荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物技术实验，其用途主要有两个方面。
一、检测基因转录活性
荧光素酶报告基因实验可以用来检测基因的转录活性，即某一特定基因在细胞中是否被转录成RNA。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
若待测基因的启动子序列在该细胞中被活化，则会促使荧光素酶基因转录成mRNA，再进一步转化成荧光素酶，从而发出荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以判断待测基因的转录活性。
二、筛选基因调控剂
荧光素酶报告基因实验还可以用来筛选基因调控剂，即寻找能够调节某一特定基因转录活性的化合物。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
接着，将待测化合物加入细胞培养基中，观察荧光信号的变化。
若待测化合物能够促进或抑制待测基因的转录活性，则会对荧光信号产生影响。
通过比较不同化合物对荧光信号的影响，可以筛选出能够调节待测基因转录活性的化合物。
总之，荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物技术实验，可用于检测基因转录活性和筛选基因调控剂，具有广泛的应用前景。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。
通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。
实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。
选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。
2. 细胞培养。
将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。
注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。
3. 细胞转染。
将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。
注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。
4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。
在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。
5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。
在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。
加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。
6. 数据统计。
按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。
（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。
在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。
（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明一、测定原理：双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理基于双荧光素酶系统。
该系统由两个互补性的荧光素酶组成：荧光素酶1（Fluc）和荧光素酶2（Rluc）。
荧光素酶1通过氧化反应使荧光素发出蓝色荧光，而荧光素酶2通过氧化反应使荧光素发出绿色荧光。
同时，两个荧光素酶都能够自催化反应，从而有效降低假阳性结果的发生。
二、实验步骤：1.取适量细胞或组织，使用含有测试物的培养基或缓冲液进行处理。
2.将细胞或组织溶解，并离心收集上清液。
3.加入测试试剂盒提供的荧光素底物混合液，共孵育一段时间。
4.使用荧光分析仪测量反应混合物中蓝色和绿色荧光的强度。
5.根据荧光信号的强度计算得出相应的基因表达水平。
三、注意事项：1.本试剂盒需要严格按照说明书操作，避免操作失误导致结果错误。
2.在每一步操作前，请先将试剂保持在合适的温度下，以确保试剂的活性。
3.细胞或组织样本的采集、溶解和上清液的收集需要严格按照操作规范进行，避免样本的损失和污染。
4.在孵育过程中，避免剧烈振荡或震动，以免影响荧光素酶反应的进行。
5.在测量荧光强度时，确保荧光分析仪的参数设置正确，并注意避光操作，以免干扰荧光信号的测量。
四、结果解读：根据测量得到的蓝色和绿色荧光强度，可以计算得到相应的基因表达水平。
一般来说，荧光素酶1的荧光强度与被检测基因的表达水平成正比，而荧光素酶2的荧光强度则用作内参对照。
通过计算荧光素酶1与荧光素酶2的比值，可以更准确地反映被检测基因的表达水平。
结果解读时需要注意的是，双荧光素酶报告基因检测试剂盒只能提供相对量化的结果，无法给出绝对的基因表达水平。
因此，在结果解读时需要结合其他实验数据和相关文献进行综合分析。
总结：双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种常用的基因表达水平检测工具，该试剂盒通过双荧光素酶系统实现对基因表达水平的测定。
在使用时需严格按照说明书操作，注意操作规范和注意事项。
结果解读时应综合考虑其他实验数据和相关文献，以得到准确可靠的结论。
双荧光素酶报告基因检测实验步骤
双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。
本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。
一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。
2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。
3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。
4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。
5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。
二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。
2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。
3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。
三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。
3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。
4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。
四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。
2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。
3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。
4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。
五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。
双荧光素酶报告基因实验步骤
生物试剂双荧光素酶报告基因实验详解
如果要研究特定基因在体内的表达情况，常常采用转染法将双荧
光素酶报告基因植入目标细胞，在其表达后添加荧光素底物观察样品
