海参钙离子通道基因的克隆与性质分析
刺参vasa.1ike基因克隆及其在组织中的表达分析
２ ０ 年５ ０ ８ 月
刺 参 ｖｓ．ｋ 基 因克 隆 及 其 在 组 织 中 的表 达 分 析 ａａ１ ｅ ｉ
隋娟 ， 张志峰 ， 明瑜 ， 邵 胡景杰
（ 中国海洋大学 海洋 生物 遗传 学与种质工程实验室 ， 山东 青岛 ２ ６ ０ ） ６０ ３
摘 要 ： ａａ基 因 编 码 Ｄ Ａ ｂ ｘ家 族 成 员 中 一 种 Ａ Ｐ依 赖 的 Ｒ Ａ 解 旋 酶 ， 生 殖 系 分 化 过 程 中 发 挥 着 重 要 的 作 用 。 ｖｓ Ｅ Ｄ－ｏ Ｔ Ｎ 在 本 研 究 采 用 同源 克 隆 和 ｃ ＮＡ 末 端 快 速 扩 增 技 术 （ＡＣ ） 从刺 参 （ｐ ｓｉ ｏ ｕ ｊｐ ｎｃｓ 巢 中克 隆 得 到 ｖｓ Ｄ Ｒ Ｅ， Ａ ｏｔ ｈｐ ｓ ａ ｏ ｉ ）精 ｃ ｕ ａａ的全
关 键 词 ： 参 ；ａａ 全 长 ｃ ＮＡ； 列 分 析 ； 织 表 达 刺 ｖｓ； Ｄ 序 组 中 图分 类 号 ： ９ ７ ￥ １ 文 献标 识码 ： Ａ 文章编号： ０５８３一２０）３００—７ １ ０— ７ ７ （０ ８ ０ — ４ ７ ０
ｖｓ ａａ基 因最 早 在 果 蝇 中 被 发 现 ， 作 为 一 种 它 母 源重 要 作 用 …。之 后 ， ａａ相 关 基 因 在 一 些 物 种 ｖｓ 中陆续 被 克 隆 ， 中绝 大 多数 物种 中被 确认 仅 在 生 其 殖 系 中特 异 性 的 表 达 Ｊ ９ ７年 ， ｏ ｎ等 采 用 。１９ Ｙｏ 整 体 原 位 杂 交 技术 ， ｖ ｓ 以 ａａ为标 记 基 因 ， 踪 了斑 追 马 鱼 （ｒｃｙ ｌｎｏｒｒ ）原 生殖 细 胞 的起 源 、 Ｂ ａ ｈｏａ ｉ ｅｉ ｏ 迁移
长 ｃ ＮＡ序列 。该 ｃ Ｎ Ｄ Ｄ Ａ序 列全长 ２１７ｂ ， ６ ｐ 开放 阅读框 １ ９ ｐ 编码 ５ ０个 氨基酸 ， ３ｂ ， ５ ３ 具有 ＤＥ ．ｏ ＡＤ ｂ ｘ家族 蛋 白的全
深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆CAPRO2的筛选及酶学性质分析
蛋 白酶是 应用 得 最 为 广 泛 的一 类 酶 ， 工 业 上 在
法 的优 点 是 目的性 强 ， 培 养 的 菌 株 也便 于 后 续 的 纯 基 因工程 、 白质工 程 等操 作 Ｊ但 是 ， 蛋 ． 自然 环 境 中
有着广泛的用途 ， 例如洗涤 业 、 品加 工、 食 制药 、 皮 革 、 断试 剂 等 ¨ 大部 分 投 入 应 用 的蛋 白酶 都 是 诊 ． 中温酶 ， 它们在 ３ ５ ℃范 围内活力最高． ０～ ０ 而对于 工业应用来说 ， 高温酶 由于在高温下具有高的催化
克 隆 （ Ａ Ｒ ０ ２ ， 其 进 行 了酶 学性 质 分析 ． 果表 明该 酶 的 最 适作 用 温 度 为 ６ ｃ 最适 作 用 Ｃ Ｐ Ｏ ０ ）对 结 ５ｃ，
ｐ Ｈ值 为 ９ ０ 该蛋 白酶具有较好 的热稳 定性 ， ４ ｃ ．． 在 ０ｃ以下的温度 中可长期保持稳 定 ， ５ ℃ 中 在 ０
绝大部分 的微生 物是 目前的技术所无 法进行培养 的， 尤其是在深海极 端条件下 的微生物更是难 以获
收 稿 日期 ：００ １ ． ２ １—１３ ０
基金项 目： 国家 ８ ３ ６ 计划资助项 目（０ ７ Ａ ９ ４ ７ ； ２ ０ Ａ ０ １０ ） 中国大洋矿产资源研究开发协会 资助项 目（ Ｙ Ｍ １５ ２２ ４ Ｄ Ｘ 一１－ － ０ ） ０ －
ＣＰＯ Ａ Ｒ ２蛋 白酶在 ｐ Ｈ值 为 ７ ５～ ． 。 ９ ５时 活 力较 高， Ｈ 值 为 ７ ５时 可 保 持 约 ８ ％ 的 活 力 ，Ｈ 值 ｐ 。 ０ ｐ
为 ９ ５时保 持 ６ ％ 的 活力 ， ． ０ 而在 ｐ 值 高于 ９ ５的 条件 下 酶 活 力 下 降较 快 ，Ｈ值 为 １ ． Ｈ ． ｐ ０ ０时活 力 降为 约 １％ ， 明 Ｃ Ｐ Ｏ ５ 表 Ａ Ｒ ２属 于 碱 性 蛋 白 酶 ． 氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂 Ｐ Ｆ Ｅ６ 丝 ＭＳ 、 一４和 ＡＥ Ｓ Ｂ Ｆ对
海南斑等蝎钾通道阻断剂 Im58的克隆、表达、纯化和鉴定
