鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性
鲁西黄牛资料(8.5)
鲁西黄牛典型特征描述（框架样稿）鲁西黄牛是我国著名的“五大名牛”之一，又名山东膘牛，被毛呈黄色或浅黄色者居多，故名鲁西黄牛。
鲁西黄牛是我国著名的肉役兼用地方品种，以肉质好、个体大、役用能力强而著称。
育肥后的山东膘牛曾畅销海外，享有盛誉。
鲁西黄牛2006年被农业部列入第一批国家级畜禽遗传资源保护名录。
鲁西黄牛是我国唯一列入国家高技术研究发展计划（863计划）的肉牛品种，目的在于把鲁西黄牛培育成民族品牌的国际名牛。
一、外在感官特性1.体型外貌鲁西黄牛，体躯结构匀称，细致紧凑，性情温顺，具有肉役兼用体型及外貌特征。
公牛肩峰高而宽厚。
胸深而宽，肉垂明显；中躯背腰平直，肋骨拱圆开张；体躯明显地呈前高后低的前胜体型；肌肉欠丰满。
母牛鬐甲较平，前胸较窄，后躯发育较好。
鲁西黄牛肢势较端正，少数母牛有外向或X 状状肢势。
蹄形有木碗蹄，个别呈现剪刀蹄或低薄蹄。
尾细长，尾毛呈纺锤状。
毛色：据山东省畜牧兽医局1994年调查资料，鲁西黄牛毛色为正黄色占78.2%，棕红色和浅黄色分别占18.49%和3.31%。
“三粉特征”：70%左右牛的眼圈、口轮、腹下及四肢内侧呈粉色，俗称“三粉”。
公牛角形多为扁担角、龙门角，少数为顺风角、倒八字和不正角；母牛角小而不正（铃铛角）者居多，部分为龙门角。
2.体尺体重鲁西黄牛体驱高大，成年公牛体重可达680千克，体高155㎝；成年母牛体重可达420千克，体高135㎝。
在梁山县曾培育出种公牛“金龙”，体重1130千克、体高193㎝；培育出种母牛“玉凤”，体重820千克、体高165㎝。
（插图片）3.生产性能（1）产肉性能：鲁西黄牛产肉性能良好。
皮薄骨细，产肉率较高，肌纤维细，脂肪分布均匀，育肥后呈明显的大理石状花纹，远销香港、日本及东南亚国家。
24月龄育肥牛屠宰率58.1%，净肉率50.7%，骨肉比1︰6.9，脂肉比1︰37，眼肌面积94.2cm2，适用于肉用生产性能。
产肉性能指标接近国外肉牛水平。
《microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究》
《microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究》MicroRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的调控机制研究一、引言随着生物学领域的研究深入，microRNA（miRNA）作为一类内源性的非编码小RNA，其在调控细胞生长、增殖以及分化等方面扮演着重要角色。
在众多miRNA中，miR-128因其对骨骼肌发育的潜在影响而备受关注。
本研究旨在探讨miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制，以期为骨骼肌发育和肌肉生长提供新的理论依据。
二、材料与方法2.1 材料实验所需牛骨骼肌卫星细胞购自ATCC（美国标准生物品收藏中心），并使用相关培养基进行培养。
同时，miR-128的模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）等试剂亦用于本实验。
2.2 方法采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测miR-128的表达水平；通过细胞增殖实验和流式细胞术分析miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响；采用Western blot技术检测相关蛋白的表达水平；并通过双荧光素酶报告实验验证miR-128的靶基因。
三、实验结果3.1 miR-128在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况通过qRT-PCR实验发现，miR-128在牛骨骼肌卫星细胞中呈基础表达水平，并在一定条件下表达量有所变化。
3.2 miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响细胞增殖实验结果显示，过表达miR-128可显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，而抑制miR-128则抑制细胞的增殖。
流式细胞术分析进一步证实了这一结果，过表达miR-128的细胞周期进程加快，而抑制miR-128的细胞周期进程减慢。
3.3 miR-128对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响Western blot结果显示，过表达miR-128可显著促进成肌相关蛋白的表达，如肌球蛋白重链蛋白等。
与此同时，细胞的成肌分化能力也得到了明显提高。
相反，抑制miR-128则导致成肌相关蛋白的表达减少，成肌分化能力降低。
新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性
新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性
新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性
采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的`方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础.
作者：何波郑嵘熊远著胡春艳 HE Bo ZHENG Rong XIONG Yuan-zhu HU Chun-yan 作者单位：华中农业大学,农业部猪遗传育种重点实验室,武汉,430070 刊名：畜牧兽医学报 ISTIC PKU 英文刊名： ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA 年，卷(期)：2006 37(6) 分类号：S828.2 关键词：猪骨骼肌卫星细胞培养鉴定两步消化。
《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》
《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析一、引言随着生物信息学技术的快速发展，转录组学研究已成为揭示生物体基因表达模式和功能的重要手段。
其中，差异转录本是揭示基因表达调控的关键环节。
本论文基于MSTN-/-鲁西黄牛的转录组差异转录本进行生物信息学分析，旨在探讨其基因表达模式和功能，为进一步研究鲁西黄牛的生长发育和肉质特性提供理论基础。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选取MSTN-/-鲁西黄牛作为研究对象，采集其肌肉组织样本进行转录组测序。
2.2 实验方法2.2.1 转录组测序利用RNA-Seq技术对MSTN-/-鲁西黄牛的肌肉组织进行转录组测序，获取差异转录本数据。
2.2.2 生物信息学分析对测序数据进行质量控制、序列组装、基因注释等预处理，然后进行差异基因表达分析、基因功能富集分析、蛋白质互作网络分析等生物信息学分析。
三、结果与分析3.1 差异转录本鉴定通过转录组测序，共鉴定出MSTN-/-鲁西黄牛肌肉组织中差异表达的转录本。
其中，表达上调的转录本主要涉及肌肉生长、代谢等相关基因，表达下调的转录本则主要涉及骨骼发育、免疫应答等相关基因。
3.2 基因表达模式分析通过差异基因表达分析，我们发现MSTN-/-鲁西黄牛肌肉组织中差异表达的基因主要富集在肌肉生长、代谢、骨骼发育、免疫应答等相关通路。
进一步分析表明，这些差异基因的表达模式与鲁西黄牛的生长发育和肉质特性密切相关。
3.3 蛋白质互作网络分析通过蛋白质互作网络分析，我们发现差异表达的基因编码的蛋白质之间存在复杂的互作关系。
这些互作关系可能与鲁西黄牛的肌肉生长、代谢、骨骼发育等生理过程密切相关。
进一步的分析有助于揭示这些互作关系在鲁西黄牛生理过程中的作用。
四、讨论本研究通过生物信息学分析，揭示了MSTN-/-鲁西黄牛肌肉组织中差异表达的转录本及其基因表达模式和功能。
这些差异表达的基因主要涉及肌肉生长、代谢、骨骼发育、免疫应答等相关通路，可能与鲁西黄牛的生长发育和肉质特性密切相关。
肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立
动物营养学报２０２０，３２（５）：２３６９⁃２３７８ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０２０．０５．０４６肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立谭秀文㊀游㊀伟∗㊀刘晓牧㊀靳㊀青㊀魏㊀晨㊀万发春㊀张相伦∗∗（山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东省肉牛生产性能测定中心，山东省畜禽健康养殖工程技术中心，济南２５０１００）摘㊀要：本研究采用组织块法分离培养获得肉牛肌肉细胞并进行鉴定，利用过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）构建氧化应激模型，为深入研究氧化应激对肉牛肌肉生长发育和肉品质的影响机制提供技术支撑㊂选用体重为２５２ｋｇ的利鲁（利木赞ˑ鲁西黄牛）杂交公牛背最长肌，利用组织块培养法分离培养肌肉细胞㊂通过形态学观察㊁免疫荧光法及流式细胞仪等手段对细胞进行鉴定㊂采用不同浓度（０㊁５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０㊁３００㊁３５０㊁４００㊁４５０μｍｏｌ／Ｌ）的Ｈ２Ｏ２处理细胞２４ｈ，通过观察细胞形态㊁检测细胞存活率及氧化还原状态，筛选适宜作用浓度㊂然后利用该浓度Ｈ２Ｏ２处理细胞不同时间（０㊁０．７５㊁１．５㊁３㊁６㊁１２㊁２４ｈ），通过分析确定适宜作用时间㊂结果表明：１）分离获得的细胞长势良好，形状细长，呈纺锤体形和梭形㊂免疫荧光法和流式细胞仪鉴定肌肉细胞的特异性蛋白（生肌决定因子１和配对盒基因７）均得到较高表达㊂２）视野内细胞数量随Ｈ２Ｏ２浓度升高逐渐减少，至４５０μｍｏｌ／Ｌ时，细胞发生明显死亡现象㊂细胞存活率随Ｈ２Ｏ２浓度的升高显著降低，与０浓度Ｈ２０２处理相比，３００μｍｏｌ／Ｌ时降至６５．４％（Ｐ＜０．０５），４５０μｍｏｌ／Ｌ时仅为６．７％（Ｐ＜０．０５）㊂细胞活性氧（ＲＯＳ）水平先略微降低后逐渐升高（Ｐ＜０．０５），超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性先升高后逐渐降低（Ｐ＜０．０５），丙二醛（ＭＤＡ）和蛋白质羰基（ＰＣ）含量逐渐升高（Ｐ＜０．０５），８－羟基脱氧鸟苷（８⁃ＯＨｄＧ）含量先升高后降低（Ｐ＜０．０５）㊂３）细胞存活率随３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２处理时间的延长逐渐降低，与０ｈ相比，６ｈ降至６１．２％（Ｐ＜０．０５），１２ｈ降至４７．４％（Ｐ＜０．０５），但在２４ｈ时略有升高（Ｐ＜０．０５）㊂随着处理时间的延长，细胞ＲＯＳ水平先升高后逐渐降低（Ｐ＜０．０５），ＳＯＤ和ＣＡＴ活性先升高后降低（Ｐ＜０．０５），ＭＤＡ㊁ＰＣ和８⁃ＯＨｄＧ含量均逐渐升高（Ｐ＜０．０５）㊂综上所述，本研究通过组织块培养法分离培养获得较高纯度的肉牛肌肉细胞，并成功构建氧化应激模型，Ｈ２Ｏ２的适宜作用浓度和时间分别为３００μｍｏｌ／Ｌ和６ｈ㊂关键词：肉牛；肌肉细胞；细胞培养；细胞鉴定；过氧化氢；氧化应激模型中图分类号：Ｓ８１１；Ｓ８２３㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０２０）０５⁃２３６９⁃１０收稿日期：２０１９－１０－２９基金项目：山东省自然科学基金项目（ＺＲ２０１７ＢＣ０４３）；现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ⁃３７）；山东省农业科学院农业科技创新工程（ＣＸＧＣ２０１７Ｂ０２）；山东省农业科学院畜牧兽医研究所资助项目作者简介：谭秀文（１９７９ ），女，山东潍坊人，副研究员，博士，从事动物繁殖与胚胎工程研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌａｆｔａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ∗同等贡献作者∗∗通信作者：张相伦，助理研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｎｇｌｕｎｚｈａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀生产高品质的牛肉产品符合人们日益提高的消费需求，但在我国现有养殖条件下，肉牛易因管理㊁环境㊁运输等不可控因素造成应激反应㊂应激往往引起机体自由基水平升高，氧化还原状态失衡，影响肌肉组织中能量代谢，脂肪和蛋白质等发生氧化修饰，导致肌肉酸度升高㊁风味变差㊁肉色暗沉㊁持水力下降等，造成品质降低，影响经济效益［１－２］㊂目前，国内外很多学者围绕提高动物抗应㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷激能力㊁改善肌肉品质等开发相关产品，并在生产中开展应用研究㊂但是，由于动物机体内新陈代谢过程复杂，难以准确阐明作用机理，导致部分产品研发存在盲目性，限制了其推广利用㊂与体内试验相比，开展体外细胞试验具有研究对象更直接㊁省时㊁成本低㊁可重复性强等诸多优点㊂随着细胞培养技术的快速发展，以离体细胞为对象开展的营养调控㊁疾病控制的机理研究越来越多，在鼠［３］㊁奶牛［４］㊁猪［５］㊁家禽［６］等动物上均有报道㊂在肉牛方面，本课题组前期成功分离获得皮下和肌间脂肪细胞，并围绕其开展肉牛脂肪沉积规律及营养调控机制研究［７－８］㊂但是，目前国内外在肉牛肌肉细胞上的研究还鲜见报道，有待进一步研究㊂细胞氧化应激模型是一种重要的细胞模型，广泛应用于氧化损伤机制㊁抗氧化药物的筛选评价㊁疾病预防控制等研究中［９］㊂构建细胞氧化应激模型的手段主要包括辐射㊁紫外照射㊁过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）处理以及（次）黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶法等，其中Ｈ２Ｏ２处理法因具有造模效果理想㊁稳定性高㊁可操作性强等优点而广泛应用于模型建立中㊂目前，在肠上皮细胞系［１０］㊁鼠原代心肌细胞［１１］㊁奶牛乳腺上皮细胞［１２］等多种类型细胞上已成功构建氧化应激模型，而在肉牛肌肉细胞上的研究还比较滞后㊂鉴于牛肉品质的关注度日益提高，构建肉牛肌肉细胞氧化应激模型对于深入开展肌肉方面的机理研究具有重要意义㊂基于此，本研究通过采集肉牛背最长肌，利用组织块法分离培养肌肉细胞，并对细胞进行鉴定，建立肉牛原代肌肉细胞株；然后，利用Ｈ２Ｏ２构建肉牛肌肉细胞氧化应激模型，以期为牛肉品质的调控㊁性状的形成㊁相关功能性产品的开发提供理论基础和技术支撑㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验动物㊀㊀在山东省肉牛生产性能测定中心挑选１头体重为２５２ｋｇ的健康利鲁杂交公牛（利木赞ˑ鲁西黄牛）进行屠宰，采集背最长肌，用无菌生理盐水冲洗２ ３遍后，迅速放入装有１％青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）的无菌样品瓶中，冰浴保存，１ｈ内带回实验室，准备培养肌肉细胞㊂试验经山东省农业科学院动物保护和使用委员会的许可（ＩＡＣＵＣ２００６０１０１）进行，并符合相关试验动物福利的规则和制度㊂１．２㊀主要试剂㊀㊀ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清（ＦＢＳ）购自ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司；０．