中的荧光反应。
以下是使用该方法的实验步骤。
1. 构建双荧光素酶报告基因
首先需要构建双荧光素酶报告基因质粒，一般包括荧光素酶基因
和双荧光素酶基因，常用的是pGL3系列荧光素酶报告质粒和pRL-TK
双荧光素酶报告质粒，它们均是双质粒，具有耐药性和多克隆位点。
为了使荧光素底物反应在细胞中时产生荧光信号较强，需要在LUC和RLUC序列之前插入适当的顺式依赖启动子和增强子。
2. 细胞系的选择及转染
可以根据实验需要选择最适合的细胞系，例如HEK293、HeLa等。
将转染载体和搭配的化学试剂（如Lipofectamine 2000）按照实验方
案设定的比例混合，加入到无血清培养基中和细胞悬液混合，然后在
适当的时间内（如26-30小时）取样观察表达情况和筛选。
3. 荧光素底物检测
荧光素底物可以通过公司购买，也可以自制。
将荧光素底物溶解
在试剂液中，加入细胞中，等待几分钟可以看到发出荧光的细胞。
注意：在观察荧光之前，需在处理样品之前过滤荧光素底物以去除杂质。
另外，使用荧光计或流式细胞检测仪记录荧光信号，荧光信号强度与细胞内琥珀酸盐浓度成比例，可用于定量分析。
总之，双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学技术，可以用于基因表达、基因调节和蛋白质交互作用研究等方面，具有广泛的应用前景。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究基因表达调控、信号转导通路等生物学过程。
该实验利用双荧光素酶系统，通过测定荧光素酶和荧光素酶的活性，来研究目标基因的转录水平和调控机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因实验的步骤及相关注意事项，以供科研工作者参考。
实验步骤。
1. 选取适当的载体。
在进行双荧光素酶报告基因实验之前，首先需要选择适当的表达载体。
常用的载体包括pGL3基因表达载体和pRL-TK基因表达载体。
pGL3基因表达载体含有火萤酶（Firefly luciferase）报告基因，用于检测目标基因的转录水平；pRL-TK基因表达载体含有海洋光明蛋白（Renilla luciferase）报告基因，用作内参对照。
将目标基因的启动子区域克隆至pGL3载体中，构建双荧光素酶报告基因实验所需的表达载体。
2. 细胞培养和转染。
选取适当的细胞系进行实验，如HEK293、HeLa等常用的哺乳动物细胞系。
将细胞进行培养，待细胞生长至80%～90%的密度时，进行转染。
将构建好的双荧光素酶报告基因载体与转染试剂混合，加入到细胞培养基中，进行细胞转染。
根据实验需求，可以选择不同的转染试剂和转染时间。
3. 荧光素酶检测。
待细胞转染后，根据实验设计的需要，进行不同处理，如给予药物刺激、转染siRNA等。
处理后，收集细胞，用相应的细胞裂解液溶解细胞，离心收集上清液。
分别取一部分上清液进行火萤酶和海洋光明蛋白的活性检测。
使用荧光素酶检测试剂盒，按照说明书进行操作，测定两种荧光素酶的活性。
4. 数据分析。
将测得的荧光素酶活性数据进行比较和分析。
通常情况下，将火萤酶的活性作为目标基因的表达水平，而海洋光明蛋白的活性作为内参对照。
通过比较不同处理组和对照组的荧光素酶活性，可以得出目标基因的表达水平及其受到的调控。
注意事项。
1. 实验操作要严格遵守无菌操作规范，避免细菌和真菌的污染。
双荧光素酶报告基因检测实验过程
双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。
听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。
双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。
想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。
你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。
这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。
我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。
然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。
你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。
就这点小细节，可别大意了哦。
就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。
转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。
一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。
不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。
这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。
然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。
看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。
这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。
太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。
就像调味料，得掌握好分寸。
这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。
然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。
说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。
这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。
把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。
看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。
每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。
哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。
就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。
双荧光素酶报告基因检测
双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它利用双荧光素酶作为报告基因，通过检测其表达水平来研究目标基因的调控机制、信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因检测的原理、应用及其在科研和临床中的意义。
双荧光素酶报告基因检测的原理是利用双荧光素酶基因（Luciferase）和绿色荧光蛋白基因（GFP）等作为报告基因，将其与目标基因的启动子或调控元件相连，构建成表达载体，转染到细胞中。
当目标基因的启动子或调控元件被激活时，报告基因也会被激活，从而产生荧光素酶或绿色荧光蛋白，可以通过荧光素酶活性检测或荧光显微镜观察来检测目标基因的表达水平和细胞定位。
双荧光素酶报告基因检测在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的启动子或调控元件，可以研究基因的启动子活性、转录因子结合位点以及信号通路的调控机制。
其次，它可以用于筛选药物或研究药物的作用机制。
通过将报告基因与目标基因共转染到细胞中，可以研究药物对目标基因表达的影响，从而筛选出具有特定生物学活性的化合物。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于研究基因的表达模式、细胞信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