海南斑等蝎钾通道阻断剂 Im58的克隆、表达、纯化和鉴定尹世金;兰珍;李羽欣【摘要】To express potassium channel blocker Im58, full length DNA sequences of Im58 was amplified by overlap PCR with four designed primers and the cloning with the right sequence was transformed to E. coli/Rosetta ( DE3 ) by vector pGEX-4T-1. Under different inducing time and IPTG concentrations, the expressing quantities of fusion protein were investigated to optimize the inducing conditions. Then the recombinant GSH-fusion proteins were purified by GSH affinity chromatography, treated with enterokinase and purified by C18 column of RP-HPLC. The sample of Im58 purifying peptides was obtained to identify the molecular weight and purity by SDS-PAGE Gel of Tricine system. Accurate molecular weight was also identified by MALDI-TOF-MS. The results showed that the prokaryotic expression plasmid of Im58 was successfully constructed by positive clone. Moreover, the expression, purification and identification of Im58 were confirmed by SDS-PAGE Gel of Tricine system and MALDI-TOF-MS.% 为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥 PCR 引物,通过overlap PCR 的方法扩增出蝎毒肽 Im58 DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌 E. coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经 IPTG 诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过 RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过 Tricine 系统的 SDS-PAGE 蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由 MALDI-TOF-MS 来精确测定重组多肽的分子量.结果表明：Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine 系统的 SDS-PAGE 蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】5页(P36-40)【关键词】钾离子通道阻断剂;Im58;原核表达;蛋白纯化【作者】尹世金;兰珍;李羽欣【作者单位】中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074【正文语种】中文【中图分类】TQ464.9;Q784蝎是生存了4亿多年最古老的物种之一［1］，蝎在进化中形态没有很大变化，这与其有一套用于捕食和防御的有效武器——蝎尾腺分泌的毒液有关.蝎毒素是一类由20～80个氨基酸组成的小肽(2～9Kd)，能够选择性地与细胞膜上的K+、Na+、Cl-和Ca2+等离子通道结合，调节细胞对离子的通透能力，进而影响动物机体、组织和细胞的生理功能［2-7］.作用于K+通道的蝎毒肽是一类由20～40个氨基酸通过3或4个二硫键交联而成的具有多种生物活性的小分子多肽，它不仅可作为研究相关的靶离子通道受体调控胞内信息转导的分子探针，还可为构建系列肽类药物提供理想的分子模板［8］.序列比对分析表明，从海南斑等蝎毒腺分离的Im58多肽是哺乳动物Kv1.3通道的阻断剂.Kv1.3通道是电压门控钾通道Kv1.x亚家族中的一员，它在哺乳动物体内分布较广，主要表达在脑、肺、胸腺、脾等组织的 T细胞膜上［9］.当人体自身免疫失调时，体内的T细胞发生大量的激活，增殖和分化，引起自身免疫疾病.研究表明，Kv1.3通道在调节T细胞的膜电位及钙离子信号转导途径中起着非常重要的作用，T细胞表面的Kv1.3通道数目的变化与自身免疫疾病密切相关［10］.近年来国内外正在积极开展自身免疫疾病的治疗，研究表明钾通道Kv1.3可以作为治疗自身免疫疾病的药物靶标，研发靶向钾通道Kv1.3调节剂已成为新型免疫抑制药物的发展方向［11］.在各种有毒动物的天然毒素中，大部分高亲和性Kv1.3通道阻断剂都来自蝎毒素［12］.故以蝎毒肽为基础筛选与设计多肽药物寻找高特异性和选择性的Kv1.3通道调节剂，具有重要的理论意义和应用价值.