Westernblot基本操作步骤
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
Westernblot实验操作步骤
Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
3.37度，温箱中孵育30min。
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
Western Blotting 流程详细版
Western Blotting 流程详细版1，收细胞。
从细胞间取出要收样的细胞，可以用两种方式进行处理（处理前准备好碎冰，并配好细胞裂解液，在所需量的细胞裂解液中加入leupeptin和PMSF，两者均为100X）：（1）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸去残液（彻底吸干净）。
直接在板中加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well），冰上静置5min。
再吸入预冷的1.5mlEP管中，准备超声(10cm板的细胞裂解液请分装至2到3个EP管中，方便超声)。
（2）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸净。
再在板中加入PBS（6孔板：500ul/well；6cm板：2ml/well；10cm板：5ml/well），用干净的细胞刮将板中的细胞刮下，转移至1.5mlEP管中（推荐每个EP管500ul左右液体，方便超声）。
2000r，5min，4℃。
如果想尽可能多收细胞，可以在刮过的板里再重复加一次PBS（用量见前述），待之前的管离心之后，再加入，重复离心一次。
离心之后，真空泵或移液枪吸去上清（用200ul tip头，尽可能吸干净）。
加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well）。
准备超声。
2，超声破碎细胞。
EP管置于冰上，每管按如下程序超声：超声时间1~2s/次，间隔5~10s 再重复下一次，总共10~20次。
超声后的样品与未超声样品相比更澄清。
超声效率推荐为20%，持续时间不宜过长，否则容易出现泡沫以及焦化现象。
超声1~2s时，可以将EP管从冰上拿出，以便操作，超声后立即放回冰上。
3，超声后离心，最大转速，30min，4℃。
离心后将上清转入新的干净EP管中（沉淀可以加入10ulSDS loading buffer混匀后，煮沸，跑胶，以验证目的蛋白是否残留于沉淀中，或是只存留于沉淀中）。
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
Western Blot 操作流程
Western 操作流程1.SDS-PAGE电泳，事先调整好蛋白质样品的浓度，保持一致。
2.转膜（电泳结束前20分钟开始准备，而垫片和滤纸至少1小时前浸泡于含SDS的转移缓冲液中）。
（1）. 剪适当大小的PVDF膜，正常大小：5.5cm*8cm。
?（2）. 甲醇10mL浸泡膜5min，然后按1：4体积比向浸泡膜的容器中加水40mL至甲醇终浓度为20％(慢加快摇) 计时2 MIN。
（3）. 将膜转入无SDS转移缓冲液中（至少浸泡15分钟），慢摇。
（4）. 同时将电泳好的胶转移至无SDS的转移缓冲液中，慢摇10min。
（5）. 按湿转芯，黑面-垫片-滤纸-胶-膜-滤纸-垫片-白面的顺序放好，并且每层都要用玻璃棒赶走气泡，装槽时要黑对黑，白对白，加入含SDS转移缓冲液。
（7）. 湿转100V 1h-1.5h，转移槽中放入冰盒，冰水混合物上进行或者磁力搅拌器搅拌4度层析柜进行。
3. 封闭。
转膜结束后，将膜与胶接触的面为正面朝上， TTBS 缓冲液中浸泡片刻或者直接转移至封闭液中（5%脱脂牛奶），封闭1-2h1.5H。
4.一抗孵育。
封闭结束后，将膜在TTBS缓冲液中洗2次，每次2分钟，将膜转移至一抗孵育盒（5% 牛奶+ 一抗）中，4°C过夜孵育或者室温孵育3h。
注意：4°C过夜孵育的一抗可收集起来放于4°C，一周之内应该没问题，但是在重复使用这些一抗时，还得再加入比原来比例低的一抗，例如，原来按1：5000加的一抗，那么这次可在回收的一抗中按1：10000加。
5. 膜在TTBS缓冲液洗3次，每次6min1.二抗孵育。
将膜转移至二抗孵育盒中（5%牛奶+二抗），1-2h1.5H。
7. TTBS洗膜三次，每次6min.8.ECL Plus检测液检测：（Western Blot 超敏发光液A和B按1：1比例混匀）注意：Western Blot 超敏发光液 4°C避光保存。
使用前需恢复至室温，所以要提前从冰箱中取出。
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
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W e s t e r n b l o t基本操作步骤
一、细胞蛋白的提取
弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。
取上清，用BCA法测定蛋白浓度。
用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。
离心，使蛋白沉底。
将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。
二、BCA法测蛋白浓度操作步骤
将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。
完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。
据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。
各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。
测定580nm条件下吸光度。
根据标准曲线计算出蛋白浓度。
三、Western blot基本操作步骤
1、溶液配制：
①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；
②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L；
③TBST缓冲液
1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。
TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L
TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。
④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解）
2、样品准备与加样
①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。
②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子；
③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。
向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。
注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。
防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。
3、电泳
将电泳装置与电源连接。
调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。
拆除电泳装置：先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上）。
4、转膜（湿转）
①将转膜液（1× Transfer Buffer）放于大饭盒内，泡4片海绵，剪4片滤纸、1片PVDF 膜，PVDF膜于甲醇中活化30s，取出置于转膜液中；
②按照2层海绵+2层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；
③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为15V，时间为16~18h（或恒流300mA, 3h）。
显示红灯亮后，按下Start后，开始转膜。
转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色）。
5、免疫印迹反应及化学发光检测
转膜完毕后，根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带，用封闭液（5% BSA）室温封闭2h。
弃封闭液，加入用新的封闭液稀释的一抗（可回收），室温2h或4℃过夜。
用TBST清洗 3 次，10min/次。
二抗（可回收）室温孵育1小时，室温1xTBST 洗涤3次，每次约10 min。
此步开始避光操作：将膜浸入化学发光底物工作液（A液：B液=1:1，终体积0.5-1ml 即可）中，显色2分钟，放入BIO-RAD凝胶成像系统中显影。
内参分子量：β-actin：42 kDa
GAPDH：36 kDa
Tubulin: 51kDa。