基因工程链激酶(r―SK)纯化及其单克隆抗体制备和鉴定
单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定
单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
微生物检验技术(中级)考试大纲
2.公共场所样品采集方法及处理
②大肠菌群测定 （4）理发用具微生物检测样品采集及处理
①大肠菌群测定
②金黄色葡萄球菌测定 （5）拖鞋微生物检测样品采集及处理
二、环境卫生微 生物检验
霉菌和酵母菌测定 （6）游泳池水微生物检测样品采集及处理
①细菌总数测定
②大肠菌群测定 （7）浴盆、脸（脚）盆微生物检测样品采集及处理
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单元
细目 1.蛋白、核酸提取及相关设备
三、微生物实验 室常用仪器及使 用
2.电泳
（1）概述
（2）生物安全委员会
（3）个人防护
（4）病原微生物的危害评估
四、微生物实验 （5）病原微生物的标准操作程序
（7）乙型脑炎病毒 （8）登革热病毒 （9）克里米亚-刚果出血热
要求 掌握 掌握 掌握 掌握
掌握
掌握
掌握
掌握
掌握
掌握 熟悉 了解 掌握 掌握 掌握 掌握 掌握 了解 掌握 熟悉 了解
单元
细目
三、传染病病原 2.病毒
（10）流行性感冒 （11）狂犬病 （12）腮腺炎病毒 （13）风疹病毒 （14）急性出血性结膜炎 （15）病毒性腹泻 （16）朊病毒 （17）森林脑病 （18）水痘 （19）手足口病 （20）尖锐湿疣 （21）生殖器疱疹 （22）非典型肺炎 （23）人感染禽流感病毒
室生物安全
（6）实验室废弃物处理原则和常规消毒
（7）病原微生物菌（毒）种的保存与使用
基因工程的基本操作步骤4
基因工程的基本操作步骤4基因工程的基本操作步骤基因工程是一种将外源基因或人为改造的基因导入到生物体内，从而改变其遗传特性的技术。
作为一项复杂而关键的科学技术，基因工程需要遵循一系列基本操作步骤。
本文将介绍基因工程的基本操作步骤，帮助读者了解和理解这一领域的基础知识。
1. 提取目标基因基因工程的第一步是提取目标基因。
目标基因可以来自不同生物体的DNA，包括细菌、植物、动物等。
提取目标基因需要使用特定的提取方法，例如PCR（聚合酶链式反应）技术。
在这一步骤中，需要具备实验室操作技能，同时需遵守实验室安全操作规范。
2. 构建基因载体在基因工程中，基因载体扮演着非常重要的角色。
基因载体是将目标基因导入宿主细胞的工具，通常是由DNA分子构成。
基因载体的构建需要选择适当的载体类型，并将目标基因与载体连接起来。
常见的基因载体包括质粒、病毒等，其构建过程需要遵循相关实验技术和原则。
3. 转化宿主细胞一旦基因载体构建完成，下一步是将其导入宿主细胞中。
这个过程被称为转化。
转化可以通过多种方法实现，例如热激冲击、化学处理或电击。
通过转化，基因载体得以进入宿主细胞，并将目标基因在宿主细胞内表达。
4. 鉴定转化细胞经过转化后，不是所有的细胞都成功地接受了目标基因。
因此，鉴定转化的细胞是基因工程中一个关键的步骤。
鉴定的方法通常基于目标基因在细胞中的表达，可以通过PCR扩增、酶切或荧光显微镜观察等实验手段来进行。
5. 培养和筛选鉴定成功的转化细胞后，需要对其进行培养和筛选。
在培养基中，细胞会持续生长和分裂，并表达目标基因。
为了筛选出带有目标基因的细胞，通常需要加入适当的筛选剂或标记基因。
通过培养和筛选，可以获得大量带有目标基因的细胞。
6. 分离纯化在获得带有目标基因的细胞后，接下来的步骤是分离和纯化目标基因。
这可以通过一系列的实验方法实现，如凝胶电泳、离心、柱层析等。
分离纯化后的目标基因可用于进一步的研究或应用。
总结：基因工程的基本操作步骤包括提取目标基因、构建基因载体、转化宿主细胞、鉴定转化细胞、培养和筛选、以及分离纯化。
基因工程的基本操作程序的步骤
相同点
原则
碱基互补配对
原料 4种游离的脱氧核苷酸
模板
DNA双链
不同点 解旋方式
加热
解旋酶Biblioteka 场所体外细胞核
酶 结果
Taq酶 细胞内的 DNA聚合酶
大量的DNA 形成整个的
片段
DNA分子
（三）用化学方法直接人工合成 条件：基因较小，核苷酸序列已知。 仪器：DNA合成仪
二、基因表达载体的构建
1、元件：
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
与细胞膜无关 用Ca2+处理细胞→ 感受态细胞
重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
1、导入目的基因后需要检测哪些方面？ 各采取什么方法？
2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探 针通过什么原理来检测目的基因和相 应的mRNA？
3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什 么？
基
片段 拼接到载体上
因
组
导入受体细胞DN？
依据目的基因的有关信息。
如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性。
b.使目的基因能够表达和发挥作用。
载体与基因表达载体的区别：
载体的组成：
复制原点+目的基因插入位点+标记基因 基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