在临床诊断中，双荧光素酶报告基因检测也有着重要的意义。
例如，在肿瘤诊断中，可以利用双荧光素酶报告基因检测来研究肿瘤相关基因的表达水平，从而为肿瘤的分子诊断和靶向治疗提供依据。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于检测病毒感染、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程，为临床诊断和治疗提供重要参考。
总之，双荧光素酶报告基因检测作为一种重要的生物学检测技术，在科研和临床中有着广泛的应用前景。
它不仅可以帮助科研人员深入研究基因调控机制和疾病发生发展的相关机制，还可以为临床诊断和治疗提供重要的实验依据。
相信随着技术的不断进步和完善，双荧光素酶报告基因检测将在生物学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
荧光素酶报告基因检测
●原则
荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。
检测步骤如下：
1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。
2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。
3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。
4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。
●特点
◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶
◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng
◆确切的检测限依检测仪器而定。
◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶
基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。
不适用于对细菌荧光素酶进行检测。
●器材和试剂
◆器材
在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。
当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。
◆试剂
1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些
试剂可以启动酶反应。
这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-
15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。
避免反复冻融。
应避光保存，因为荧光素在
光照下会发生氧化。
2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。
●基本操作步骤
下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。
提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。
不要反复冻融以避免酶活性的降低。
1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。
2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子）
小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。
10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO4
14.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。
3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂
解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。
用橡皮刮将细胞刮离培养皿。
将裂解物转移到微量离
心管中。
Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%（v/v）Triton X-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（p
H7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，1mmol/L DTT（临用前加入）
4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。
将上清转移到另
一个微量离心管中，置于冰上以备分析。
5)在开始化学发光反应之前，将100 μl的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测
器皿中（我们建议用96孔板）。
加入360 μl荧光素酶分析缓冲液。
荧光素酶分析缓冲液：25m
mol/L甘氨酰甘氨酸（pH 7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，2mmol/L ATP，1mmol/
L DTT（临用前加入）
6)用25mmol/L（pH7.8）的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素至200μmol/L。
荧光素贮液：1mmol/L D-
荧光素（合成晶体蛋白，Sigma），25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH 7.8），10mmol/L DTT。
（分
成1ml小份，-70℃保存在避光盒中几个月）
7)样品中加入200 μl稀释的荧光素液。
荧光素在光照下迅速发生氧化，因此丢弃未用完的荧光
素稀释液。
在562nm条件下进行检测。
注意事项：
1)荧光素酶检测试剂需在15-25℃的条件预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手
动检测。
当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。
.加入荧光素酶检测试剂
0.5-10秒内开始检测发射光1-5秒，持续发光20秒后，产生光强度降低，其半衰期为5分钟。
2)如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5个小时，在-70℃可
保存数月。
3)利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。
4)在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出），可用裂解液将样品进行
稀释。
5)我们建议不要储存稀释过的样品。
如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.
5mg/mL，这样可以保持样品的稳定性。
6)如果样品中的荧光素酶的活性较高，应尽可能减少所用来检测的样品的体积。
在这种情况下，
按照标准操作，可以相应减少所使用的荧光素酶检测试剂（荧光素酶试剂体积/样品体积=100μl
/20-50μl），这样对检测结果没有影响。
7)一些荧光仪在进行检测前需要1-2秒的稳定，因此，我们建议在开机后过一段时间再进行检测
操作。
8)有一些荧光仪需要在不改变样品体积的条件下加入更多的检测试剂（如300μl）,这与所给定的
标准的操作（50-100μl）有所不同。
9)如果用液闪计数仪，要逐个加入检测试剂后逐个立即检测。
荧光素酶报告基因检测结果需要用β-gal进行校正，既荧光素酶报告基因检测结果。