重组DNA的基本原理
基因重组知识点总结
基因重组知识点总结一、基因重组的原理基因重组的原理是在DNA分子水平上，通过切割和重组DNA的不同片段，形成新的DNA 序列。
基因重组可以实现DNA片段的互换、合并、删除或插入操作，从而改变DNA的序列，并且产生新的基因组合。
基因重组的原理主要涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
1. DNA的结构DNA是由四种碱基（腺嘌呤A、胞嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C）组成的双链分子，它的结构在空间上呈现出双螺旋的形态。
每一条DNA链都由磷酸和脱氧核糖组成，而这些单元组成了DNA的主干。
而碱基对（A-T、G-C）则连接了两条DNA链，形成了DNA的双链结构。
2. 酶的作用在基因重组的过程中，酶起着至关重要的作用。
例如，核酸酶能够切割DNA分子，使得DNA的特定区域被切割成不同的碱基序列；而连接酶则能够将不同的DNA片段连接起来，形成新的DNA序列。
此外，一些重组酶还可以通过其催化作用来促进DNA分子的重组。
这些酶的作用在基因重组的过程中起着关键的作用。
3. DNA片段的互补配对在DNA重组的过程中，DNA分子的互补配对起着非常重要的作用。
DNA的双链结构使得其具有互补配对的性质，即A会与T形成氢键，而G则会与C形成氢键。
这种互补配对性质使得DNA片段能够通过互补配对的方式进行连接或重组。
综上所述，基因重组的原理涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
通过这些原理，我们可以实现DNA分子中某一段DNA片段的与同一DNA分子或不同DNA分子中的另一段DNA片段重新组合成新的DNA序列。
二、基因重组的方法基因重组的方法主要包括DNA重组、基因克隆、基因组编辑和CRISPR-Cas9等。
这些方法可以分别用于不同的应用领域，并且在现代生物技术中有着重要的价值。
1. DNA重组DNA重组是指通过DNA片段的切割和重组来形成新的DNA序列。
这一方法主要依赖于核酸酶的切割作用和连接酶的连接作用。
dna重组技术的原理
DNA重组技术的基本原理DNA重组技术是一种通过人工手段改变DNA序列的方法，它在生物学、医学和农业领域有着广泛的应用。
DNA重组技术可以用于研究基因功能、制备重组蛋白、生产药物、改良农作物等。
其基本原理涉及到DNA分子的切割、连接和复制等过程。
1. DNA的切割DNA分子由两条互补链组成，每条链上都有一系列的核苷酸。
在DNA重组技术中，常常需要将某个特定的片段从一个DNA分子中切割出来，并插入到另一个DNA分子中。
为了实现这个目标，可以利用一种特殊的酶——限制性内切酶。
限制性内切酶能够识别并切割特定的DNA序列，产生具有粘性末端或平滑末端的断裂。
当两条互补链上都存在具有相同粘性末端或平滑末端的断裂时，它们可以通过碱基对互补配对重新连接。
这种重新连接称为“黏合”。
2. DNA片段插入在进行DNA重组时，需要将一个DNA片段插入到另一个DNA分子中。
为了实现这个目标，需要使用一种称为“载体”的DNA分子。
载体是一种能够自主复制的DNA分子，常用的载体包括质粒和噬菌体。
载体通常具有多个限制性内切酶切割位点，以便在特定位置插入目标DNA片段。
将目标DNA片段和载体同时用同一种限制性内切酶切割。
通过黏合作用将目标DNA 片段和载体连接在一起。
这样就得到了重组的DNA分子。
3. DNA的复制重组的DNA分子需要进行大量的复制，以便获得足够多的重组产物进行后续应用。
为了实现这个目标，可以利用一种特殊的酶——聚合酶。
聚合酶能够识别并复制DNA分子中的每一个核苷酸，并在其互补链上合成新的核苷酸。
通过PCR（聚合酶链式反应）技术或细菌转化等方法可以实现大规模复制重组的DNA分子。
4. DNA测序在进行DNA重组技术时，通常需要对重组产物进行测序，以确认所得到的DNA序列是否正确。
DNA测序是一种确定DNA序列的方法，常用的测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
在Sanger测序中，通过利用聚合酶合成新的核苷酸链时，将一种特殊的二进制链终止剂添加到反应体系中。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
重组DNA技术是一种基因工程技术，通过改变DNA序列来创建新的DNA序列或改变现有DNA序列。
它可以用于插入外源基因、删除或替换特定基因、改变基因的表达水平等。
重组DNA技术的基本原理是利用酶切和连接作用来剪切和连接DNA分子。
首先，通过特定的限制性内切酶将DNA分子切割成特定的片段。
然后，通过DNA连接酶将所需的DNA 片段连接起来，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
操作方法包括以下几个步骤：1. 提取目标DNA：从源细胞或组织中提取目标DNA，可通过酸性条件、酶处理和离心等方法获得。