同：二者均有标记基因和复制原点 异：表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、
终止子三部分结构 （其中启动子、终止子对于目的基因的表达（转录步骤）
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理第二节单克隆抗体的制备第三节基因工程抗体制备第四节单克隆抗体的应用将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
一、杂交瘤技术包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
（一）小鼠骨髓瘤细胞细胞株稳定，易于传代培养。
细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株。
（二）免疫脾细胞免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。
1.脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
3.杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞。
由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。
因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养单个细胞培养又称克隆化。
细胞克隆化有以下几种方法：1.有限稀释法；2.显微操作法；3.荧光激活细胞分选仪；4.软琼脂平板法。
三、阳性杂交瘤细胞的冻存目前均采用液氮保存细胞。
细胞放入液氮前，需要逐步降温。
复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。
葡激酶可行性报告
新型重组葡激酶销售市场性分析溶血栓药物是临床上治疗心脑血管疾病，尤其是急性心肌梗塞(AMl)，静脉血栓等的有效药物，并可降低死亡率。
目前临床上使用的药物有多种如：链激酶(SK)、重组链激酶(R-SK)、尿激酶(UK)、组织纤溶酶元激治剂(T-PA)、乙酰化纤溶酶元一链激酶复合剂{ASPAC}、重组葡激酶(R-SAr)等，其中SK使用较早，是疗效较好的溶栓药物之一，国际上以欧美尤为德国广泛应用(62)。
SK与R-SK的药效主要是与纤溶酶元形成1：1的化学计量复合物，作用于纤溶酶原的活性部位面起激活作用，使纤溶酶原转化成纤溶酶，从而促使血栓溶解。
单使用链激酶需做过敏反应，并且生产成本太高，难于在发展中国家普及。
且使用过程中，继发性出血反应大，并不能用于脑血管疾病的溶栓治疗。
相形之下R-SK毒性低，生产成本低，对人体血液、尿液、血液生化与病理均无明显影响，即使高达临床剂量50倍时也是如此(62-70)。
因而广泛受到医药界重视。
目前国内临床上试用的有古巴重组链激酶(58.72商品名海贝克栓)但副反应大，其中寒颤反应高达70％以上，使用前需静滴地塞米松类药物控制内毒素样反应。
国内研究重组链激酶单位有以下：北京基础医学研究所、上海医科大学、上海医药工业研究院、山东医科大学等单位，由于天然链激酶用致病菌作生产工程菌株，易污染环境，纯化工艺复杂，产量低，而T-PA成本高，又不易推广。
上海医科大学宋后燕教授用DNA重组技术构建了链激酶基因表达质粒，并将其引入非致病性大肠工程杆菌中，合成R-SK，经分离纯化，制成注射剂，卫生部已于1994年9月批准进入临床，目前国产R-SK主要是上医大的R-SK产品(59.60.66.69.70.72)。
由于R-SK工艺简单、成本低廉、产量高，新型高效的R-SK也正是在DNA重组质粒的制备上进行精细地改动后合成的R-SK，更具有优越的临床运用性(70)。
《我国目前急性心肌梗塞溶栓治疗现状》1. 国内外使用溶栓药物现状：WHO目前号召6种溶血栓药物在AMI和脑率中中进行临床应用和大规模临床干扰研究。
一种制备重组链激酶的方法[发明专利]
![一种制备重组链激酶的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/90f2a1e6f12d2af90242e6f0.png)
专利名称：一种制备重组链激酶的方法专利类型：发明专利
发明人：宋后燕
申请号：CN94112106.2
申请日：19940404
公开号：CN1096326A
公开日：
19941214
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种重组链激酶的制造方法。
现有技术的基因 构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复 杂。
本发明方法用PCR扩增链激酶基因，与原核表 达载体如PLY-4组装成表达质粒PSTE-SK-1，转 化大肠杆菌后用温度诱导r-SK基因表达。
工程菌 经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二 步法纯化r-SK。
本方法所得产品的产量和纯度都 很高，成本低。
申请人：上海医科大学
地址：200032 上海市医学院138号
国籍：CN
代理机构：上海医科大学专利事务所
代理人：吴桂琴
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