本研究采用基因重组技术成功构建了Kv1.3通道阻断剂的原核表达载体PGEX-4T-1-Im58，表达、纯化和鉴定了新型蝎毒肽Im58，为进一步研究Im58的生物学功能奠定了基础.1 材料和方法1.1 材料与试剂表达质粒 PGEX-4T-1、实验菌株DH5α、E.coli/Rosetta(DE3)等由武汉大学病毒及分子癌学实验室李文鑫教授课题组提供.限制性内切酶 BamHI、XhoI、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PCR 所用试剂和酶(TakaRa公司，日本)，T4DNA连接酶、PCR产物回收试剂盒、DNA Marker(Fermentas公司，加拿大)，质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、小肠激酶(武汉摩尔肽公司)，还原型谷胱甘肽(GSH，武汉众一生物技术公司)，小分量蛋白Marker(武汉凌飞生物技术公司)，10KD截流的超滤管(Milipore公司，德国)，其他试剂均为国产分析纯.1.2 扩增Im58基因序列从海南斑等蝎的毒腺cDNA文库中，分离得到一条新的cDNA Im58，根据其成熟肽的序列和大肠杆菌偏好的密码子，设计的4条overlap引物见表1.表1 Overlap PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for overlap PCR* 单划线为BamhI酶切位点，双下划线为EK酶酶切位点;▲单划线为XhoI酶切位点引物名称引物序列(5’-3’)CTGGGATCCGATGACGATGACAAGCAGGTGCATACCAAAATTATGTGC ACCAAAATTATGTGCAGCGTGAGCCGCGAATGCTATGAACCGTGCCAT CATGCATTTGCCATGCGCGCGGCCGGTCACGCCATGGCACGGTTCATA Im58-FP1 Im58-FP2 Im58-RP2 Im58-RP1*GCATTTGCCATG▲CCGCTCGAGTCACCAATAGCAGGTGCATTTTTTGTTC ATIm58的基因通过2轮PCR扩增获得:第1轮PCR用引物Im58-FP2和Im58-RP2进行overlap PCR扩增.然后将第1轮PCR产物稀释100倍为模板，以引物Im58-FP1和Im58-RP1进行第2轮PCR.两次PCR反应条件均为:95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，55℃ 复性 30 s，72℃ 延伸 45 s，72℃ 延伸 5 min，循环25次.PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行观察分析，并用PCR产物回收试剂盒回收纯化.1.3 PGEX-4T-1-Im58重组表达质粒的构建将回收纯化的PCR产物和表达载体PGEX-4T-1用BamHI和XhoI双酶切，37℃酶切12 h后，酶切产物分别电泳，并对双酶切的Im58片段和载体片段分别用PCR产物回收试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化.分别取酶切的Im58片段和载体片段以1∶3的比例混合后，在T4DNA连接酶作用下22℃，1 h连接.构建重组表达载体.1.4 阳性重组克隆的筛选将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃温箱培养过夜后，从含Amp的LB平板上挑取3个单克隆，接种于含Amp的LB液体培养基37℃培养5 h，再用PCR扩增对培养物检测.PCR的引物，反应条件和过程同1.2，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测.提取阳性克隆的质粒，用BamHI和XhoI酶切重组质粒，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切产物，对筛选的阳性克隆测序.1.5 融合蛋白诱导时间和诱导剂浓度的选择将测序正确的Im58重组载体转化入表达菌种E.coli/Rosetta(DE3).将表达菌37℃摇过夜，次日取菌液1 mL，接种于含Amp(100 μg/mL)的100mL LB液体培养基，37℃培养到OD600=0.6时，取培养的菌液10 mL，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导.再将菌液在28℃培养5 h，分别于2，3，4，5 h吸取菌液2 mL，离心、PBS重悬菌体并超声破碎，取上清进行Tricine系统的SDS-PAGE电泳.同法取培养的菌液5管，每管5 mL，加入IPTG的终浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L 于28℃继续培养4 h.各收集菌液2 mL，离心、PBS 重悬并超声破碎，取上清进行Tricine系统的SDS-PAGE电泳.1.6 融合蛋白的表达纯化在含Amp的LB液体培养基中接种表达菌，接种量为1∶100，一次表达1 L，37℃培养到 OD600=0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的 IPTG进行诱导，再将菌液在28℃培养4 h，离心收集菌体.