动物细胞工程制药
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动物细胞工程制药
动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。
该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。
本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。
一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。
其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。
常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。
细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。
2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。
转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。
3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。
通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。
4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。
二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。
其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。
这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。
2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。
通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。
3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。
通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。
4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。
通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。
三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。
以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。
第3章 动物细胞工程制药
➢ 又如，HIV蛋白微球（microbicides）在局部使用可以
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
动物细胞工程制药
动物细胞技术需要进一步研究和开发的工作：
(1) 动物细胞基因工程技术和杂交技术。 (2) (3) (4) (5) 新型细胞培养反应器及其培养技术。 无血清、低蛋白或无蛋白培养基。 新型微载体研制技术及微囊化技术。 产物分离纯化技术。
§4.2 动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态
适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞
BHK-21 （baby hamster kidney） :从生
长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样
细胞,核型为2n=44,异倍体;培养基为DMEM 加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤 病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建。 重组凝血因子Ⅷ。
Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏
第四章 动物细胞工程制药
Hale Waihona Puke 主要内容1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9.
概述 动物细胞的形态和生理特性 生产用动物细胞 动物细胞的培养条件和培养基 动物细胞培养方法和操作方式 动物细胞生物反应器 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 动物细胞产品的制造实例 动物细胞制药的前景与展望
原核细胞与真核细胞区别
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺 、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基 常有的成分。 无机离子与微量元素: 细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素 ，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
对理化因素敏感， 如：渗透压、pH、离子浓度、
剪切力、微量元素等。
生物制药技术-第三章-动物细胞工程制药(1,2,3,4,5)
• 组织培养或细胞培养——将组织或细胞从机体取 出，在体外模拟机体体内的生理条件进行培养， 使之生存和生长，至今已有近百年的历史。1885 年德国人Roux用生理盐水培养鸡胚组织，使之存 活了数月之久；1897年Loeb证明从血液和结缔组 织中分离到的细胞可以在血清和血浆中存活； 19 03年Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂。这 些实验被认为是组织和细胞培养的早期萌芽实验。 1907年Harrison成功地在凹玻片的淋巴液内无菌 条件下培养了离体的蛙胚神经组织，并观察到神 经细胞突起的生长过程，由此开创了现代细胞培 养的新纪元。
• 糖类既是细胞的主要能源，同时也参与细胞的结构组成。 它以单糖或多糖形式存在。单糖中最重要的是五碳糖和六 碳糖。前者是核酸和核苷酸的组成部分，后者主要是葡萄 糖，它在细胞能量代谢中占重要地位。多糖在细胞中有两 类，一类是作为食物贮存的多糖，在动物细胞中是糖源， 它由约30000个葡萄糖单元构成，单元间以1，4糖苷键连 接，分支处以1，6糖苷键连接。另一类是结构多糖，真核 细胞和原核细胞的重要区别之一就在于许多mRNA翻译的 多肽链，常需要经过糖基化的修饰才具有成熟蛋白质的功 能。细胞的许多重要生理功能，如细胞的识别，表面受体， 胞内消化，以及细胞在载体表面的附着等，也都和糖蛋白 的作用分不开。
• 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细 胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进 行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发 生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及 使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力， 从而在离体条件下进行大量培养、 增殖，并提取 出对人类有用的产品。这是一门应用科学和工程技 术，它包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表 达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器 特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理 论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大 量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的 理论和技术。
动物细胞工程制药
• （4）BHK-21：1961年从5只无性别的生长1天 的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的 是1963年用单细胞分离的方法经13次的克隆的 细胞。成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用 于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂 犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。
四、基因工程细胞的构建和筛选
• 原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生 产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前 景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种 工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞 有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、 SP2/0和Sf-9等细胞。
二、动物细胞的生理特点
• 1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S 期+G2期）+分裂期（M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋 化，持续时间短，一般为2~5h。
• M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• （8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克隆 形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫 （Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。 它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（Autographa california MNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus） 高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添 加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及 10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外 来蛋白制品。
第三章动物细胞工程制药
•3
•2 细胞工程的研究范畴
•动物细胞与组织培养 •植物细胞与组织培养 •细胞融合 •细胞核移植 •染色体工程 •胚胎工程 •干细胞与组织工程 •转基因生物与生物反应器
•4
名词解释 细胞工程
思考题
填空
——是一切动、植物生命体的基本组成单位 。
•5
第二节 动物细胞的形态和生理特
征
一、动物细胞的形态
•22
一、动物细胞的培养条件
1.器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗（了解）
玻璃器皿的清洗
浸泡
刷洗
浸酸
冲洗
•23
•常用培养器皿及清洗 • 橡胶制品清洗 • 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分钟，流 水冲洗，0.5mol/L HCl 煮沸 15 分钟，流水冲洗，自来水煮沸 2 次，蒸馏水煮沸 20 分钟，50℃ 烤干备用。 •塑料制品的清洗 •塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用
优点：操作简单，无化学毒性，融合同步，融合率 高，可在显微镜下观察全过程。
决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的 性质（PH、I和渗透压）
5.重组工程细胞系 可采用基因工程的手段构建各种工程细胞。
•17
四、细胞库的建立
生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库（master cell bank,MCB) ⒉生产用细胞库(manufacturer working cell bank,MWCB)
特点：①细胞分裂不受细胞密度影响，无接触抑
制现象，性状不规则
②具有无限生命力，倍增时间短
③对培养条件、生长因子要求低
•2 细胞工程的研究范畴
•动物细胞与组织培养 •植物细胞与组织培养 •细胞融合 •细胞核移植 •染色体工程 •胚胎工程 •干细胞与组织工程 •转基因生物与生物反应器
•4
名词解释 细胞工程
思考题
填空
——是一切动、植物生命体的基本组成单位 。
•5
第二节 动物细胞的形态和生理特
征
一、动物细胞的形态
•22
一、动物细胞的培养条件