２５％胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）㊁血清白蛋白（ＢＳＡ）㊁３％Ｈ２Ｏ２溶液购自Ｓｉｇｍａ公司；青链霉素混合液㊁４ᶄ，６－二脒基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ）溶液，超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）㊁过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性检测试剂盒，丙二醛（ＭＤＡ）和蛋白质羰基（ＰＣ）含量检测试剂盒，二喹啉甲酸（ＢＣＡ）蛋白含量测定试剂盒购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００购自Ａｌｌａ⁃ｄｉｎ公司；生肌决定因子１（ＭｙｏＤ１）抗体（ｂｓ⁃２４４２Ｒ）㊁配对盒基因７（ＰＡＸ７）抗体（ｂｓ⁃２４１３Ｒ）购自博奥森公司；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗兔（Ｈ＋Ｌ）免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８驴抗兔（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧ购自Ａｂｃａｍ公司；八肽胆囊收缩素（ＣＣＫ⁃８）检测试剂盒购于ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ公司；活性氧自由基（ＲＯＳ）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；８－羟基脱氧鸟苷（８⁃ＯＨｄＧ）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所㊂１．３㊀试验方法１．３．１㊀细胞的分离培养与鉴定㊀㊀参考卢靖坤［１３］的方法，利用组织块贴壁法进行肌肉细胞的分离培养㊂在无菌超净台中，将背最长肌肌肉组织从样品瓶中取出置于无菌培养皿中，仔细剔除筋膜及多余脂肪组织，用ＰＢＳ冲洗３ ５遍，之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状㊂用无菌吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁，然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液，将培养瓶平放入培养箱中，３０ ４０ｍｉｎ后待乳糜贴于培养瓶上后，缓慢翻转培养瓶，让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织，然后将培养瓶重新放回培养箱继续培养３８ ４８ｈ后细胞开始贴壁生长，每天观察细胞生长情况，５ ６ｄ后有８０％ ９０％细胞贴壁，采用光学显微镜（ＴＳ１００，Ｎｉｋｏｎ）观察并记录细胞形态，之后收集细胞冻存备用㊂㊀㊀参考Ｈｉｎｄｉ等［１４］的方法，利用免疫荧光法对获得的细胞进行鉴定㊂将细胞按１ˑ１０６个／ｍＬ接种于６孔板中，置于细胞培养箱中３７ħ培养，当细胞融合至７０％以上时弃去培养液，采用４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗细胞３次㊂ＰＢＳ洗涤后，用含有０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００的ＰＢＳ进行细胞的０７３２５期谭秀文等：肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立透化处理，置于冰上透化１０ｍｉｎ㊂透化处理后再用ＰＢＳ冲洗细胞３次，用含有３％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭处理３０ｍｉｎ，弃去后不洗，加入一抗（ＭｙｏＤ１或ＰＡＸ７），４ħ过夜后用ＰＢＳ洗涤３次，然后加入二抗，３７ħ恒温孵育１ｈ，ＰＢＳ洗３次后，最后加入ＤＡＰＩ染核１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次后，采用荧光显微镜（ＤｍｉｌＬＥＤ，ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）观察㊂㊀㊀参考Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等［１５］方法，采用流式细胞仪（Ｃ６，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）对细胞阳性率进行检测㊂将细胞解冻后置于３７ħ培养箱中培养，培养传代至Ｔ２５细胞瓶中，当细胞数长至约１ˑ１０６个／ｍＬ后用胰蛋白酶消化后离心弃去上清，用ＰＢＳ冲洗，后加入流式固定液固定３０ｍｉｎ，离心后弃上清㊂用含有５％ＢＳＡ的０．１％ＰＢＳ⁃ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００透化１０ｍｉｎ后弃上清㊂然后加入一抗（ＭｙｏＤ１或ＰＡＸ７）或对照ＩｇＧ吹打均匀，室温下孵育６０ｍｉｎ后更换为二抗孵育３０ｍｉｎ㊂离心后弃去上清，将细胞重悬于２００ ５００μＬＰＢＳ中，利用流式细胞仪检测阳性率㊂１．３．２㊀细胞氧化应激模型的建立㊀㊀参考Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ等［１６］㊁金鹿［１２］的方法构建细胞氧化应激模型，确定Ｈ２Ｏ２适宜作用浓度和作用时间㊂根据不同检测指标要求，将细胞按５ˑ１０４个／ｍＬ接种于９６孔板或Ｔ２５细胞瓶中，置于３７ħ培养箱中培养２４ｈ，然后去掉原有培养液，更换为现配制的分别含０㊁５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０㊁３００㊁３５０㊁４００㊁４５０μｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２培养液处理２４ｈ，之后分别用光学显微镜观察细胞形态㊁测定细胞存活率㊁氧化还原状态相关指标㊂根据检测结果，筛选确定适宜的Ｈ２Ｏ２浓度㊂最后，采用该浓度Ｈ２Ｏ２分别处理细胞０．７５㊁１．５㊁３㊁６㊁１２㊁２４ｈ，检测细胞存活率㊁氧化还原状态等指标，确定适宜作用时间㊂１．３．２．１㊀细胞存活率检测㊀㊀将经Ｈ２Ｏ２处理的细胞更换为基础培养液，在每孔中各加入１０μＬ的ＣＣＫ⁃８溶液，将培养板置于３７ħ培养箱内孵育１ ４ｈ，用酶标仪测定４５０ｎｍ处的吸光度，每个处理浓度和时间均设６个重复，测定细胞存活率㊂１．３．２．２㊀氧化还原状态检测㊀㊀根据ＲＯＳ检测说明书步骤，将处理的细胞进行消化，ＰＢＳ洗涤２次，加入１ｍＬ２ᶄ，７ᶄ－二氯二氢荧光素二乙酸酯（ＤＣＦＨ⁃ＤＡ）染液重悬细胞，３７ħ避光孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗２次，利用流式细胞仪检测荧光强度，计算ＲＯＳ水平㊂将处理后的细胞用０．２５％胰蛋白酶进行消化，ＰＢＳ洗涤２次，离心弃上清，重悬于５００μＬＰＢＳ中，利用超声波细胞破碎仪（ＩＩＤ，Ｓｃｉｅｎｔｚ），在冰浴条件下破碎细胞，离心收集细胞裂解液保存于－８０ħ条件下待测㊂严格按照试剂盒说明书进行指标测定，利用黄嘌呤氧化酶法测定ＳＯＤ活性，用Ｈ２Ｏ２分解法测定ＣＡＴ活性；采用硫代巴比妥酸法测定ＭＤＡ含量，ＰＣ含量测定采用２，４－二硝基苯肼法测定，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法测定８⁃ＯＨｄＧ含量；利用ＢＣＡ检测试剂盒测定各样本蛋白含量㊂每个处理浓度和时间均设３个重复㊂１．４㊀数据分析㊀㊀数据经Ｅｘｃｅｌ２０１６初步整理后，采用ＳＰＳＳ２０．０软件中的单因素方差分析（ｏｎｅ⁃ｗａｙＡＮＯＶＡ）进行统计分析，多重比较采用Ｔｕｋｅｙ法进行，结果以平均值和平均值标准误（ＳＥＭ）表示，Ｐ＜０．０５为差异显著㊂２㊀结㊀果２．１㊀细胞的体外培养、形态观察及鉴定㊀㊀分离获得的细胞长势较快，形状细长，呈纺锤体形和梭形，整体较一致，当细胞密度较高时，具有明显的方向性（图１）㊂利用免疫荧光方法，采用肌肉细胞特异性表达蛋白（ＭｙｏＤ１和ＰＡＸ７）对分离的细胞进行鉴定㊂结果表明，ＭｙｏＤ１和ＰＡＸ７蛋白几乎在所有细胞中均得到阳性表达（图２），说明分离得到的细胞为肌卫星细胞，且具有较高纯度㊂利用流式细胞仪对ＭｙｏＤ１和ＰＡＸ７阳性率进行检测（图３），发现二者的阳性率均为９３％以上，进一步说明细胞的纯度较高㊂图１㊀肉牛肌肉细胞的形态学观察Ｆｉｇ．１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｂｅｅｆｃａｔｔｌｅｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（Ａ：１００ˑ，Ｂ：２００ˑ）１７３２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷㊀㊀Ａ：生肌决定因子１ＭｙｏＤ１；Ｂ：配对盒基因７ＰＡＸ７㊂图２㊀肉牛肌肉细胞的免疫荧光鉴定Ｆｉｇ．