加入40 mL PBS重悬，超声破细胞，离心收集上清，将收集的上清加入到GSH层析柱中.用PBS缓冲液冲洗GSH亲和层析柱以去除杂蛋白，再用40 mL的GSH洗脱液洗脱融合蛋白.将收集到的融合蛋白用10KD截流的超滤管离心浓缩脱盐至每升菌液约1 mL.超滤得到浓缩的融合蛋白用EK酶酶切，23～25℃水浴酶切过夜.1.7 蝎毒肽Im58的RP-HPLC纯化酶切混合液离心后，取上清进行RP-HPLC分离纯化.HPLC的上样体积是1 mL，流速为5 mL/min.RP-HPLC的固定相是C18反相柱，流动相为:溶液B是0.1%TFA，溶液D是0.1%TFA+90%的乙腈.RP-HPLC的洗脱梯度:60 min线性梯度，初始B的体积比为95%，D为5%，结束时 B的体积比为5%，D为95%;测量波长为230 nm.1.8 纯化的重组蝎毒肽的鉴定将表达纯化各个步骤的蛋白样品取样，进行Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳，初步鉴定多肽的分子量大小及纯度.并取蛋白样通过MALDITOF-MS精确测量多肽的分子量.2 结果和分析2.1 重组表达载体的构建PGEX-4T-1-Im58重组表达质粒的构建如图1所示，PGEX-4T-1载体是带GST 标签含Amp抗性的克隆载体，GST标签在目的片段Im58前面，这种带GST标签的融合蛋白组合有利于蛋白表达纯化.图1 载体PGEX-4T-1-Im58的构建Fig.1 Construction of vector PGEX-4T-1-Im58注:箭头所指示为Im58基因插入位点2.2 Im58基因的扩增通过overlap PCR扩增两次获得Im58全长片段，如图2所示，经2%的琼脂糖凝胶电泳，可以见一条长度为150bp的明亮的条带，与理论值相符合.图2 Im58基因扩增产物Fig.2 The amplification product of Im58 geneM)DNA标准;1)PCR扩增产物Im58基因2.3 重组质粒的鉴定如图3所示，通过PCR鉴定和BamHI、XhoI双酶切重组克隆质粒鉴定法，获得了约150 bp的目标片段，证明重组质粒 PGEX-4T-1-Im58已经构建成功.图3 重组质粒PGEX-Im58的分子鉴定Fig.3 Identification of the recombinedplasmid PGEX-Im58a)菌落PCR的鉴定结果:1)水，阴性对照;2)DNA标准;3)质粒阳性对照;4～6)不同菌落;b)BamHI和Xho酶切鉴定结果:1)Im58基因;2)酶切质粒;M)DNA标准2.4 表达条件的优化不同诱导条件，融合蛋白的表达结果见图4.由图4可见，在28℃诱导条件下，IPTG的终浓度为1 mmol/L，诱导时间为2，3 h时产量均较低，当诱导时间为4，5 h时产量较高.若 IPTG浓度为0.2 mmol/L时产量略高;故确定融合蛋白表达的最佳条件为:28℃，0.2 mmol/L IPTG，诱导 4 h.图4 不同表达条件下融合蛋白在Tricine系统的SDS-PAGE电泳分析Fig.4 Analysis of fusion protein by SDS-PAGE of Tricine system under different expression conditionsM)蛋白标准;1)未诱导蛋白;2～5)28℃，1mmol/L IPTG下诱导2，3，4，5 h产生的蛋白;6～10)0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L IPTG在28℃培养4 h产生的蛋白2.5 融合蛋白的表达纯化融合蛋白的表达纯化结果见图5.图5 Im58多肽在Tricine系统的SDS-PAGE的表达纯化Fig.5 The expression and purification of Im58 peptide by SDS-PAGE of Tricine system1)未诱导蛋白;2)IPTG诱导4h后的蛋白;3)纯化并超滤脱盐得到浓缩的GST-Im58;4)融合蛋白EK酶切后的混合产物;5)RP-HPLC分离纯化后的Im58多肽;M)蛋白标准由图5可见，包含重组质粒的大肠杆菌Rosseta培养到OD600=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG 诱导4 h后，细胞上清蛋白中多出一条约30KD的条带，这是由于在重组表达 Im58的系统中，在 Im58(4KD)前面融合了一个26KD的GST(谷胱甘肽转移酶)标签所形成的GST-Im58融合蛋白.经GST亲和层析柱纯化所得GST-Im58融合蛋白，经超滤脱盐浓缩，蛋白浓度较高.浓缩后的蛋白用EK酶酶切，产生一条26KD的带(谷胱甘肽转移酶)和一条4KD(目的蛋白Im58)的条带.2.6 蝎毒肽的RP-HPLC分离纯化蝎毒肽的RP-HPLC分离纯化结果见图6.