斑点印迹杂交ppt课件
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Northern-Blot印迹杂交.ppt
20．杂交结果
五、结果与分析：
THANK YOU!
13. 探针的纯化及比活性测定：
①准备凝胶：将1g 凝胶加入30 ml DEPC水中，浸 泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除 去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE (pH 7.6)。
② 取1 ml 的注射器，去除内芯推扞，将注射器底 部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填 12Sephadex G-50。
冰上5 min。 ③ 短暂离心，将溶液收集到管底。
16．杂交： ① 加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀
后，将探针加到预杂交液中。 ② 42℃杂交过夜（14~24 h），杂交完后，将杂
交液收集起来于－20℃保存。
17．洗膜：加入High Stringency Wash Solution 2 (100cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42℃ 摇动 洗膜20 min两次。
5. 电泳： 将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm 下进行电泳（在电泳过程中，每隔30 min 短暂 停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续 电泳），当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止 电泳； 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测 量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意不 要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测 转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。
11．将膜在-20℃保存。
12. 探针的制备：
① 在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 1μl；Random Primer 2 μl ； 灭菌水 11 μl ；总体积：14 μl 。
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
五、结果与分析：
THANK YOU!
13. 探针的纯化及比活性测定：
①准备凝胶：将1g 凝胶加入30 ml DEPC水中，浸 泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除 去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE (pH 7.6)。
② 取1 ml 的注射器，去除内芯推扞，将注射器底 部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填 12Sephadex G-50。
冰上5 min。 ③ 短暂离心，将溶液收集到管底。
16．杂交： ① 加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀
后，将探针加到预杂交液中。 ② 42℃杂交过夜（14~24 h），杂交完后，将杂
交液收集起来于－20℃保存。
17．洗膜：加入High Stringency Wash Solution 2 (100cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42℃ 摇动 洗膜20 min两次。
5. 电泳： 将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm 下进行电泳（在电泳过程中，每隔30 min 短暂 停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续 电泳），当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止 电泳； 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测 量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意不 要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测 转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。
11．将膜在-20℃保存。
12. 探针的制备：
① 在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 1μl；Random Primer 2 μl ； 灭菌水 11 μl ；总体积：14 μl 。
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
8.印迹杂交技术
基因突变位点周围的碱基序列是已知的 合成15～20nt的两种探针: 正常探针:与正常基因序列互补 突变探针:与突变基因序列互补 两者区别是与突变位点对应的碱基不同，称 为等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针。
55
用ASO探针分别与待测DNA进行杂交
只与正常探针杂交-正常纯合子 结果 与正常及突变探针均杂交-杂合子
地高辛标记
18
生物素-11-dUTP
19
异硫氰酸荧光素
罗丹明
荧光素
20
四、探针标记的方法
1.切口平移标记法
2.随机引物标记法 3.PCR标记法
4.末端标记法
21
（一）缺口平移标记法
22
（二）随机引物标记法
23
（三）PCR标记法
以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）
为底物，扩增产物即为标记DNA，可作 探针使用，其灵敏度和特异性很高。
上，转移后各待测核酸片段在固相膜 上的相对位置和在凝胶中的相对位置
一样。此过程最重要的是要保持核酸
片段的相对位置不变。
31
固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸
印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移）
真空转移法 电转移法（电泳转移）
32
（1） 毛细管虹吸转移法
33
（2）真空转移法
34
（3） 电转移法
片段的大小和含量
40
41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
55
用ASO探针分别与待测DNA进行杂交
只与正常探针杂交-正常纯合子 结果 与正常及突变探针均杂交-杂合子
地高辛标记
18
生物素-11-dUTP
19
异硫氰酸荧光素
罗丹明
荧光素
20
四、探针标记的方法
1.切口平移标记法
2.随机引物标记法 3.PCR标记法
4.末端标记法
21
（一）缺口平移标记法
22
（二）随机引物标记法
23
（三）PCR标记法
以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）
为底物，扩增产物即为标记DNA，可作 探针使用，其灵敏度和特异性很高。
上，转移后各待测核酸片段在固相膜 上的相对位置和在凝胶中的相对位置
一样。此过程最重要的是要保持核酸
片段的相对位置不变。
31
固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸
印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移）
真空转移法 电转移法（电泳转移）
32
（1） 毛细管虹吸转移法
33
（2）真空转移法
34
（3） 电转移法
片段的大小和含量
40
41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
斑点印迹杂交(共7张PPT)
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
预杂交的：将探膜封针入15〕ml离，心管中放，做射好剪自角标显记。 影，判断是否有杂交或其杂交强度，主 要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同， 点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形那么称为狭缝杂交。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜〔或 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml〕洗膜三次〔洗液1预热到42℃〕，每次5min；
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
再将洗液2 (每次5ml〕洗膜两次〔预热到42℃〕，每次15min。
尼龙膜〕上，用已标记的探针进行杂交，洗膜〔除去未结合 封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点
立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加 根据点样磨具不同，点样l 20×SSC混匀。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。