2. DNA片段的切割：使用限制性内切酶选择性地切割目标DNA和外源DNA，生成互补的黏性末端或平滑末端。
3. DNA片段的连接：通过DNA连接酶将切割的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
4. 重组DNA的导入：将重组DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化、病毒转染等。
5. 重组DNA的复制和表达：在宿主细胞中，重组DNA可以经过复制和转录/翻译过程，产生相应的蛋白质。
重组DNA技术的应用十分广泛，包括：1. 生产重组蛋白质：通过插入外源基因，改变宿主细胞的代谢途径，使其表达目标蛋白质，用于药物生产、工业生产等。
2. 基因治疗：将健康的基因插入患者的细胞中，用于治疗遗传性疾病等。
3. 基因敲除和敲入：通过重组DNA技术，在宿主细胞中删除或替换特定基因，研究基因功能和相关疾病的发生机制。
4. 基因工程作物：通过插入外源基因，改变植物的性状，使其具有抗虫、抗病、抗逆境等特性。
5. DNA检测和诊断：包括PCR扩增、基因测序、基因突变检测等，用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪学等领域。
总之，重组DNA技术的原理是通过酶切和连接作用来改变DNA序列，操作方法包括提取DNA、切割DNA片段、连接DNA片段、导入宿主细胞并实现复制和表达。
其应用领域广泛，包括蛋白质生产、基因治疗、基因工程作物等。
DNA重组技术的原理及步骤
DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术是一种分子生物学技术，它通过重新组合DNA分子的特定部分，可以改变生物体的基因组成，从而实现对基因的操作和操控。
DNA重组技术的原理可以概括为：通过酶类作用在DNA链上剪切出特定的片段，再利用DNA连接酶将不同源的DNA片段连接在一起，形成新的DNA分子。
第一步：DNA提取DNA提取是DNA重组技术的前提和基础。
首先需要选择适当的生物样本，如细菌、植物、动物细胞等，利用细胞裂解方法将细胞溶解，释放出DNA。
然后经过蛋白质酶的消化，去除蛋白质、RNA等杂质，最终得到纯净的DNA溶液。
第二步：DNA切割DNA切割是指将DNA分子切割成特定的片段。
这一步骤可以利用限制性内切酶来实现。
限制性内切酶是一种酶类，能够识别DNA链上的特定序列，并在该序列的特定位点上切割DNA链。
通过选择不同的限制性内切酶，可以将DNA切割成不同长度的片段。
第三步：DNA纯化与回收切割后的DNA片段需要通过凝胶电泳分离和纯化。
凝胶电泳是利用DNA片段在电场中的移动速度差异，使不同长度的DNA片段在凝胶中分离的方法。
分离完成后，可以通过抽取单个的DNA片段进行纯化，获得所需的DNA溶液。
第四步：目标片段回收将目标片段从凝胶中回收需要先进行DNA片段的可视化。
一般可以采用亮蓝G染色剂着色和紫外线照射的方式进行可视化，然后使用刮片等方法将目标片段回收。
第五步：DNA连接DNA连接是将目标片段与载体DNA连接在一起，形成重组DNA。
载体DNA一般选择能够稳定复制的质粒或噬菌体基因组。
连接需要使用DNA连接酶，该酶能够识别DNA链的断裂末端，并将目标片段与载体DNA连接在一起。
第六步：转化连接完成后，可以将重组的DNA转移到宿主细胞内。
转移可以通过化学法转化细胞、电穿孔法或者基因枪等方法实现。
转化后的细胞会自主复制并表达被插入的重组DNA。
第七步：筛选与鉴定对转化后的细胞进行筛选与鉴定，以确定是否成功插入重组DNA。
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
DNA重组实验原理及步骤
实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。
②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。
③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
重组DNA技术的概述与应用
重组DNA技术的概述与应用DNA是构成生命的基础，也是遗传信息的携带者。
近年来，随着科学技术的不断发展，人类已经掌握了对DNA的重组技术。
重组DNA技术是将不同来源、不同物种的DNA分解并重新组合，形成一种新的基因组合。
这种技术具有较高的专业性和技术含量，有着广泛的应用场景。
I. 重组DNA技术的基本原理DNA重组技术主要通过DNA序列的剪切和接合实现。
首先，需要对某个DNA序列进行剪切，得到具有特定功能的DNA段。
而后，将这个DNA段与另一个DNA序列（可能是相同的序列，也可能是来自不同生物）通过一定的手段进行接合，形成一个新的DNA序列。
II. 重组DNA技术的应用1. 转基因技术。
转基因技术是指将人为合成的基因直接从另一种物种中移植到目标物种中，从而实现新性状的引入。
这种技术被广泛应用于农业、医学和工业生产等领域。
2. 疾病诊断。
通过重组DNA技术可以合成新的DNA探针，用于疾病的诊断和治疗。