２㊀Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｅｅｆｃａｔｔｌｅｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（１００ˑ）㊀㊀Ａ：对照ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ：生肌决定因子１ＭｙｏＤ１；Ｃ：配对盒基因７ＰＡＸ７；ＦＩＴＣ⁃Ａ：异硫氰酸荧光素－Ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａ⁃ｎａｔｅ⁃Ａ㊂图３㊀流式细胞仪检测细胞ＭｙｏＤ１和ＰＡＸ７阳性率Ｆｉｇ．３㊀ＰｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＭｙｏＤ１ａｎｄＰＡＸ７ｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２．２㊀不同浓度Ｈ２Ｏ２对肌肉细胞形态、存活率及氧化还原状态的影响㊀㊀由图４可见，随着Ｈ２Ｏ２浓度由０提高至４５０μｍｏｌ／Ｌ，处理２４ｈ以后，视野内细胞形态逐渐发生变化，细胞缩小，数量减少，到４５０μｍｏｌ／Ｌ时细胞从壁上脱落，发生明显死亡现象㊂由图５可见，随着Ｈ２Ｏ２浓度的升高，存活率持续降低，与０浓度Ｈ２Ｏ２处理相比，当浓度提升至３００μｍｏｌ／Ｌ时，存活率降为６５．４％（Ｐ＜０．０５），浓度为４５０μｍｏｌ／Ｌ时，仅剩６．７％（Ｐ＜０．０５）㊂如表１所示，随着Ｈ２Ｏ２浓度的升高，ＲＯＳ水平先略微降低后显著升高（Ｐ＜０．０５），当Ｈ２Ｏ２浓度超过３００μｍｏｌ／Ｌ时显著高于浓度为０时（Ｐ＜０．０５），浓度升至４５０μｍｏｌ／Ｌ时，ＲＯＳ水平较浓度为０时提升近４倍（Ｐ＜０．０５）㊂抗氧化酶活性结果表明，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性均随Ｈ２Ｏ２浓度升高，呈先升高后降低的变化趋势㊂其中ＳＯＤ活性在Ｈ２Ｏ２浓度为３００μｍｏｌ／Ｌ后显著低于浓度为０时（Ｐ＜０．０５），ＣＡＴ活性在Ｈ２Ｏ２浓度为４５０μｍｏｌ／Ｌ时显著低于浓度为０时（Ｐ＜０．０５）㊂ＭＤＡ和ＰＣ含量均随Ｈ２Ｏ２浓度升高逐渐升高，ＭＤＡ含量在Ｈ２Ｏ２浓度为２５０μｍｏｌ／Ｌ后显著高于浓度为０时（Ｐ＜０．０５），ＰＣ含量在Ｈ２Ｏ２浓度为３００μｍｏｌ／Ｌ后显著高于浓度为０时（Ｐ＜０．０５）㊂随着Ｈ２Ｏ２浓度的升高，８⁃ＯＨｄＧ含量呈先升高后降低的趋势，在Ｈ２Ｏ２浓度为２００μｍｏｌ／Ｌ后显著高于浓度为０时（Ｐ＜０．０５），浓度超过３５０μｍｏｌ／Ｌ后与浓度为０时无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂２７３２５期谭秀文等：肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立图４㊀不同浓度Ｈ２Ｏ２对肌肉细胞形态的影响Ｆｉｇ．４㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＨ２Ｏ２ｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（１００ˑ）㊀㊀数据柱形标注不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂图６同㊂㊀㊀Ｖａｌｕｅｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．６．图５㊀不同浓度Ｈ２Ｏ２对肌肉细胞存活率的影响Ｆｉｇ．５㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＨ２Ｏ２ｏｎｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ２．３㊀Ｈ２Ｏ２不同处理时间对肌肉细胞存活率及氧化还原状态的影响㊀㊀综合上述结果，选用以３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２为适宜浓度，进一步对肌肉细胞处理０．７５㊁１．５㊁３㊁６㊁１２㊁２４ｈ，筛选适宜作用时间㊂由图６可见，随着Ｈ２Ｏ２作用时间的延长，细胞存活率显著降低，与０ｈ时相比，至６ｈ时降至６１．２％（Ｐ＜０．０５），至１２ｈ时，存活率最低，为４７．４％（Ｐ＜０．０５），但当作用时间继续延长至２４ｈ时，存活率开始升高，但仍显著低于０ｈ时（Ｐ＜０．０５）㊂由表２可知，与０ｈ时相比，Ｈ２Ｏ２处理０．７５ｈ后ＲＯＳ水平显著升高约１８倍（Ｐ＜０．０５），随后缓慢下降，当超过６ｈ后，降至与０ｈ时无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂抗氧化酶方面，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性均呈先升高后降低的变化趋势㊂其中，ＳＯＤ活性在０．７５ ６ｈ显著升高（Ｐ＜０．０５），１２ｈ后与０ｈ时无显著差异（Ｐ＞０．０５）；ＣＡＴ活性在０．７５ １２ｈ显著升高（Ｐ＜０．０５），２４ｈ时与０ｈ时无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂氧化产物方面，ＭＤＡ含量在加入Ｈ２Ｏ２１．５ｈ后开始显著升高（Ｐ＜０．０５），２４ｈ时最高；ＰＣ含量在加入Ｈ２Ｏ２０．７５ｈ后显著升高（Ｐ＜０．０５），６ｈ时最高；８⁃ＯＨｄＧ含量在６ｈ后显著升高（Ｐ＜０．０５），２４ｈ时达最高㊂３㊀讨㊀论３．１㊀细胞分离培养与鉴定㊀㊀肌肉细胞是开展肌肉性状形成㊁品质调控及疾病控制等机理研究的重要素材㊂本试验选用体重为２５０ｋｇ左右㊁处于快速生长期的青年公牛，采集背最长肌，利用组织块培养法进行肌肉细胞的分离培养㊂形态学观察结果表明，分离获得的细３７３２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷胞长势速度快，光镜下观察细胞呈纺锤体形㊁梭形，符合肌肉细胞的一般形态［１７］㊂当生长密度培养至较高时，细胞具有明显的按方向排列生长和融合的倾向，这与肌肉卫星细胞的功能特性相一致［１８］㊂随后，选用ＭｙｏＤ１和ＰＡＸ７这２个肌肉细胞的特异性蛋白对细胞进行鉴定㊂其中，ＭｙｏＤ１参与肌细胞的定型，其表达说明细胞处于活化状态，是肌肉细胞增殖的标记蛋白［１９］，ＰＡＸ７是肌卫星细胞生长和增殖的重要基因，是卫星细胞特异表达的蛋白［２０］㊂本研究采用免疫荧光方法检测ＭｙｏＤ１㊁ＰＡＸ７蛋白的表达，发现几乎所有细胞均明显表达上述２种蛋白；用流式细胞仪检测阳性率，发现二者表达阳性率均在９３％以上，进一步说明本研究分离获得的细胞为肌卫星细胞，且具有较高纯度［１４－１５］㊂表１㊀不同浓度Ｈ２Ｏ２处理２４ｈ对肌肉细胞氧化还原状态的影响Ｔａｂｌｅ１㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＨ２Ｏ２ｏｎｒｅｄｏｘｓｔａｔｕｓｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｆｏｒ２４ｈ项目ＩｔｅｍｓＨ２Ｏ２浓度Ｈ２Ｏ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ／（μｍｏｌ／Ｌ）０５０１００１５０２００２５０３００３５０４００４５０ＳＥＭＰ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ活性氧ＲＯＳ／％１００．００ｅｆ８７．０９ｇ９９．０２ｅｆｇ９０．２７ｆｇ１１１．５２ｄｅ１１０．８６ｄｅ１２０．２３ｄ１４３．５６ｃ２０３．６９ｂ３９７．３９ａ１６．６９＜０．００１超氧化物歧化酶ＳＯＤ／（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）６．８９ａｂｃ６．６２ａｂｃｄ７．１４ａｂｃ７．３１ａｂ８．６２ａ７．９０ａ４．５４ｄｅ５．１３ｂｃｄ４．９８ｃｄｅ２．８０ｅ０．３３＜０．００１过氧化氢酶ＣＡＴ／（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）１．