1.器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗（了解）
玻璃器皿的清洗
浸泡
刷洗
浸酸
冲洗
•23
•常用培养器皿及清洗 • 橡胶制品清洗 • 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分钟，流 水冲洗，0.5mol/L HCl 煮沸 15 分钟，流水冲洗，自来水煮沸 2 次，蒸馏水煮沸 20 分钟，50℃ 烤干备用。 •塑料制品的清洗 •塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用
优点：操作简单，无化学毒性，融合同步，融合率 高，可在显微镜下观察全过程。
决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的 性质（PH、I和渗透压）
5.重组工程细胞系 可采用基因工程的手段构建各种工程细胞。
•17
四、细胞库的建立
生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库（master cell bank,MCB) ⒉生产用细胞库(manufacturer working cell bank,MWCB)
特点：①细胞分裂不受细胞密度影响，无接触抑
制现象，性状不规则
②具有无限生命力，倍增时间短
③对培养条件、生长因子要求低
生物制药第三章动物细胞工程制药
⽣物制药第三章动物细胞⼯程制药⽣物制药第三章动物细胞⼯程制药第⼀节概述第⼆节动物细胞的形态和⽣理特点第三节⽣产⽤动物细胞的要求和获得第四节动物细胞的培养条件和培养基第五节动物细胞培养的⽅法和操作⽅式第六节动物细胞⽣物反应器及其检测控制系统第七节动物细胞制药的前景和展望1665年英国物理学家虎克Hooke⽤⾃制的显微镜发现了细胞实际上是死细胞留下的细胞壁1673年荷兰科学家列⽂虎克才真正观察到了细胞-细菌1838年德国的植物学家Schleiden 观察到植物细胞1839年动物学家Schwann 观察到动物细胞。
??从此认为细胞是⼀切动植物体结构和功能的基本单元并创⽴了细胞学说。
第⼀节第⼀节概概述述??1885年德国⼈Roux⽤⽣理盐⽔培养鸡胚组织。
??1897年德国⽣理学者Loeb证明从⾎液和结缔组织中分离到的细胞可以在⾎清和⾎浆中存活。
??1903年Jolly观察到蝾螈细胞可以进⾏体外分裂。
??1907年Harrison 在凹玻⽚的淋巴液内⽆菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织。
将组织或细胞从机体取出在体外模拟机体体内⽣理条件进⾏培养使之⽣存和⽣长已有近百年历史了。
第⼀节第⼀节概概述述随着细胞⽣物学、分⼦⽣物学、⽣物化学和基因⼯程等⼀系列学科和技术的发展逐渐形成了细胞⼯程学。
以细胞为单位按⼈们的意志应⽤⽣物学、分⼦⽣物学等理论和技术有⽬的地进⾏精⼼操作使细胞的某些遗传特性发⽣改变从⽽达到改良或产⽣新品种的⽬的以及使细胞增加或重新获得产⽣某种特定产物的能⼒从⽽在离体条件下进⾏⼤量培养、增殖并提取出对⼈类有⽤的产品。
动物细胞药物疫苗、淋巴因⼦、纤维蛋⽩溶酶原激活剂、单克隆抗体………细胞⼯程包括真核细胞的基因重组、导⼊、扩增和表达的理论和技术细胞融合的理论和技术细胞器特别是细胞核移植的理论和技术染⾊体改造的理论图际踝蚨参锏睦砺酆图际跸赴罅颗嘌睦砺酆图际跻约敖泄夭锾崛〈炕睦砺酆图际酢细胞膜:由⼀层⽣物膜组成是细胞与周围环境的分隔。
生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞培养基和添加剂 —— 血清
血清的成分：没有完全明确
蛋白质：白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等
激素：主要是细胞因子类，如生长因子等
代谢物、营养物、无机盐 抑制物
血清营养丰富，极易染菌、染毒 血清批次之间性质有差别，质量不稳定 成本高昂，且对产物分离有一定影响
操作过程（贴壁细胞）： 1.弃使用过的细胞培养基
（二）细胞的传代(subculture)：从原培养容器中分离细胞
2.清洗：使用PBS平衡盐溶液清洗细胞。
3.消化：加入消化液(trypsin)到长着细胞的一面。 孵育 在5-15分钟，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。
4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基， 通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次 培养细胞。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。 一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层 生长，细胞密度可大大增加。
动物细胞工程制药
接触抑制
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
动物细胞培养器具
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
实验室要求
（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等， 入内换上。 （B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥。 （C）侧部可设传递窗，用于物品传递。 （D）有消毒用紫外线灯
动物细胞工程制药
细胞系的选择
几个概念
细胞系（cell line）
由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体
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• （4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
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应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞 所不能生产的药用蛋白。
• 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子
细胞。
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第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态 • 二、动物细胞的生理特点
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动物细胞生产药物的优缺点
• 缺点：培养条件高、成本贵、产量低。 • 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖
基化，与天然产品一致。
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第三节 生产用动物细胞的要求 和获得
• 一、生产用动物细胞的要求 • 二、生产动物细胞的获得 • 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
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动物细胞培养一代生长过程
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4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易
产生影响。 5、动物细胞培养基的要求高
与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、 8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因 子，而且不同种类要求又有变化。
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英 国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切 成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
• （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
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• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、 导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
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• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同 • 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，
前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上 合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多 数为糖蛋白。 • 蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高 尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖， 在高尔基体内加接的是O-链寡糖。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官， 经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g 组织约有109个细胞。
鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
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• 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 • 当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，
即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决 于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培 养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养 基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原 来的50代增加至150代。 • 当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞 系，或称连续细胞系。
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一、动物细胞的形态
细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前
者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
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动物细胞 结构图
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• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内 胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞 片。
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• 2、悬浮细胞 这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液
中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产 干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
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• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴 壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细 胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆 形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。
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传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制 • 癌细胞生产药物需谨慎！
