Western blot 试剂与操作步骤
Western_blot_试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（MW121.14，PH7.5）1%NP400.5%TritonX-1000.2%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘油调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.671g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3.10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150μl10%AP 150μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60μl10%AP 60μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western blot实验步骤及注意事项
Western blot实验步骤及注意事项一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
Western blot实验步骤及注意事项
Western blot实验步骤及注意事项实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
整理）WesternBlot操作步骤
整理）WesternBlot操作步骤Western Blot⽬录Western Blot (1)⼀、所需试剂 (2)1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (2)2、电泳液（可回收使⽤2次）:配⽅见三 (2)3、电转液：配⽅见三 (2)4、TBST（4℃避光保存）：配⽅见三 (2)5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存） (2)6、10-180kda 蛋⽩marker（-20℃保存1年，4℃3个⽉） (2)7、转印 (2)8、封闭和孵育（均可⽤5%脱脂⽜奶） (2)9、HRP发光液： (2)10、抗体： (2)11、蛋⽩印迹膜再⽣液 (2)12、其他： (2)⼆、具体步骤 (2)第⼀天： (2)1、灌胶 (2)2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使⽤时加⼊） (3)3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋⽩ (3)第⼆天 (3)1、对蛋⽩样品进⾏定量以及配制上样量（包括marker直接20µl），将⼀抗复温。
(3)2、安装跑胶装置，去除梳⼦，上样，设置参数（根据⽬的蛋⽩⼤⼩确定）： (3)3、电转膜： (3)4、免疫杂交反应 (3)第三天： (3)5、显影（1cm2膜使⽤0.1mlHPR发光液） (3)三、各种配⽅及注意事项 (4)1、不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围： (4)2、不同浓度分离胶配⽅（其他见说明书）： (4)3、浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)配⽅： (5)4、电泳缓冲液配⽅： (5)5、电转缓冲液配⽅ (5)6、TBST配⽅ (5)7、试剂使⽤注意事项： (5)8、发光液的原理： (5)9、再⽣液注意事项 (5)⼀、所需试剂1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（1）30% Acr-Bis (29:1)（4℃避光保存）：Acr丙烯酰胺；Bis亚甲基双丙烯酰胺，两者⼈⼯聚合成聚丙烯酰胺。
（2）1M Tris-HCl, pH8.8（室温保存）：缓冲溶液，Cl-可作为前导界⾯，⽤于配制分离胶（3）10% SDS（室温保存）：⼗⼆烷基硫酸钠，是⼀种阴离⼦去污剂，带有⼤量负电荷，可以使蛋⽩⾮共价键打开，并结合在蛋⽩质分⼦上掩盖蛋⽩间的电荷差异（4）Ammonium persulfate (过硫酸铵AP)（配成10%溶液分装20℃保存）：该系统的引发剂，可以释放硫酸根⾃由基，使丙烯酰胺单体等断裂聚合城聚丙烯酰胺（5）四甲基⼄⼆胺（TEMED）（4℃避光保存）：该系统的加速剂，在光照下裂解成⾃由基，加速聚合。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western步骤
Western-Blot实验主要步骤
1. 细胞种板，次日加药，药物作用后2000rpm,5min收集细胞
2. 每孔100μl加入RIPA缓冲液，（根据每孔的细胞数量可以调整RIPA的量）
3. 冰上孵育约30min, 13,000rpm （约12,000rpm）15min
4. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
5. 进行BCA比色法测定蛋白质浓度
6. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并相应体积的6×电泳加样缓冲液
7.沸水浴中5min
8. 上样
9. 电泳（浓缩胶90v，分离胶110v）
10. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
11. 5%脱脂奶粉封闭1h.
12. 一抗孵育：根据一抗的说明将一抗稀释后，4℃孵育过夜
13.一抗洗涤：TBST洗涤一抗，每次约15min,重复至少三次
14.二抗孵育：根据二抗的说明将二抗稀释后，4℃孵育4h
15.二抗洗涤：TBST洗涤二抗，每次约15min,重复至少三次
16.显色：ECL显色试剂盒显色
17.分析比较记录。
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[主要试剂]
1、SDS-PAGE 试剂：
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O
2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱
脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]
1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：
（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4、免疫反应：
（1）用0.01M PBS 洗膜，5min ×3 次。
（2）加入包被液，平稳摇动，室温2hr。
（3）弃包被液，用0.01M PBS 洗膜，5min×3 次。
（4）加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS 稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12hr 以上。
阴性对照，以1%BSA 取代一抗，其余步骤与实验组相同。
（5）弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS 分别洗膜，5min×4 次。
（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS 稀释），平稳摇动，室温2hr。
（7）弃二抗，用0.01M PBS 洗膜，5min×4 次。
（8）加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
[注意事项]
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。