抗体的检测和纯化课件
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生化课件--抗原抗体的纯化
（二)亲水性离子交换剂 亲水性离子交换剂中的基质为一类天然的或 人工合成的化合物，与水亲和性较大，常用的 有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。 ① 纤维素离子交换剂 或称离子交换纤维素， 是以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成 的。根据引入电荷基团的性质，也可分强酸性、 弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素 离子交换剂中，最为广泛使用的是二乙胺基乙 基(DEAE-)纤维素（弱碱性阴离子）和羧甲基 (CM-)纤维素（弱酸性阳离子）。（表3-6）
（一）原理
1、有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整 个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间引力 增强，使溶质分子相互吸引而聚集。 2、亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相 互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的选择 原则：水溶性好，沉淀效率高，毒性小，惰性，便宜 常用：乙醇、丙酮、甲醇等
离子交 换剂的 类型 强酸性 交换基 团 磺酸剂 -SO3H
阳离子交换剂 中强酸 性 磷酸基 -PO3H2 亚磷酸 基-PO2H2 弱酸性 羧基 -COOH 酚基 苯环-OH 强碱性
阴离子交换剂 中强碱 性 叔胺 -N(CH3)2 弱碱性 仲胺 -NHCH3 伯胺 -NH2
季氨基 N(CH3)3
优点：交换容量大，机械强度高，膨胀率小， 便宜； 缺点：结构紧密，大分子不易进出，疏水，大 分子易变性 适用于小分子的分离
(三)影响有机溶剂沉析的因素
1、pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的 pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通 常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。 2、温度 常温下物质结构松散，有机溶剂易渗入分子内部， 引起变性；降低温度可降低溶解度；且有机溶剂与水 混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较 低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过 浓。
详细介绍抗体的分离纯化精编版
但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以
有时也用其它中性盐进行盐析。
高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。
硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化的第一步。这个方法通常可以有效的除 去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。
17
12/12/2016
硫酸铵沉淀
所需溶液:
饱和硫酸铵溶液: 100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解;
12/9/2016
6
方法二:
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和 球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于pH4.0时沉淀。
步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时; 3.17,000g离心; 4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;
15分钟。 • 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。 • 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。
12/9/2016
9
过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效的减少对蛋白
的非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，
一、盐析法
在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过 程称为“盐析”。
增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。
优点：①成本低，不需要昂贵的设备；
②操作简便，安全；
③对许多生物活性物质具有稳定作用；
④对pH、温度要求不严格。
缺点：分离效果有限
12/9/2016
7
苯酚红
有时也用其它中性盐进行盐析。
高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。
硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化的第一步。这个方法通常可以有效的除 去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。
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硫酸铵沉淀
所需溶液:
饱和硫酸铵溶液: 100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解;
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方法二:
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和 球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于pH4.0时沉淀。
步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时; 3.17,000g离心; 4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;
15分钟。 • 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。 • 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。
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过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效的减少对蛋白
的非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，
一、盐析法
在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过 程称为“盐析”。
增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。
优点：①成本低，不需要昂贵的设备；
②操作简便，安全；
③对许多生物活性物质具有稳定作用；
④对pH、温度要求不严格。
缺点：分离效果有限
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苯酚红
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
抗体的分离纯化原理和测定优秀课件
•
硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售
的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5
以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。
(三)盐析时需注意的问题
• 1. 盐的饱和度
• 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素， 不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离 几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低 到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离 心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种 蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白， 当饱和度达20％时，纤维蛋白原首先析出；饱 和度增至28％—33％时，优球蛋白析出；饱和 度达33％—50％时，球蛋白析出；饱和度大于 50％以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱 和皮为33％开始析出。
• 可依据抗体的特性进行分离纯化： 据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法
将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷 的不同，用离子交换，电泳等技术分离….. 按分离方法： 沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其 中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离 即纯化。
一、盐析法
• （一）原理
•
蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度变
抗体的分离纯化原 理和测定
第一节 抗体的分离纯化
• 无论是将抗体用于研究还是用于检测 或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。
• 分离：将抗体从其存在的体液或培养液 中分离出来并加以初步纯化。
• 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并 将其中的杂质控制在所需的低水平。对治 疗性抗体尤为重要。
分离纯化的方法
• 2．截留分子量
•
超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。
它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子
量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械
详细介绍抗体的生产制备ppt课件
半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法。
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
16
四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常 用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类） 抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
24
放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射 性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁 计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间， 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起 注意。
22
（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。
1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
17
1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
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四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常 用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类） 抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
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放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射 性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁 计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间， 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起 注意。
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（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。
1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
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1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
《抗原抗体的纯化》PPT课件
即：
RCF Fc 1.12105 n2 r Fg
2021/5/28
15 15
（二）离心时间
依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。
• 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从 离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时 间；
• 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间， 即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指 颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。
2021/5/28
23 23
（三） 影响盐析的因素
• 1. 蛋白质的浓度
过高过低都不好，一般认为2.5 %~3.0%蛋白质浓度比较 合适。
• 2. pH
蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液pH 常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零。
• 3. 温度
盐析一般对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温 度敏感的物质，要求在0 ℃~4 ℃进行，防止蛋白质变性。
至较低温度。
• 3. 样品浓度：过高过低均不好，0.5 % ~ 2 %
• 4. 有机溶剂的浓度：有机溶剂的用量一般为溶液体积
的2倍左右，有机溶剂的浓度约为70%。
• 5. 离子浓度 ：有机溶剂在中性盐存在的条件下可以减
少蛋白质的变性，提高分离效率。需加0.05 mol/L左右的 中性盐。