如图6所示，经EK酶酶切后的蛋白混合物经RP-HPLC用C18柱分离纯化，60 min溶液梯度线性洗脱，230 nm紫外波长下检测，蝎毒肽Im58得到了很好的分离.图6 Im58经HPLC的分离纯化Fig.6 Separation and purification of Im58 by HPLC2.7 蝎毒肽的分子量鉴定蝎毒肽的分子量鉴定结果见图7.由图7可见，将经RP-HPLC纯化的蝎毒肽进行MALDI-TOF-MS测定分子量，测得分子量为4369.38，与预期分子量4369.4 一致.图7 Im58的分子量鉴定Fig.7 Identify the molecular weight of Im583 讨论蝎毒素是一类富含二硫键的小肽，其中大部分多肽可作用不同类型的离子通道，在研究离子通道的性质和药物开发等方面具有重要的应用价值.蝎毒素由于富含二硫键，在重组表达毒素过程中常有诸多困难，如二硫键不能正确配对，表达产物易降解，缺乏转录加工修饰蛋白的机制等.本实验采用GST融合表达系统成功地在大肠杆菌 E.coli/Rosetta(DE3)中表达了GST-Im58.GST融合表达系统广泛用于各种融合蛋白的表达，该系统与其他系统相比表达效率高，操作简便，表达的蛋白质带有GST头部，可利用含有还原型谷胱甘肽的纯化柱进行纯化，得到单纯的融合蛋白，去除背景蛋白的干扰;它还具有剪切的功能，可将GST的头部切除，得到单一的目的蛋白，进行相关功能的研究［13］.为获得和天然毒素氨基酸序列相同的蝎毒素，本研究选用单向识别切割的小肠激酶(EK酶)，它能识别DDDDK序列，并且在K之后切割蛋白，获得的蛋白在N端不含多余的氨基酸序列，并对一些表达条件和工艺进行了优化，使重组蝎多肽纯度高并具有良好生物活性.由于蝎多肽基因是真核生物的基因，其蛋白编码采用的密码子与大肠杆菌有一定的区别，采用大肠杆菌表达会在翻译水平上对蛋白质表达产生不良的影响，故本研究采用经过修饰的Rosetta菌株，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达［14］.本研究为融合蛋白的原核表达提供一定的参考价值，同时本实验成功表达了Im58多肽，可直接用于深入研究其生物学功能.致谢:感谢武汉大学病毒及分子癌学实验室李文鑫教授课题组提供的材料和陈宗运博士方法上的指导.参考文献【相关文献】［1］Briggs D E G.Scorpions take to the water［J］.Nature，1987，326:645-646.［2］Debont T，Swerts A，Van der Walt J J，et parison and characterization of the venoms of three Parabuthus scorpion speciesoccurring in southern Africa［J］.Toxicon，1998，36(2):341-352.［3］Garcia M L，Hanner M，Knaus H G，et al.Pharmacology of potassium channels ［J］.Adv Pharmacol，1997，39:425-471.［4］Gordon D，Savarin P，Gurevitz M，et al.Functional anatomy of scorpion toxins affecting sodium channels［J］.J Toxicol 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Ca2在生物细胞信号转导中的作用研究进展[2]
![Ca2在生物细胞信号转导中的作用研究进展[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/10a54784dbef5ef7ba0d4a7302768e9951e76e3c.png)
Ca2+在生物细胞信号转导中的作用研究进展郭广君1吕素芳1沈志强1王荣富2（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州2566002.安徽农业大学生命科学学院，合肥230036）摘要Ca2+是多种信号途径的第二信使，钙信号的转导在整个真核生物信号转导中发挥重要作用。
近年来，胞质自由Ca2+的浓度变化的原初位点、钙信号的表现形式及Ca2+靶蛋白在发挥生物学功能的构象效应方面已成为生命科学中的研究热点。
钙信号途径下游的Ca2+靶蛋白——钙调素（CAM）和钙依赖的蛋白激酶（CDPK），前者在整个生物界细胞中都存在，后者在高等动物中没有发现，而只在植物、藻类、部分原生动物存在。
关键词Ca2+,钙信号, 钙调素, 钙依赖的蛋白激酶, 非密封接膜片钳游离Ca2+是细胞内重要的第二信使，参与多种生命活动的调节。
Ca2+在细胞外、胞浆、细胞核内起着重要的调节作用，生物的许多重要的生理过程，如：对各种外界刺激的响应、物质的跨膜运输、代谢调节、细胞有丝分裂、基因的转录与表达和细胞的调亡等均受到胞内外Ca2+浓度变化的调节和调控。