点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
第3页，共7页。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点 样，变性，中和，枯燥固定，预杂交，杂交，封闭， 检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和 Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样 品。
第4页，共7页。
实验步骤：
变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测 DNA样品中，稀释样品。100℃加热10min后，
中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合 杂交的双方是待测核酸及探针。
杂交的双方是待测核酸及探针。
牢固 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。
预杂交的：将探膜封针入15〕ml离，心管中放，做射好剪自角标显记。 影，判断是否有杂交或其杂交强度，主 要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同， 点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形那么称为狭缝杂交。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜〔或 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml〕洗膜三次〔洗液1预热到42℃〕，每次5min；
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
再将洗液2 (每次5ml〕洗膜两次〔预热到42℃〕，每次15min。
尼龙膜〕上，用已标记的探针进行杂交，洗膜〔除去未结合 封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点
立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加 根据点样磨具不同，点样l 20×SSC混匀。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。
点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
第3页，共7页。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点 样，变性，中和，枯燥固定，预杂交，杂交，封闭， 检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和 Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样 品。
第4页，共7页。
实验步骤：
变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测 DNA样品中，稀释样品。100℃加热10min后，
中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合 杂交的双方是待测核酸及探针。
杂交的双方是待测核酸及探针。
牢固 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。
斑点印迹原理、操作步骤及应用
斑点印迹原理、操作步骤及应用一、原理斑点印迹（dot blot）是一种定性检测核酸或蛋白质的技术，其基本原理是硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子，因而将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相载体进行抗原-抗体反应。
当加入抗体后即可与膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。
加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而判定结果。
二、材料免疫斑点印迹所需的材料包括硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜），PBS缓冲液，抗原、抗体、标记二抗、相应底物，洗涤液、封闭液，37℃湿盒和温箱。
三、操作步骤免疫斑点印迹根据所用的二抗标记物不同，又可分为：①辣根过氧化物酶免疫斑点试验；②碱性磷酸酶免疫斑点试验；③金银染色免疫斑点试验（使用胶体金作为抗抗体的标记物）等。
其中最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。
具体操作步骤如下：1.抗原包被将0.01mol/L PBS pH 7.4稀释的已知抗原液2μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上，置37℃温箱中干燥20～30分钟。
2.封闭滴加封闭液37℃温盒中封闭10分钟，用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干。
3.抗原抗体结合加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置37℃湿盒中30分钟。
4.洗涤用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干。
5.加酶标二抗加入经过辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或胶体金标记的抗抗体，孵育、震洗、吸干。
6.显色加相应标记抗抗体的底物溶液显色5～10分钟，终止反应，观察结果。
四、注意事项免疫斑点印迹要求包被的抗原处于最适浓度，多以蛋白质含量500～1000μg/ml为宜。
浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
注意酶结合物的浓度，最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
第十二章 印迹杂交技术
二、RNA印迹法（Northern blot）
操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直 接变性转移； RNA经变性后再电泳（可用甲酰胺、甲醛等 使RNA变性，不能用碱，易使RNA降解）； 电泳时不能加EB，影响RNA与膜结合； 严防RNase污染。 用途：检测RNA（定性或定量分析细胞内总RNA或 某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含 量）——研究基因插入缺失等突变、基因表达（金 标准）。
一、核酸探针
——带有标记物且序列已知的核酸片段， 能与待测核酸中的特定序列特异杂交。
• 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析 能否成功的关键。
核酸杂交与分子探针
核酸探针应具有的条件
① 特异性高：只与待测核酸样品中的 互补序列杂交。 ② 带有标记物：标记物灵敏度高而稳 定，检测方便。
核酸探针的种类
常用核酸杂交分类
杂交方法
Southern印迹 Northern印迹 斑点杂交 菌落杂交和噬斑杂交
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA 分子,需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA 分子,需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从 细菌和噬菌体中释放的 DNA分子 检测细胞或组织中的DNA或 RNA分子
2.非放射性标记物
优点：无环境污染，可长时间贮存。 • 生物素：
一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上 和抗生物素蛋白（avidin）特异结合 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 • 酶促显色：
碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚 磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色 化合物二甲臜； 辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨基联苯胺（DAB） 生成红棕色沉淀物；或催化底物四氨基联苯胺（TMB）生 成蓝色沉淀物。
《杂交技术》幻灯片PPT
C
1
2
3
4
5
6
7
8
rRNA
Northern杂交检测
〔四〕、Western杂交
1、定义、 是将蛋白质先经电泳〔 SDS —PAGE 胶〕别离，
然后转移到固相载体上，最后用特异性抗体进 展免疫测定或蛋白质的染色。
Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年 代末，80年代初开展起来的一种蛋白质检测新 技术。其根本过程
结合的探针〔用放射性检测仪探测放射强度〕。
(5) 洗完的膜用滤纸吸干膜外表的水份，并用保鲜膜包裹，
且保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒， 置-70℃低温冰箱中曝光。
(7) 根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片
2. 随机引物合成法
• 随机引物：能与任何DNA模板的多个位点配对互