例如，可以合成特异性的DNA探针，用于检测某些癌症和遗传病的基因突变。
3. 生物武器的防治。
通过重组DNA技术可以合成疫苗和抗生素，用于防治传染病。
同时，也可以合成特别的DNA序列，用于检测和侦测生物武器等威胁因素。
4. 生物工艺。
重组DNA技术可以用于生物工艺生产，例如通过合成烟酸酶和超量表达方法，生产出用于降低胆固醇的药物。
III. 重组DNA技术的争议和风险随着重组DNA技术的不断发展，也给人们带来了很多争议和风险。
一方面，一些专家担心重组DNA技术对生态安全造成潜在威胁，例如基因污染和生态风险等；另一方面，一些人则担心重组DNA技术可能会导致基因破坏，引起不可预测的后果。
此外，还有对基因技术应用于生育的道德和法律规范争议等等。
总之，重组DNA技术作为一项高科技技术，具有着广泛的应用领域和前景。
但是，也要注意在应用的过程中，需要严格遵守相关的法律法规，为社会的安全和稳定提供保障。
dna重组名词解释
dna重组名词解释DNA重组是指将来自不同来源的DNA分子以某种技术手段重新组合、重组，从而产生具有新功能的DNA分子的过程。
这一概念最早出现在20世纪60年代末期，由于它具有重要的理论和实际应用价值，成为分子遗传学、基因工程和生物技术领域的重要研究内容。
DNA重组的基本原理是通过剪切、连接和复制等技术手段，将不同的DNA片段重新组合在一起，产生具有新功能的DNA分子。
具体来说，DNA重组包括以下几个关键步骤：1. DNA剪切：通过酶切等技术手段，将目标DNA分子切割成较小的片段。
这些片段可以来自同一源DNA分子的不同区域，也可以来自不同源DNA分子。
2. DNA连接：将切割得到的DNA片段以特定的方式重新连接在一起。
连接方式可以是末端互补连接，也可以是通过连接酶或DNA连接的工具分子来进行连接。
3. DNA复制：通过转化、转染等技术手段，将DNA重组后的分子导入到宿主细胞中。
宿主细胞会通过其内部的复制机制对DNA分子进行复制，从而扩增目标DNA。
DNA重组在生物学研究和实际应用中具有广泛的意义和用途。
首先，它为分子遗传学的研究提供了重要的工具和方法，使得科学家们能够对DNA分子的结构和功能进行深入研究。
其次，它为基因工程的发展提供了基础，使得人们可以通过改变DNA序列来改变生物体的性状、产生新的药物和农业品种。
此外，DNA重组还可用于基因定位、基因治疗和疾病诊断等领域，为医学健康和生物工业的发展做出了重要贡献。
然而，DNA重组也存在一些风险和争议。
一方面，不正确的DNA重组可能会导致对生物体的不可逆伤害，如产生有害突变导致疾病发生。
另一方面，人类对于基因工程技术的利用可能引发道德和伦理方面的争议，如基因歧视、基因优化等问题。
因此，在进行DNA重组研究和应用时，需要加强科学和伦理的审慎思考和监管。
总之，DNA重组是一种重要的生物技术手段，通过重新组合DNA分子，可以产生具有新功能的DNA分子。
它在生物学研究、基因工程和生物技术等领域具有重要意义和应用价值，但也需要注意其潜在的风险和伦理争议。
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• 转基因作物的历史很短。1992年，中国种植了 世界上第一批商用转基因作 物－－转基因烟草。 1994年，美国市场上才首次出现了转基因食品， 一种软化 缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨 大优势，推广非常快。到2000年， 全世界已有 4420万公顷的土地种植转基因作物，其中美国 占68％，阿根廷占23％， 加拿大占7％，中国 占1％，其他国家占1％。大豆、玉米、棉花和 油菜是主要的 转基因作物，在美国，有近一半 的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是 转 基因作物。美国超级市场上的食物制品中， 约60％含有转基因的成分。在公众的 反对声中， 目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业 化国家，转基因作物的 种植面积有减少的趋向。 美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美 国是农产 品出口大国，欧洲、日本对转基因作 物进口的限制，也打击了美国农民的积极性。
Arguments on Human Cloning
A.人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出 賣？新的基因組合的專利是屬於科學家(醫生) 的，還是那個複製人的？如何保護專利權？ 如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來 複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷 偷用你的細胞複製人怎麼辦？
Arguments on Human Cloning Ethical Considerations
• 方式:
转化、转染、感染
导入大肠杆菌 1. 氯化钙转化法 2. 电击法 3. 体外包装感染法
