Western_Blot操作步骤
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
western-blot步骤
western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。
1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。
2、4℃，1000rpm,5min。
弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。
3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。
（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。
若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。
2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。
稀释液与样品的溶解液相同。
3、待测蛋白做相应的稀释。
（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。
5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。
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Western Blot操作步骤一、 Western blot 实验步骤概述1. 组织取材：组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录二、 Western具体实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2.电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理:在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳:冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE 可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。
为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.转膜(Transfer)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。
硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。
加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(Detection of proteins)参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。
如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8.膜的重复利用(Membrane recovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
三、实验注意事项1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿)，将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4)将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6)转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体(2.5-5毫升)，加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时(或4℃过夜)9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10．将连接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS)加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS)，于室温下摇动。
13. western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
四、关于内参抗体众所周知，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的蛋白上样，才有比较的基础。
特别是在表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。
所以需要内参做对比。
内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，以保证实验结果的准确性。