补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。
• 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA
模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,
能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为 原料合成新的与模板DNA互补的探针。 • 通常产物平均长度为400-600个核苷酸。
3、 RNA变性电泳的方法
用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢 氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过 程中变性而完全解离形成单链。
Northern 杂交和 Southern 杂交主要区别在于： Northern 杂交中待测的物质是 RNA。 Southern 杂交中待测的物质是 DNA。
blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹法〞， 也有人翻译为“斑渍法〞，更为普通的 是直接称为Southern blot)
混合斑的检验学习课件PPT
Y染色体：
优点 1不用分离精液成分和阴道液成分，两者 1/100~2000 时仍可正确检出精子 DNA，避免了操作过程中 精子DNA的损失，提高了检出阳性率 2 精子细胞比体细胞更稳定，保存 25 年的阴 道式子Y-STR获得成功 3可以推测犯罪嫌疑人的数目----轮奸案 注意提取多个部位的检材或一个检材的 不同部位，分别提取DNA 注意 可以排除，但不可以肯定
糖链----ABH特异性抗原，用A、B、O红细胞和AB型人血清吸收 蛋白----有器官特异性抗原 解离试验 +混合斑的浸出液 ELISA夹心法
Y
血清型、酶型
对比推断：血清型---- Gm、Km 酶 型----PGM1、Fu
DNA分析
常染色体：
关键---获得纯净的精子DNA-----差异裂解或二步抽提法 原理：精子细胞的表面蛋白含有大量的二硫键，可以抵抗去垢剂 SDS 核蛋白酶K的消化，而其他组织的细胞膜则可以被这两种物质消化。 方法：第一步：检材+1%SDS+100ug/ml蛋白酶K---37度2~3h 500r/min离心15min、去上清，精子留在沉淀物中 第二步：+40Mm/L DTT+1%SDS+100ug/ml蛋白酶K---注意：消化条件选择----主要是第一步消化时间 消化不完全----当阴道上皮细胞过多，不能使两者彻底分离 过渡消化----可能消化一部分精子细胞，导致精子DNA减少 *** 实际操作前，应进行涂片检查，根据精子和阴道上皮 细胞的比例，对消化时间、温度、试剂的浓度等进行 适当的调整 提取方法选择----采用有机溶剂的方法比较好 酚-氯仿能够去掉混合斑中的精浆蛋白，阴道分泌液、细 菌污染严重的的,用有机溶剂提取后,用5%clekex100提1次。
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斑点印迹杂交
实验目的
掌握斑点印迹杂交的原理及方法
实验原理
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及
离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸ຫໍສະໝຸດ 探针。斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）
上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自 显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改 变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭
7
酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入 3ml亲和素-辣根过氧化物 酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合
8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入 5ml洗液3，洗膜三次，每次 2-3min。洗去未结合的酶联抗体
9 显色：洗膜后，加3ml的显色液避光显色1-2min，斑点出来后
就可倒掉显色液，用ddH20冲洗几次，终止显色。
2h。变性DNA与探针结合
5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到
42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预热
到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交
膜上非特异性的蛋白结合位点
• 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，
室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固 1 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结
合位点
2 杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-
斑点杂交预期结果图
制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
NCF 滤纸 支撑板 至真空泵 点样板
96孔 12×8
废液储槽
缝形则称为狭缝杂交。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，
变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交
结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交
来说快，适合于同时分析多个样品。
实验步骤：
1 变性：按8:1将80ul ddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀释样品。 100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul 20×SSC混匀。
实验目的
掌握斑点印迹杂交的原理及方法
实验原理
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及
离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸ຫໍສະໝຸດ 探针。斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）
上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自 显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改 变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭
7
酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入 3ml亲和素-辣根过氧化物 酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合
8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入 5ml洗液3，洗膜三次，每次 2-3min。洗去未结合的酶联抗体
9 显色：洗膜后，加3ml的显色液避光显色1-2min，斑点出来后
就可倒掉显色液，用ddH20冲洗几次，终止显色。
2h。变性DNA与探针结合
5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到
42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预热
到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交
膜上非特异性的蛋白结合位点
• 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，
室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固 1 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结
合位点
2 杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-
斑点杂交预期结果图
制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
NCF 滤纸 支撑板 至真空泵 点样板
96孔 12×8
废液储槽
缝形则称为狭缝杂交。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，
变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交
结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交
来说快，适合于同时分析多个样品。
实验步骤：
1 变性：按8:1将80ul ddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀释样品。 100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul 20×SSC混匀。