５７ｂｃ２．６４ａ２．５７ａ２．１７ａｂ１．７０ａｂｃ１．５６ｂｃ１．１２ｃｄ１．４０ｂｃｄ１．１０ｃｄ０．６０ｄ０．１３＜０．００１丙二醛ＭＤＡ／（ｎｍｏｌ／ｍｇｐｒｏｔ）０．６７ｄｅ０．６３ｄｅ０．５８ｅ０．５７ｅ０．８２ｄ１．０４ｃ１．４４ｂ１．７１ａ１．７７ａ１．７６ａ０．０９＜０．００１蛋白质羰基ＰＣ／（ｎｍｏｌ／ｍｇｐｒｏｔ）１．５０ｂ１．５７ｂ１．５１ｂ１．５３ｂ１．５３ｂ１．７１ｂ２．４２ａ２．３２ａ２．２２ａ２．２６ａ０．０８＜０．００１８－羟基脱氧鸟苷８⁃ＯＨｄＧ／（ｎｇ／ｍｇｐｒｏｔ）０．８７ｄ１．０２ｄ１．３１ｃｄ１．１６ｄ１．６１ｂｃ１．９８ａｂ２．１０ａ１．１２ｄ１．０４ｄ１．０８ｄ０．０８＜０．００１㊀㊀同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５），不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂下表同㊂㊀㊀Ｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗ，ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｎｏｌｅｔｔｅｒｏｒｔｈｅｓａｍｅｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．图６㊀Ｈ２Ｏ２不同处理时间对肌肉细胞存活率的影响Ｆｉｇ．６㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅｏｆＨ２Ｏ２ｏｎｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ３．２㊀肌肉细胞氧化应激模型的建立㊀㊀采用Ｈ２Ｏ２处理是建立细胞氧化应激模型普遍采用的一种方式，作为活性氧的一种，Ｈ２Ｏ２具有稳定性高㊁造模效果理想等诸多优点［１０］㊂同时，在畜禽正常生理过程中即有Ｈ２Ｏ２产生，且在应激条件下水平更高［２１］㊂因此，本研究选用Ｈ２Ｏ２构建氧化应激模型不仅稳定，更具现实意义㊂细胞氧化应激模型的建立关键在于确定Ｈ２Ｏ２的适宜作用浓度和时间，剂量过小或作用时间不足时不易产生显著性差异，剂量过大或作用时间较长则会导致细胞大量死亡，无法满足试验需求或对细胞状态做出准确评价［２２］㊂４７３２５期谭秀文等：肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立表２㊀３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２不同处理时间对肌肉细胞氧化还原状态的影响Ｔａｂｌｅ２㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅｏｆ３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２ｏｎｒｅｄｏｘｓｔａｔｕｓｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ项目Ｉｔｅｍｓ３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２作用时间３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅ／ｈ００．７５１．５３６１２２４ＳＥＭＰ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ活性氧ＲＯＳ／％１００．００ｄ１８８０．６０ａ１５３２．５０ｂ３２９．３８ｃ２１３．２３ｃｄ１３８．９７ｄ１２３．８９ｄ１５６．６４０．００３超氧化物歧化酶ＳＯＤ／（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）４．９２ｃ６．１６ｂ７．２６ａ６．５２ａｂ６．３０ｂ５．２４ｃ４．６６ｃ０．２２＜０．００１过氧化氢酶ＣＡＴ／（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）１．５９ｃ５．８７ａ４．８７ａｂ４．７２ｂ４．７２ｂ３．９６ｂ２．２７ｃ０．３４＜０．００１丙二醛ＭＤＡ／（ｎｍｏｌ／ｍｇｐｒｏｔ）０．４７ｄ０．６０ｄ０．７８ｃ１．０４ｂ１．０５ｂ１．０３ｂ１．３４ａ０．０６＜０．００１蛋白质羰基ＰＣ／（ｎｍｏｌ／ｍｇｐｒｏｔ）１．５７ｃ２．５１ｂ２．６６ａｂ２．４９ｂ２．９４ａ２．５４ｂ２．４８ｂ０．１０＜０．００１８－羟基脱氧鸟苷８⁃ＯＨｄＧ／（ｎｇ／ｍｇｐｒｏｔ）０．９２ｃ０．９３ｃ１．０５ｃ１．２２ｂｃ１．６５ａｂ１．７１ａｂ１．９７ａ０．１００．００２３．２．１㊀不同浓度Ｈ２Ｏ２对肌肉细胞氧化损伤的影响㊀㊀本研究表明，视野内的细胞数量随Ｈ２Ｏ２浓度的升高逐渐减少，直至从壁上脱落，表明Ｈ２Ｏ２对细胞具有损伤作用且可致细胞死亡㊂细胞存活率数据表明，Ｈ２Ｏ２浓度升至３００μｍｏｌ／Ｌ时存活率降至６０％左右，到４５０μｍｏｌ／Ｌ时仅剩６．７％㊂Ｃａｉ等［２３］研究表明，ＩＰＥＣ⁃Ｊ２细胞的存活率随Ｈ２Ｏ２浓度升高显著降低，当浓度超过２０００μｍｏｌ／Ｌ时出现细胞死亡现象，选择１０００μｍｏｌ／Ｌ（存活率为７０％左右）为最佳造模浓度㊂Ｊｉｎ等［２４］报道，奶牛乳腺上皮细胞存活率随Ｈ２Ｏ２浓度的升高显著降低，ＲＯＳ水平最高升至３倍左右，到５００μｍｏｌ／Ｌ时存活率降至６６％，１０００μｍｏｌ／Ｌ时降至３０％，并选择以５００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２组为氧化应激模型组㊂戴青里等［２５］研究发现，随着Ｈ２Ｏ２浓度由１００升至１０００μｍｏｌ／Ｌ，人脐静脉内皮细胞形态缩小㊁间隙增大，存活率显著降至３０％左右，推荐８００μｍｏｌ／Ｌ（存活率为６５％左右）为适宜浓度㊂据报道，细胞氧化应激模型的适宜Ｈ２Ｏ２浓度在１００ ２０００μｍｏｌ／Ｌ［２２］，尽管不同类型的细胞对Ｈ２Ｏ２的反应敏感程度不一致，但多数研究均以细胞存活率在６０％ ７０％之间为参考推荐适宜作用浓度，因此初步判断本研究以３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２为宜㊂㊀㊀为了进一步确定Ｈ２Ｏ２适宜浓度，对细胞的氧化还原状态进行了系统评价㊂Ｈ２Ｏ２是ＲＯＳ的一种，极易透过细胞膜，引起ＲＯＳ水平升高，同时Ｈ２Ｏ２在体内亚铁离子环境下可通过Ｆｅｎｔｏｎ反应生成更高活性的羟自由基（㊃ＯＨ），从而对细胞造成更加剧烈的氧化损伤［１０］㊂本研究发现，当Ｈ２Ｏ２的浓度较低时，细胞的ＲＯＳ水平略微降低，随后逐渐升高，当Ｈ２Ｏ２浓度超过３００μｍｏｌ／Ｌ时显著提高，最高升至对照组的近４倍㊂维持氧化还原状态平衡是细胞发挥生理功能的基础，细胞在正常代谢过程中即产生自由基，如线粒体的呼吸作用等㊂但当受外界刺激时，自由基水平急剧升高，抗氧化系统即启动㊂抗氧化系统包括酶系统和非酶系统，其中抗氧化酶系统是机体对抗自由基介导的氧化损伤的重要防御系统㊂ＳＯＤ和ＣＡＴ是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化酶，且二者存在协同关系㊂ＳＯＤ可催化超氧阴离子自由基歧化生成Ｈ２Ｏ２［２３］，ＣＡＴ又可将Ｈ２Ｏ２分解成水与氧气［２６］，从而协同降低ＲＯＳ水平㊂抗氧化酶活性分析结果发现，当Ｈ２Ｏ２浓度较低时，ＳＯＤ和ＣＡＴ的活性显著升高，说明ＲＯＳ激活了细胞的抗氧化系统，抗氧化酶有效清除了ＲＯＳ，从而略微降低了ＲＯＳ的总体水平㊂但是，随着Ｈ２Ｏ２浓度的继续升高，ＲＯＳ水平居高不下，过量的ＲＯＳ超出抗氧化系统的清除能力，抗氧化酶活性开始降低［６］㊂本研究发现，ＳＯＤ活性在Ｈ２Ｏ２浓度大于２５０μｍｏｌ／Ｌ后显著降低，ＣＡＴ活性在４５０μｍｏｌ／Ｌ后显著降低，抗氧化系统的破坏导致氧化还原状态失衡，引起氧化损伤㊂ＭＤＡ是脂质过氧化反应５７３２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷的终产物，ＰＣ是蛋白质发生氧化的标志物，８⁃ＯＨｄＧ常用于反映核酸的氧化程度，３种产物共同反映细胞的氧化损伤程度［２７］㊂本研究中，ＭＤＡ㊁ＰＣ和８⁃ＯＨｄＧ含量均在Ｈ２Ｏ２浓度超过一定量后显著升高，这与已有报道结果［２８－３０］一致，说明细胞的氧化还原状态平衡被打破后，转而快速向氧化损伤方向发展，细胞的功能性物质如脂质㊁蛋白质和核酸等均会被ＲＯＳ攻击，最终引起细胞功能紊乱和死亡，这也与８⁃ＯＨｄＧ含量在高浓度Ｈ２Ｏ２时降低相一致㊂通过评价细胞氧化应激模型的各项判断指标，确定以３００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２为适宜造模浓度㊂３．