• 6. 金属离子：一些多价阳离子如Zn2+、Cu2+和Ca2+ ，
2021/5/28
17 17
（四）pH
• 离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定 的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。
• pH过高或过低都可能引起生物活性物质的 变形、失活，还可能引起转子和离心机其 它部件的腐蚀，应加以注意。
RCF Fc 1.12105 n2 r Fg
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15 15
（二）离心时间
依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。
• 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从 离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时 间；
• 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间， 即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指 颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。
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（三） 影响盐析的因素
• 1. 蛋白质的浓度
过高过低都不好，一般认为2.5 %~3.0%蛋白质浓度比较 合适。
• 2. pH
蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液pH 常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零。
• 3. 温度
盐析一般对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温 度敏感的物质，要求在0 ℃~4 ℃进行，防止蛋白质变性。
至较低温度。
• 3. 样品浓度：过高过低均不好，0.5 % ~ 2 %
• 4. 有机溶剂的浓度：有机溶剂的用量一般为溶液体积
的2倍左右，有机溶剂的浓度约为70%。
• 5. 离子浓度 ：有机溶剂在中性盐存在的条件下可以减
少蛋白质的变性，提高分离效率。需加0.05 mol/L左右的 中性盐。
• 6. 金属离子：一些多价阳离子如Zn2+、Cu2+和Ca2+ ，
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（四）pH
• 离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定 的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。
• pH过高或过低都可能引起生物活性物质的 变形、失活，还可能引起转子和离心机其 它部件的腐蚀，应加以注意。
病毒的纯化和检测ppt课件
• 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化 (如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风 疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染 的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑后者所特有的 CPE。
• 4.细胞代谢的改变
• 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细
② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使 邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。
③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中 形成胞浆或核内的包涵体。
• 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)
• 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血
利用生物学方法纯化病毒
病毒的纯化和检测
1
二、标本的采取与送检
• 应注意下列原则：
• 1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时， 应使用抗生素。
• 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低 温保存并尽快送检。
• 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和 病后各取血清，以便对比双份血清抗体效 价的动态变化。
• 3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)
法
• 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总
称，为病毒分离鉴定病中毒的的纯最化和常检测用的基本方法。
8
病毒的纯化和检测
9
病毒在培养细胞中增殖的指标
1. 细胞的变化
① 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细 胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、 溶解或脱落等。
病毒的纯化和检测
• 4.细胞代谢的改变
• 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细
② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使 邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。
③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中 形成胞浆或核内的包涵体。
• 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)
• 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血
利用生物学方法纯化病毒
病毒的纯化和检测
1
二、标本的采取与送检
• 应注意下列原则：
• 1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时， 应使用抗生素。
• 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低 温保存并尽快送检。
• 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和 病后各取血清，以便对比双份血清抗体效 价的动态变化。
• 3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)
法
• 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总
称，为病毒分离鉴定病中毒的的纯最化和常检测用的基本方法。
8
病毒的纯化和检测
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病毒在培养细胞中增殖的指标
1. 细胞的变化
① 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细 胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、 溶解或脱落等。
病毒的纯化和检测
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• Protein A
• A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
•
Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法
的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地
结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合
力,结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b >
IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p
H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯
化与其结合较弱的IgG1。
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方法
1 腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下 离心15min ,以除去较大的凝块。
2 装柱 将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干 粉用6～7ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然 后装入层析柱中。
一 饱和硫酸铵沉淀法
•
饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋
白质的常用方法。这是一种比较原始，非
特异性分离技术。
•
饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度
的抗体。其它大分子蛋白和混入絮状沉淀
中的蛋白会造成对抗体的污染。因此把它
作为抗体纯化的第一步。
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1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加 到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸 pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液 （ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.。
2.其它不同饱和度铵溶液的配制 。
• （二）沉淀 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1，基本原理
• 高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与 蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面 的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中 沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因 而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的 蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通 常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大， 温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最 广。
3 平衡 用10 倍柱床体积的上样缓冲液过柱, 流速为1ml/ min , p H 试纸测试流出液体的p H 为7. 不当之处，请联系网站或本人删除。
4 上样 取预处理过的腹水5ml ,用上样缓冲 液稀释至50ml ,用0. 45μm 的滤膜过滤,上样, 流速为1ml/ min 。
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• 抗体的纯化
--- 杨成遇 甘志雪
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纯化步骤
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抗体 纯化的步骤
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3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
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• Protein A/G亲和层析
• 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• （三）透析 1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS 0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ）， 每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除 去硫酸氨；
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2， 操作步骤
• 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体 的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析 所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用 来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50%
• （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）
1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ， 除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液 中，终浓度为 1 ： 1
• 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅 拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
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还可以特异性低亲和地与重链的CH1及轻
链的Cκ 结合而用于纯化Fab 及F(ab’)2。另
外，ProteinG可以广泛、更强地结合许多
类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清
蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落
也相对更低。
Protein A-Sep harose CL2-4B 亲 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 和层析柱分离提纯IgG
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• Protein G
•
G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表
面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于
A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。
像A蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异
性结合，不同的是，Protein G Sepharose