• 导入哺乳动物细胞
• • • • • • • • • 1. 显微注射法 2. 电穿孔法 3. DNA-磷酸钙共沉淀 4. DEAE-葡聚糖转染法 5. 病毒感染法 6. 脂质体介导法 7. 细胞融合法 8. 原生质体融合法 9. 微细胞介导法
1. 分：分离目的基因
2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接
4. 转：重组DNA转入受体菌
5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体
基因工程技术策略
分： 质粒 基因载体 噬菌体 病毒
直接分离 cDN限制性内切酶
目的基因
接：
粘端连接
连接酶
平端连接 尾接法
重组体
转： 转化 转染 带重组体的宿主 筛： 表型筛选 电泳法 核酸杂交 体外包装
基因工程技术与医学的关系
1.生命科学研究的趋势
2.疾病基因的发现 3.发展生物制药
4.基因诊断与基因治疗
5.遗传病的预防
基因工程的目的
1. 醫學用途: 超過１００種基因治療法已經 在全球推行 2. 改善農業: 糧食產量大增，解決飢荒；抵 抗病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛， 保存期更長。
(五)重组体的筛选
直接选择法
1. 抗药性选择 2. 标志补救 3. 分子杂交法
间接筛选法
核酸水平
*1. 酶切图谱 *2. 核酸探针 *3. PCR *4. 序列测定
蛋白质水平
免疫学的技术： S D S - PA G E 、 Western blot 、 ELISA 、放mic DNA library) • cDNA (cDNA library)
聚合酶链反应（PCR）
• Polymerase Chain Reaction
• 基本原理： 变性、 退火、 延伸
(二)克隆载体的选择和构建
•
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
Transgenic tobacco plant with gene for firefly luciferase
关于基因工程的争议
A.花那麼多經費研究基因工程，卻不能妥善照顧 貧困的病人，不關心是否建立比較健全的公共 衛生體系，來有效預防和治療疾病，或是訂定 較完整的社會福利措施，這樣是否合乎倫理？ B.掌握基因工程科技的強國是否藉著優勢來宰制 弱小國家？基因工程技術落入犯罪集團或野心 家手中怎麼辦？提高了糧食產量，是否造成另 一個資源分配不均的問題？
组抗 体 药性 筛 选 重
(六)克隆基因的表达
• 原核表达体系——表达载体的标准：
1. 含有大肠杆菌适宜的选择标志 2. 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 3. 含有适当的翻译控制序列 4. 含有合理设计的多接头克隆位点
真核表达体系 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞
DNA克隆的基本过程
• • 克隆载体
•
(三) 外源基因与载体的连接
连接策略
1. 粘端DNA间的连接
(1) 同一限制性内切酶切割位点连接
(2) 不同限制性内切酶切割位点连接
2. 平端DNA间的连接
3. 同聚物加尾连接
4. 人工接头连接
(四)重组DNA分子导入受体菌
• 无性繁殖 • 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态.
Ａ.複製人的養育責任是誰？複製人長大以後是否 告知其出身？ Ｂ.誰是他的父母？被複製人與被複製人的配偶？ 被複製人的父母？科學家(醫生 )？代理孕母？ Ｃ.複製人推翻家庭婚姻制度，使得生育不再是家 庭婚姻內的產物，他可能沒有自己的家庭。 Ｄ.社會應該如何看待複製人？如何免受歧視？人 權、社會地位、法律身分如何定義？
3. 稀有動物的保育: 拯救瀕臨絕種的動物 4. 其他:政治用途、經濟用途、娛樂用途等。
• 转基因作物，目前最常见的是转入抗除草剂基 因，这样的转基因作物可以抵抗普通的、较温 和的除草剂，因此农民用这类除草剂就可以除 去野草，而不 必采用那些毒性较强、较有针对 性的除草剂。 • 其次是转入抗虫害基因，用得最多的是从芽孢 杆菌克隆出来的一种基因，有了这种基因的作 物会制造一种毒性蛋白，对其他生物无毒，但 能杀死某些特定的害虫，这样农民就可以减少 喷洒杀虫剂。据统计，在过去的四年内，美国 由于推广抗虫害转基因作物，少喷洒 了270万 磅的杀虫剂。转基因作物还能增加产品，例如 抗虫害转基因玉米能增 产5－15％。 • 转基因技术也可用于改变食物的营养成分，例 如减少土豆的水分， 这样炸出来的土豆片更脆； 降低植物油中的不饱和脂肪酸，能延长储存期
(一)目的基因的获取
1. 2. 3. 4.
化学合成法
基因组DNA
cDNA 聚合酶链反应
基本概念
• 基因（gene）：P219 • 基因组（genome）：P292 • 基因组学（genomics）： 研究基因组的结构、信息与功能的 科学。 • 基因组计划：HGP——P440 • 后基因组 • 功能基因组