２．２㊀Ｈ２Ｏ２不同处理时间对肌肉细胞氧化损伤的影响㊀㊀细胞氧化应激模型中，Ｈ２Ｏ２的处理时间同样也是一个重要的参数㊂Ｙｏｕｎｇ等［３１］在Ｃａｃｏ⁃２细胞系上构建的氧化应激模型为１０００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２处理６ｈ㊂Ｑｕｉｎｃｏｚｅｓ⁃Ｓａｎｔｏｓ等［３２］选用以１０００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２处理０．５ｈ来构建的Ｃ６星形细胞系的氧化应激模型㊂金晓露［３３］通过比较Ｈ２Ｏ２不同作用时间对奶牛乳腺上皮细胞的存活率㊁自由基水平和抗氧化能力，推荐以５００μｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２处理２４ｈ为氧化应激模型㊂大量研究报道，在Ｈ２Ｏ２造模中，处理时间的跨度较大（０．５ ２４ｈ），这可能与细胞类型和研究目的不同有关（如急性损伤㊁慢性损伤等）［２２］㊂在本研究中，细胞存活率随着Ｈ２Ｏ２作用时间的延长逐渐降低，６ｈ时降至６０％左右，与上述报道一致㊂但当Ｈ２Ｏ２作用时间延长至２４ｈ时，存活率反而开始升高，推测细胞虽然受到氧化损伤，但并未全部凋亡，随着Ｈ２Ｏ２逐渐被消耗或分解，细胞增殖数量开始提高［１２］㊂氧化还原状态分析表明，Ｈ２Ｏ２作用短时间内，ＲＯＳ水平大幅度提高，激活了细胞的抗氧化系统［３４］，表现为ＳＯＤ和ＣＡＴ活性的升高㊂但当Ｈ２Ｏ２作用时间继续延长，破坏了细胞的抗氧化系统，导致抗氧化酶活性降低，氧化程度开始加剧，这也与检测到的各种氧化产物（ＭＤＡ㊁ＰＣ和８⁃ＯＨｄＧ）含量不断升高相一致㊂综合各项指标变化规律，推荐以６ｈ为肉牛肌肉细胞造模的适宜时间㊂４㊀结㊀论㊀㊀本研究以肉牛背最长肌为材料，采用组织块法成功分离培养肉牛肌肉细胞，免疫荧光法及流式细胞仪鉴定表明细胞为肉牛肌卫星细胞㊂利用Ｈ２Ｏ２成功建立肉牛肌肉细胞氧化应激模型，适宜作用浓度为３００μｍｏｌ／Ｌ，作用时间为６ｈ㊂参考文献：［１］㊀ＡＲＣＨＩＬＥ⁃ＣＯＮＴＲＥＲＡＳＡＣ，ＰＵＲＳＬＯＷＰＰ．Ｏｘｉ⁃ｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｍａｙａｆｆｅｃｔｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｂｙｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎｔｕｒｎｏｖｅｒｂｙｍｕｓｃｌｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１１，４４（２）：５８２－５８８．［２］㊀崔艳军．热应激和氧化应激对肥育猪骨骼肌代谢的影响及硫辛酸的调控作用［Ｄ］．博士学位论文．北京：中国农业科学院，２０１６．［３］㊀ＣＨＥＮＸ，ＺＨＡＮＧＱ，ＣＨＥＮＧＱ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅａｇａｉｎｓｔＨ２Ｏ２⁃ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏ⁃ｓｉｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，３３２（１／２）：８５－９３．［４］㊀ＳＴＲＡＮＤＢＥＲＧＹ，ＧＲＡＹＣ，ＶＵＯＣＯＬＯＴ，ｅｔａｌ．Ｌｉ⁃ｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄｉｎｄｕｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉ⁃ａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２００５，３１（１）：７２－８６．［５］㊀ＦＥＲＲＡＲＩＭ，ＳＣＡＬＶＩＮＩＡ，ＬＯＳＩＯＭＮ，ｅｔａｌ．Ｅｓ⁃ｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗｐｉｇｃｅｌｌｌｉｎｅｓｆｏｒｕｓｅｉｎｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００３，１０７（２）：２０５－２１２．［６］㊀ＬＩＮＸＪ，ＪＩＡＮＧＳＱ，ＪＩＡＮＧＺＹ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｅｑｕｏｌｏｎＨ２Ｏ２⁃ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｈｉｃｋｅｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２０１６，９５（６）：１３８０－１３８６．［７］㊀ＬＩＵＸＭ，ＬＩＵＧＦ，ＴＡＮＸＷ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＳＩＲＴ１，ＦｏｘＯ１，ａｎｄＰＰＡＲγｉｎｂａｃｋｆａｔｔｉｓ⁃ｓｕｅｓａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｏｆＬｉｌｕｂｕｌｌｓ［Ｊ］．ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１４，９６（２）：７０４－７１１．［８］㊀ＬＩＵＸＭ，ＺＨＡＯＨＢ，ＪＩＮＱ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌｉｎ⁃ｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｓｔｉｍｕｌａ⁃ｔｉｎｇｔｈｅＳＩＲＴ１⁃ＡＭＰＫα⁃ＦＯＸＯ１ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｂｏｖｉｎｅｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８，４３９（１／２）：２１３－２２３．［９］㊀何芳婷，陈嘉熠，徐佳伊，等．氧化应激细胞模型建立的研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１９，４０（７）：３４１－３４５．６７３２５期谭秀文等：肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立［１０］㊀ＰＡＳＺＴＩ⁃ＧＥＲＥＥ，ＣＳＩＢＲＩＫ⁃ＮＥＭＥＴＨＥ，ＳＺＥＫＥＲＫ，ｅｔａｌ．ＡｃｕｔｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｆｆｅｃｔｓＩＬ⁃８ａｎｄＴＮＦ⁃αｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＩＰＥＣ⁃Ｊ２ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎ⁃ｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２０１２，３５（３）：９９４－１００４．［１１］㊀郑延松，李源，张珊红，等．用低浓度过氧化氢建立心肌细胞氧化损伤模型［Ｊ］．第四军医大学学报，２００１，２２（２０）：１８４９－１８５１．［１２］㊀金鹿．维生素Ａ对奶牛乳腺硒蛋白合成及抗氧化功能影响机理的研究［Ｄ］．博士学位论文．呼和浩特：内蒙古农业大学，２０１４．［１３］㊀卢靖坤．ＭＳＴＮ蛋白结构变异对牛肌肉生长的影响［Ｄ］．硕士学位论文，呼和浩特：内蒙古大学，２０１８．［１４］㊀ＨＩＮＤＩＬ，ＭＣＭＩＬＬＡＮＪＤ，ＡＦＲＯＺＥＤ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａ⁃ｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｍｙｏ⁃ｂｌａｓｔｓｆｒｏｍｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｏｆａｄｕｌｔｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏ⁃Ｐｒｏ⁃ｔｏｃｏｌ，２０１７，７（９）：ｅ２２４８．