramycin ,im purity ,optim ization 抗生素的生物合成属于产生菌的次级代谢,具有生物合成途径复杂、生物合成酶的基质特异性不高及调控机制不严密等特点。
在产生菌的发酵液中,存在结构相近但生物活性相差很大的多种组分,获得生物活性高、毒性小的有效组分,对提高抗生素质量至关重要[1]。
另一方面,抗生素等原料药的出口受到各国药典越来越严格的质量要求。
2001版欧洲药典规定,螺旋霉素原料药的成品主成分不能低于85%,各杂质不能高于2%。
现存螺旋霉素生产工艺中,发酵液中的4种杂质在后处理中无法用常规分离手段去除,且含量高于2%。
电喷雾离子化(ESI )及其色谱2质谱联用(LC 2MS )可有效地分析复杂混合物中的单个或多个组分[2]。
国内外亦有利用LC 2MS 联用技术分析发酵液中多组分的报道[3,4]。
本研究旨在利用LC 2MS 联用技术分析螺旋霉素发酵液中4种杂质的结构,结合螺旋霉素生物合成途径分析杂质产生机理和原因,进而指导工艺优化以降低其含量。
1 材料与方法111 材料和试剂生二素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus )SPM12175,由河南天方药业有限公司提供。
112 液质联用仪器及条件流动相A 为0105m ol ΠL 的乙酸铵溶液;流动相B 为乙腈:甲醇(5∶1ΠV ∶V )。
流动相配比见表1,其他条件同文献[4]。
表1 流动相配比梯度程序T able 1 Composition of mobile ph aset Πminφ(s olvent A )Π%φ(s olvent B )Π%08515104060148515 S olvent A :amm onium acetate 0105m ol ΠL ;S olvent B :acetonitrile :methanol (5∶1ΠV ∶V ).113 实验方法11311 样品预处理:取螺旋霉素罐发酵48h 的发酵液30m L 过滤,将滤液-20℃冷冻保存备用。
分析时取1m L 滤液在4℃下以10000r Πmin 离心10min ,上清液用0122μm 膜过滤后置于进样瓶中待分析。
11312 螺旋霉素发酵液主要杂质定性分析:为了节约时间、提高样品回收率并保证分析的准确性,实验采取直接进样法。
取螺旋霉素罐发酵48h 的发酵液,经11311所述步骤预处理后进行液质联用分析,色谱柱后流出物依次经紫外和质谱串联检测。
由总离子流提取得到质谱数据,根据各中间代谢物的分子式进行定性分析。
螺旋霉素发酵液HP LC 图谱和总离子图分别如图1和图2所示。
发酵液经提取后处理得到成品,将成品HP LC 图谱和图1比较后确定图1中I M1、I M2、I M3和I M4为在后处理中不能消除的杂质。
图1 螺旋霉素发酵液HP LC 图谱Fig 11 HP LC chromatogram of spiramycinbroth图2 螺旋霉素发酵液液质联用总离子图Fig 12 MS TIC chromatogram of spiramycin broth2 结 果211 螺旋霉素发酵杂质质谱图ESI 是一种高效的“软”离子化方式,可以得到高丰度的准分子离子峰。
从质谱总离子流中提取得到4种杂质的质谱数据,如图3所示。
在质谱图中,除了较高丰度的准分子离子峰外,大部分都有M +NH 4+峰存在,这是由于流动相中含有乙酸铵而与NH 4+形成的加合物。
212 螺旋霉素发酵杂质结构质谱分析螺旋霉素基本结构式如图4所示。
螺旋霉素生物合成途径揭示其先接一个含氮的碳霉氨糖(My 2caminose ),然后在分子的另一端R 2接上福洛氨糖(forosaminyl ),最后在已经接上配糖体的糖胺R 3位再接上一个碳霉糖(mycarosyl )。
各组成单元如图4所示。
如图3,I M2和I M3质谱图所示,分子峰m Πz 为84411,和螺旋霉素Ⅰ的分子量相同,意味此I M3和I M2的结构单元和螺旋霉素Ⅰ的结构单元相同,即含有碳霉氨糖、福洛氨糖和碳霉糖。
但I M3质谱图同时含有m Πz 14512碎片峰,即有少量不稳定的碳霉糖在较“软”的E MS 离子方式下裂解下来。
推断在第三步糖基化时,碳霉糖没有加在碳霉氨糖C4′位R3上,有可能接在碳霉氨糖C2′位上,造成碳霉糖基团不稳定,从而出现m Πz 14512的碳霉糖碎片峰。
I M2质谱图同时含有m Πz 17411碎片峰,即有少量不稳定的碳霉氨糖在较“软”的E MS 离子方式下裂解下来。
推断在第三步糖基化时,碳霉糖没有加在碳霉氨糖C4′位R3上,有可能接在大环内酯C3的R1位上,造成碳霉氨糖不稳定,从而出现m Πz 17411的碳霉氨糖碎片峰。
I M1、I M4质谱图显示其分子峰m Πz 为84711,大于螺旋霉素Ⅰ的分子量。
结合分子结构分析程序,推断其结构单元为两个碳霉糖,即在第二步糖基化672Chinese Journal o f Biotechnology 生物工程学报 2005,V ol 121,N o 12图3 螺旋霉素发酵液杂质质谱图Fig 13 ESI spectra of impurities in spiramycinbroth图4 螺旋霉素分子结构Fig 14 S tructures of spiramycin时,碳霉糖代替福洛氨糖接在大环内酯的R2位上。
在I M1质谱图中也可见碳霉糖的m Πz 14512碎片峰,应是其接在不正确位置上导致不稳定易裂解的 表现。
213 螺旋霉素发酵杂质的降低从杂质的质谱分析推断,这4种杂质的产生都和螺旋霉素生物合成糖基化过程有着密切关系。
在螺旋霉素生物合成糖基化过程中,铵盐起到了非常重要的作用。
Omura 等人[5]从分子水平上作出解释,认为大环内酯类抗生素结构中碳霉氨糖及碳霉糖C4侧链都包含了氮的代谢。
基于以上考虑,针对培养基中的氮源进行了优化。
初步对氮源以及无机离子分别作缺项法实验,考查各因素对杂质含量变化的影响如表2所示。
从表2中数据可以初步看出,氮源和无机盐对杂质的产生有重要影响。
表2 氮源和无机离子对螺旋霉素发酵杂质含量变化的影响T able 2 E ffects of nitrogen source and inorganic ion on the production of impuritiesN o.E ffectorsIm purity Y east powderNH 4NO 3C orn liquidS oybean powderM gS O 4ZnS O 4NaCl IM1IM2IM3IM410111111+ΠΠ+21011111ΠΠΠ++31101111ΠΠΠ++41110111ΠΠΠ--51111011ΠΠΠ++61111101+ΠΠΠ7111111+ΠΠΠ +H igher level of the im purity ;-Lower level of the im purity ;ΠN o change772李友元等:基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质 进一步的氮源和无机离子正交设计实验表明:氮源中玉米浆,酵母粉和NH4NO3,无机盐中MgS O4和ZnS O4对发酵杂质的产生影响较大。