因此，需要测定胞质自由Ca2+的浓度变化水平。
目前已有几种较好的测定方法，如：荧光指示剂法、重组水母发光蛋白测定法、非密封接膜片钳法等。
胞质自由Ca2+浓度的变化包括瞬时增加、持续变化和振荡，主要是通过存在质膜及细胞内膜上Ca2+通道（Ca2+channel）与Ca2+泵（Ca2+pump）及Ca2+/H+反向转运子（Ca2+/H+ antiporters）的作用来实现。
另外，近几年来，对Ca2+信号途径的下游Ca2+的靶标和引起的生物学效应有了更加深入的了解。
1.Ca2+研究方法1.1胞内Ca2+浓度的测定方法1.1.1Ca2+荧光指示剂就非转基因生物材料而言，测定胞内Ca2+浓度主要是利用荧光指示剂。
Ca2+荧光指示剂中，indo－1、fura－2、quin－2、fura－4f、fura－5f、fura－6f、BTC 等由紫外光所激发；fluo－3、rhod－2、calcium green－1 、calcium green－2、calcium orange、calcium crimson、fura red、calcein等由可见光所激发。
大菱鲆钙激活型钾离子通道基因TSKCa的克隆和序列分析
离 子通 道蛋 白是 位于 细胞 膜上 的一 类膜 蛋 白， 子经 由离子 通 道进 出细 胞 。 由于 某 些 离子 进 入 细胞 后 离
和钙离 子 双重 门控 。 目前 已知 有 多种类 型 的 Ｋ ａ 在 于各类 细 胞上 。根 据 电导及 药理 学 特 点 的不 同 ， Ｃ 存 通道
可分 为大 电导 （ ＫＣ ） 中电 导（ＫＣ ） 小 电 导 （ Ｋ ａ 三 个亚 家 族 ， 功 能 在 于启 动 和 维 持 细 胞 的 活 化 与 Ｂ ａ、 Ｉ ａ和 Ｓ Ｃ ） 其 增殖 。近年来 更 发现在 哺乳 动物 的 免疫 系统 中 ， 激 活 型 钾 通 道参 与免 疫 应 答 的调 控 ， 淋 巴细胞 的激 钙 在 活、 分化 和增 殖等 重要 的生 理活 动 中发 挥作 用 。 ｊ
能启动 细胞 内各 种重 要 的信 息传 导系统 ， 活有 关 的代谢 途径 ， 激 因此离 子通 道对 于维 系细 胞 的正 常功能 和保 持 对代 谢 的调节 具有 十分 重要 的作 用 。钾离 子 通道是 钾 离 子 出入 细胞 的特异 性 通 道 ， 通 道参 与所 有 可兴 钾 奋性 和非 兴奋性 细 胞 的信 号 传导 ， 其家 族 成 员在 调节 神 经 递 质 释 放 、 素 和 细 胞 分 泌 、 胞 电传 导 、 肉收 激 细 肌 缩 、 节 心率 和细胞 容积 等方 面发 挥着 重要 的作 用 。钾 通道 广 泛分 布 于 哺乳 动 物 的 心脏 、 调 血管 、 经 等 组 织 神
海参基因组
海参基因组
海参（Holothuroidea）是一类生活在海洋中的无脊椎动物，其基因组研究为我们揭示了海参的进化历程和生命奥秘。
海参基因组的研究不仅涉及到基因结构和功能的解析，还涉及到海参与环境的适应性、繁殖策略以及生理特性等方面的研究。
海参作为一类原始的海洋动物，其基因组具有丰富的信息，可以为我们揭示海洋生态系统的演化历程和动物进化的基本规律。
通过对海参基因组的研究，科学家发现海参基因组中存在着许多与免疫系统相关的基因，这些基因能够帮助海参抵御外界环境的侵袭和病原体的攻击。
海参基因组研究还发现了一些与海参生长和再生能力密切相关的基因。
海参在受到损伤或遭受攻击后，能够迅速修复和再生受损的组织和器官，这得益于海参基因组中一些特殊的基因。
这些基因能够调控细胞增殖、分化和再生过程，使海参具备了惊人的再生能力。
海参基因组的研究还揭示了海参适应海洋生活的一些独特的生理特性。
例如，海参基因组中存在着一些与高浓度盐水环境适应相关的基因。
这些基因能够调控海参体内盐水浓度的平衡，使其能够在高盐度的海水中生存和繁衍。
海参基因组的研究对于人类的健康和生物科技的发展也具有重要意义。
海参中存在着一些与人类疾病相关的基因，通过研究海参基因
组，科学家可以更好地理解这些疾病的发生机制，为疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
海参基因组的研究为我们揭示了海参的进化历程和生命奥秘，对于海洋生态系统的保护和人类健康的促进具有重要意义。
我们相信，随着对海参基因组的深入研究，我们将会更好地了解海洋生物的进化和适应性，为人类的生活和健康带来更多的惊喜和帮助。
钙离子调节亲环素配体及其不同剪接体的克隆及生物信息学分析
・
４６ｌ・
第２卷 ｌ
第 ５期
医 学 研 究 生 学 报
Ｊ ｕ ａ ｆＭｅ ｉａ ｏ ｔｒｄ ａｅ ｏ ｒ ｌｏ ｄ ｃ ｌＰ ｓ ａ ｕ ｔｓ ｎ ｇ
Ｖｏ ． Ｎｏ ５ １ ２ｌ ．
Ｍａ ． ０ ｖ ２ ０８
２０ ０ ８年 ５月
・
论
著 ・
钙 离 子 调 节 亲 环 素 配体 及 其 不 同 剪接 体 的 克 隆 及 生 物 信 息 学 分析
程 勇前 成 军 刘 妍 王 ， ， ，