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一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
产品中DNA残留量。
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• M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
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• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象
• 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
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二、动物细胞的生理特点
• 1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S 期+G2期）+分裂期（M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
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• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋 化，持续时间短，一般为2~5h。
动物细胞工程制药
张忠山 生命科学学院
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• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
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第一节 概述
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• 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时， 细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止 增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段 时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为 接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转 化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生 长，细胞密度可大大增加。
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应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞 所不能生产的药用蛋白。
• 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子
细胞。
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第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态 • 二、动物细胞的生理特点
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动物细胞生产药物的优缺点
• 缺点：培养条件高、成本贵、产量低。 • 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖
基化，与天然产品一致。
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第三节 生产用动物细胞的要求 和获得
• 一、生产用动物细胞的要求 • 二、生产动物细胞的获得 • 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
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动物细胞培养一代生长过程
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4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易
产生影响。 5、动物细胞培养基的要求高
与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、 8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因 子，而且不同种类要求又有变化。
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英 国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切 成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
• （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
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• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、 导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
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• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同 • 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，
前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上 合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多 数为糖蛋白。 • 蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高 尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖， 在高尔基体内加接的是O-链寡糖。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官， 经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g 组织约有109个细胞。
鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
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• 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 • 当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，
即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决 于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培 养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养 基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原 来的50代增加至150代。 • 当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞 系，或称连续细胞系。
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一、动物细胞的形态
细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前
者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
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动物细胞 结构图
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• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内 胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞 片。
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• 2、悬浮细胞 这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液
中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产 干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
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• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴 壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细 胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆 形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。
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传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制 • 癌细胞生产药物需谨慎！
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一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
产品中DNA残留量。
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• M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
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• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象
• 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
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二、动物细胞的生理特点
• 1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S 期+G2期）+分裂期（M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
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• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋 化，持续时间短，一般为2~5h。
动物细胞工程制药
张忠山 生命科学学院
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• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
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第一节 概述
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• 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时， 细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止 增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段 时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为 接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转 化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生 长，细胞密度可大大增加。
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