［１５］㊀ＭＩＴＣＨＥＬＬＫＪ，ＰＡＮＮÉＲＥＣＡ，ＣＡＤＯＴＢ，ｅｔａｌ．Ｉ⁃ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｎ⁃ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｍｕｓｃｌｅｒｅｓｉｄｅｎｔｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｄｕｒｉｎｇｐｏｓｔｎａｔａｌｄｅｖｅｌｏｐ⁃ｍｅｎｔ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１２（３）：２５７－２６６．［１６］㊀ＦＡＣＣＨＩＮＥＴＴＩＦ，ＦＵＲＥＧＡＴＯＳ，ＴＥＲＲＡＺＺＩＮＯＳ，ｅｔａｌ．Ｈ２Ｏ２ｉｎｄｕｃｅｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＦａｓａｎｄＦａｓｌｉｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＧＦ⁃ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＰＣ１２ｃｅｌｌｓ：ｍｏｄｕｌａ⁃ｔｉｏｎｂｙｃＡＭＰ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，６９（２）：１７８－１８８．［１７］㊀吕晓，朱海鲸，曹晖，等．猪肌肉卫星细胞的分离培养及生物学特性鉴定［Ｊ］．中国兽医学报，２０１１，３１（１０）：１４８０－１４８４．［１８］㊀徐蓬，顾晓明．兔骨骼肌卫星细胞的体外培养及生长特性的研究［Ｊ］．实用口腔医学杂志，２０００，１６（１）：７－９．［１９］㊀ＧＲＯＵＮＤＳＭＤ，ＧＡＲＲＥＴＴＫＬ，ＬＡＩＭＣ，ｅｔａｌ．Ｉ⁃ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏｂｙｕｓｅｏｆＭｙｏＤ１ａｎｄｍｙｏｇｅｎｉｎｐｒｏｂｅｓ［Ｊ］．ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，２６７（１）：９９－１０４．［２０］㊀ＳＥＡＬＥＰ，ＳＡＢＯＵＲＩＮＬＡ，ＧＩＲＧＩＳ⁃ＧＡＢＡＲＤＯＡ，ｅｔａｌ．Ｐａｘ７ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｙｏｇｅｎｉｃｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０００，１０２（６）：７７７－７８６．［２１］㊀ＺＨＵＬＨ，ＺＨＡＯＫＬ，ＣＨＥＮＸＬ，ｅｔａｌ．Ｉｍｐａｃｔｏｆｗｅａｎｉｎｇａｎｄａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｂｌｅｎｄｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｔａｔｕｓｉｎｐｉｇｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，９０（８）：２５８１－２５８９．［２２］㊀蔡旋，王静娴，陈小连，等．肠道上皮氧化应激细胞模型的研究进展［Ｊ］．畜牧兽医学报，２０１４，４５（３）：３３７－３４６．［２３］㊀ＣＡＩＸ，ＣＨＥＮＸＬ，ＷＡＮＧＸＣ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｐｏｉｃａｃｉｄｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＨ２Ｏ２ｉｎＩＰＥＣ⁃Ｊ２ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓ⁃ｔｒｙ，２０１３，３７８（１／２）：７３－８１．［２４］㊀ＪＩＮＸＬ，ＷＡＮＧＫ，ＬＩＵＨＹ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｏ⁃ｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘ⁃ｉｄｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｅｌｌｄａｍａｇｅｂｙｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ［Ｊ］．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＬｏｎｇｅｖｉｔｙ，２０１６，２０１６：２５７２１７５．［２５］㊀戴青里，孙贵龙，闫斌，等．过氧化氢诱导ＨＵＶＥＣｓ氧化应激模型的构建［Ｊ］．昆明医科大学学报，２０１８，３９（４）：３４－３９．［２６］㊀ＡＬＦＯＮＳＯ⁃ＰＲＩＥＴＯＭ，ＢＩＡＲＮÉＳＸ，ＶＩＤＯＳＳＩＣＨＰ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｃａｔａｌａｓｅｒｅａｃ⁃ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，２００９，１３１（３３）：１１７５１－１１７６１．［２７］㊀ＶＡＬＫＯＭ，ＬＥＩＢＦＲＩＴＺＤ，ＭＯＮＣＯＬＪ，ｅｔａｌ．Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｉｎｎｏｒｍａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎｓａｎｄｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００７，３９（１）：４４－８４．［２８］㊀ＰＩＡＯＭＪ，ＫＡＮＧＫＡ，ＺＨＡＮＧＲ，ｅｔａｌ．Ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅｐｒｅｖｅｎｔｓｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒ⁃ｏｘｉｄｅｉｎｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｖｉａａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ：ＧｅｎｅｒａｌＳｕｂｊｅｃｔｓ，２００８，１７８０（１２）：１４４８－１４５７．［２９］㊀ＲＯＳＥＮＪＥ，ＰＲＡＨＡＬＡＤＡＫ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＧＭ．８⁃ＯｘｏｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＤＮＡｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＨ２Ｏ２ａｌｏｎｅｏｒｗｉｔｈＵＶＢｏｒＵＶＡｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏ⁃ｇｙ，１９９６，６４（１）：１１７－１２２．［３０］㊀ＬＩＪ，ＳＵＮＪＨ，ＬＩＢ，ｅｔａｌ．ＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｔｅｃｔｓＡＲＰＥ⁃１９ｃｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙ⁃ｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔ，２０１８，３２（５）：１２７７－１２８４．［３１］㊀ＹＯＵＮＧＤＹ，ＦＡＮＭＺ，ＭＩＮＥＹ．Ｅｇｇｙｏｌｋｐｅｐｔｉｄｅｓｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎ⁃ｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎａｐｏｒｃｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｏｘｉｄａ⁃ｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍ⁃ｉｓｔｒｙ，２０１０，５８（１３）：７６２４－７６３３．