徐 东平 钟 彦伟 曲 建 慧 赵 ， ， ，
琳 ，
平
（． １解放 军第 ３２医院病 毒性 肝炎 研 究室 ， ０ 北京 １０ ３ ； ． ００ ９ ２ 北京 地坛 医 院 北 京 １０ １ ） ００ １
（ ． ｉ ｌ ｅａｉ ｅ ａｃ ｅｔ ，ｔｅ３ ２ ｄ Ｈ ｓｉ ｌｏ ，Ｂ ｉｎ ０ ０ ９，Ｃ ｉ １ Ｖｒ ｐ ｔｉ Ｒｓ ｒｈ Ｃ ｎｅ ｈ ０ ｒ ｏ ｔ ｆ Ｐ ａＨ ｔ ｓ ｅ ｒ ｉ ｐａ ｅｉｇ １ ０ ３ ｊ ｈｎ ａ；２ Ｂ ｉｎ ． ｅｉ ｊｇ
中 图分 类 号 ： Ｑ ８ ７５ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １０ —１９ ２０ ）５０ ６ － ０ ８８ ９ （０ ８ ０ －４ １ ３ ０
Ｃｏｉｇａ ｄｂｏｎｏｍａｉ ｎ ｌｓ ｆＣ ２ ． ｄ ｌｔ ｇ ｌｎｎ ｎ ｉｉｆｒ ｔ ａ ａｙｉｏ ａ ＋ ｍｏ ｕａｉ ｃ ｓ ｎ ｃｄ ｐ ｉｎｆ ａ ｄａ ｄｉ ｐｉｉｇ ｙ ｏ ｈｌ ｇｎ ｎ ｓｓｌｔ ｓ ｉｉ ｔ ｔｎ
ｃ ｏ ｅ ｄ ３ ｓ ｌ ｔ ｇ ｆＣ ＭＬ ｗ ｒ ｅ ｔ ｅ ｅｃ ｌ ．Ｉ ｈ ｓ ｐ ｉ ｉ ｇ ， ３ －６ ８ ｂ Ｉｎ ｄ ａ ｐ ｉ ｉ ｓｏ Ａ ｅ ｅ ｉ ｎ ｉ ｄ ｉ ｔ ｅｌ ｎ ｔ ｅ ｅ ｓ ｌ ｔ ｓ ６ ４ ｎ ｔｎ ｄ ｉ ｆ ｎ ｈ ｓ ｔｎ ９ ｐ，１ ３—６ ３ ７ ３
刺参C型凝集素(AJL)基因的克隆及原核表达分析
关键 词 ： 刺参；凝集素；基因克隆； 原核表达
中图分 类号 ： Ｑ ８ １ ２ ；￥ ９ １ ７
文献 标志 码 ：Ａ
海 参隶 属于 棘皮动 物 门 、海参 纲 ，全世 界海 参 约有 １ ２ ０ ０多 种 ，分 布 在 中 国海 域 的有 １ ４ ０多 种 。
能蛋 白 ，通 常具有 介导 免疫 防御 的活性 ，可通过 凝
由于海参的经济 、药用价值较高 ，现 已成为东亚和
东 南亚 地 区重要 的生态 经济 物种 ，在 中国北 部 沿海
地 区海 参养殖 业 也迅速 发展 。养 殖海 水 中含 有 的病
原 菌常 常导致 海 参患 病 ¨ Ｊ ，严 重制 约 了海参 养 殖
业 的健 康 发 展 。 随着 刺 参 Ａ ｐ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ｈ ｏ ｐ ｕ ｓ ｊ ａ ｐ ｏ ｎ ｉ ｃ ｕ ｓ养
一
［ ３ ］
０
海 参 的免疫 系统 中存 在多 种免 疫 因子 ，包 括凝
集素 、抗 菌 肽 、溶 菌 酶 、模 式 识 别 受体 和补 体 Ｃ ３ 等 』 ，其 中 ，对 于凝 集 素 的研 究 最 多 也最 为广 泛 。 凝集 素是 一类具 有识 别 细胞表 面特 异性 糖结 构 的功
成熟肽的基因克隆并连接至载体 ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ２ ａ （ ＋ ） 中，成 功构建 了原核表 达 的重 组体 ｐ Ｅ Ｔ － ３ ２ ａ （ ＋ ） 一 Ａ 儿 ，进一 步将重组体转化至大肠杆菌感受态细胞 Ｂ Ｌ ２ １（ Ｄ Ｅ ３ ） 中，经诱 导表达 、分离纯化 ，获得 了融合 表达 蛋 白。 本研究结果为进一步研究重组刺参 Ｃ型凝集素在刺参健康养殖上 的应用奠定 了基础 。
加 并在 水产 动物 体 内残 留 ，严重 影 响 了刺 参 的食用
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SjCaβ的分子量预测值为59.8 kD，理论等电点为8.77，分 子式为C2583H4151N771O834S13
菌落PCR产物电泳图
SjCaβ保守区测序结果
443 bp
SjCaβ保守区的BLASTX
长度为443 bp的产物
5‘ RACE实验
3‘ RACE实验
拼接
SjCaβ 全序列
3′ RACE 引物设计
3′ RACE Outer Primer : 5′- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′
Dipro软件分析表明,在该氨基酸序列中共有3个半胱氨酸残 基，其中Cys410和Cys428之间可能会形成一个二硫键
ProtScale程序运算的结果显示： SjCaβ的第370位异亮氨酸（Ile）疏水性最强，第501位组氨酸 （His）亲水性最强，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸（分数
盐离子浓度
离子通道
离子通道（Ion Channel）
钙 离 子 通 道
本文用分子生物学手段对海参体内的 钙离子通道β亚基基因进行了研究
用生物信息学手段对所得到的该基因 全序列进行了性质分析
论文的主要工作内容
总RNA的提取 利用设计的简并引物进行RT-PCR 设计引物，进行3' RACE PCR 设计引物，进行5' RACE PCR 拼接全序列并进行生物信息学分析
总RNA的提取
TRIzol法
RT-PCR简并引物的设计
为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道β亚基的氨基酸序列： 合浦珠母贝(Pinctada fucata, GenBank accession number: EF154452) 紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus, GenBank accession number: XM_785360） 锥实螺(Lymnaea stagnalis, GenBank accession number: AF484087) 人(Homo sapiens, GenBank accession number: BC075049) 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, GenBank accession number: AF000198) 牛（Bos Taurus, GenBank accession number: AF174417） 曼森血吸虫(Schistosoma mansoni, GenBank accession number: AY277532)
目的：扩增海参的钙离子通道β亚基的保守区
最终引物
HS4-1: 5′-ARYAATGAYTGGTGGAT-3′ HS4-2: 5′-GCYTTYTGCATCATRTCT-3′
注：R=A/G Y=C/T
RT-PCR结果
二次PCR结果
RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果
割胶回收产物电泳图
经过序列比对得到此序列的5′ 端与SjCaβ 序列保守区的3′ 端有188个碱基重合，且 有poly(A)尾
初步判断3′ 端的扩增是成功的
5′ RACE 引物设计
5′ RACE Outer Primer: 5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA- 3′
HS4-1-GSP3 (Outer Primer): 5′-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3′
HS4-1-GSP1(Outer Primer) : 5′-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3′
3′ RACE Inner Primer : 5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’
HS4-1-GSP2(Inner Primer) : 5′-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3′
5' RACE PCR结果
5’Inner PCR
5’RACE 割胶回收及菌落PCR结果
割胶回收产物电泳图
菌落PCR产物电泳图
SjCaβ 5' RACE测序结果
序列长为879 bp
经过序列比对得到此序列的3′ 端与SjCaβ 序列保守区的5′ 端有281个碱基重合
因此可初步判断5′ 端是扩增成功的
研究生：杨冠科 指导教师：丛丽娜 教授
① 海参钙离子通道简介 ② 论文的主要工作内容 ③ 结论与展望
海参（Sea Cucumber）
海参自溶现象，困扰生产商多年
养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现
传统的理论解释和研究方法不能满足生产 和科研的需要。
关键问题-------海洋的高盐浓度及高压环境
使用试剂盒：3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 （TaKaRa）
3' RACE PCR结果
3’Outer PCR
3回收及菌落PCR结果
割胶回收产物电泳图
菌落PCR产物电泳图
SjCaβ 3' RACE测序结果
序列长为1019 bp
5′RACE Inner Primer: 5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG- 3′
HS4-1-GSP4 (Inner Primer): 5′-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3′
使用试剂盒：5′-Full RACE Kit（TaKaRa）
把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβ cDNA 基因全长1867 bp
将该cDNA 序列提交至GenBank（GenBank accession number: EU853658）
SjCaβ的生物信息学分析
利用NCBI的ORF Finder分析，SjCaβ全长cDNA中，5′ 非编 码区（UTR） 179 bp，3′ UTR 74 bp，开放阅读框（ORF） 长度1614 bp，编码537个氨基酸