［３２］㊀ＱＵＩＮＣＯＺＥＳ⁃ＳＡＮＴＯＳＡ，ＢＯＢＥＲＭＩＮＬＤ，ＬＡＴＩ⁃ＮＩＡ，ｅｔａｌ．ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌｐｒｏｔｅｃｔｓＣ６ａｓｔｒｏｃｙｔｅｃｅｌｌｌｉｎｅａｇａｉｎｓｔｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｔｈｒｏｕｇｈｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ１［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１３，８（５）：ｅ６４３７２．［３３］㊀金晓露．白藜芦醇抵御奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的作用机制研究［Ｄ］．博士学位论文，杭州：浙江大学，２０１６．［３４］㊀ＤＥＹＳ，ＳＩＤＯＲＡ，Ｏ ＲＯＵＲＫＥＢ．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ⁃ｓｐｅ⁃ｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｂｙａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐａｔｈｗａｙｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，２９１（２１）：１１１８５－１１１９７．７７３２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷∗Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｌｙ∗∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ａｓｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｎｇｌｕｎｚｈａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ（责任编辑㊀田艳明）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ＣｕｌｔｕｒｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｅｅｆＣａｔｔｌｅＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＩｔｓＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＭｏｄｅｌＴＡＮＸｉｕｗｅｎ㊀ＹＯＵＷｅｉ∗㊀ＬＩＵＸｉａｏｍｕ㊀ＪＩＮＱｉｎｇ㊀ＷＥＩＣｈｅｎ㊀ＷＡＮＦａｃｈｕｎ㊀ＺＨＡＮＧＸｉａｎｇｌｕｎ∗∗（ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｏｆＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈｙＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＴｅｓｔｉｎｇＣｅｎｔｅｒｏｆＢｅｅｆＣａｔｔｌｅＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｉ 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《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》
《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析一、引言随着生物信息学技术的快速发展，基因组学与转录组学在生物医学研究中的应用越来越广泛。
本文将通过对比分析MSTN-/-鲁西黄牛的转录组差异转录本，深入探讨其潜在的生物学意义和功能。
MSTN基因是肌生长抑制素基因的缩写，其功能在多种动物中已被广泛研究。
鲁西黄牛作为我国重要的肉牛品种，其基因表达特征的研究对于了解其生长特性、肉质改良等具有重要意义。
二、材料与方法1. 实验材料本研究以鲁西黄牛为研究对象，收集了MSTN基因敲除和野生型鲁西黄牛的转录组数据。
2. 实验方法（1）转录组测序：对MSTN-/-和野生型鲁西黄牛的肌肉组织进行转录组测序，获取转录本数据。
（2）数据预处理：对原始数据进行质量控制、数据清洗等预处理。
（3）差异表达分析：利用生物信息学软件和算法，对比分析两组样品间的差异转录本。
（4）功能注释与富集分析：对差异转录本进行功能注释，并进行富集分析，以了解其潜在的生物学功能。
（5）蛋白质互作网络构建：基于差异转录本编码的蛋白质，构建蛋白质互作网络，探讨其相互关系。
三、结果与分析1. 差异转录本分析通过对比MSTN-/-和野生型鲁西黄牛的转录组数据，我们发现了一系列差异表达转录本。
其中，部分转录本在MSTN-/-鲁西黄牛中显著上调或下调。
这些差异转录本可能涉及到肌肉生长、代谢、免疫等多个生物学过程。
2. 功能注释与富集分析对差异转录本进行功能注释，我们发现这些转录本主要涉及到肌肉发育、能量代谢、免疫应答等生物学过程。
通过富集分析，我们发现这些差异转录本在特定的生物通路中显著富集，如肌肉收缩、能量代谢等。
这表明MSTN基因的敲除可能影响了鲁西黄牛的肌肉发育和能量代谢等生物学过程。
3. 蛋白质互作网络构建基于差异转录本编码的蛋白质，我们构建了蛋白质互作网络。
通过分析网络中的节点和边，我们发现了一些关键蛋白质，它们在肌肉生长、代谢等过程中发挥了重要作用。
鲁西黄牛在黄河三角洲地区保种现状及开发利用的调查与研究
鲁两黄牛在黄ｙ町三角洲地区保种现状技开发利用的调黄与研究周岁鲁两黄牛种公‘｛一成年鲁西黄牛种公牛农户饲养的鲁ｐｑ黄牛鲁曲黄牛种母牛和小牛帻图３－３鲁西黄牛Ｆｉ９３—３ＴｈｅＬｕｘｉｃａｔｔｌｅ通过对黄河三角洲地区鲁西黄牛的调查结果表明，三种类型的鲁西黄牛已无明显界限，所以无法进行数量统计。
对１８１９头鲁西黄牛外貌特征统计结果如下：表３—７鲁两黄牛外貌特征调查结果Ｔａｂｌｅ３—７ＴｈｅｓｕｒｖｅｙｏｆｔｈｅＬｕｘｉｃａｔｔｌｅａｐｐｅａｒａｎｃｅ等级特３、２、２鲁西黄牛的生物学特性调盘结果表３一ｌｌ鲁俩黄牛肉成分表Ｔａｂ］ｅ３—１ｌＬｕｘｊｃａｒｔｌｅＭｅａｔＣＯｍｐＯＳｊｔｉＯＲｆｏｒｍ图３－４鲁西黄牛胴体各分割部位图Ｆｉ９３—４ＴｈｅｄｉＶｉｓｉＯｎｏｆｔｈｅＬｕｘｉｃａｒｔｆｅ３、３、４鲁西黄牛的选育与杂交性能３、３、４、１鲁西黄牛的选育资料介绍，１９５４年华东农科所在对鲁西黄牛调查时就发现中间型鲁西黄牛体躯宽深，体型较长，肌肉丰满，尤其是后躯发育较好，是良好的肉用体型。
目前仍有１％左右的鲁西黄牛肉用体型突出，ＢＰ［值叮以与国际先进的专用肉牛媲美，但是这种类型的牛数量很少，散不成群，不成规模。
选育肉用型鲁四黄牛品系其重要任务之。
就足要将这些肉Ｊｆ－ｊ体形突ｆｆ｛的牛收集起来，形成核心群，集中优秀基因，进行选种选配，形成鲁西黄牛肉用ｔ铺系。
据统计，渤海农场在８０年代曾集中优良鲁西黄牛近万头，这蝗牛的主要特点足调盘结果每家平均五至八头，在对其中的２７８头鲁西黄牛的调查中发现多数是作为肉牛来加以饲养，只有大约ｌＯ％作为役用，５０％以上肉役兼用。
常三牛一犋耕地，每天犁±也三至四亩。
一牛一犋，每天犁地近二亩左右。
从调查结果上看，在今后相当长‘一段ｍＪ间内，鲁西黄牛要走肉用与肉役兼用十¨结合的道路。
以为黄牛役』１Ｊ已小需要的看法是与实际不千｝Ｊ符的。
由Ｊｊ我国农叫地形复杂，地块小，作物种类多、复播指数高，加之间作套种等比较复杂的耕作制度，在柏当Ｋ的时期内农业生产动力仍然要走人、畜、机三结合的道路，因此，对鲁西黄牛的改良仍需考虑这个因素。
《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》
《基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析》基于MSTN---鲁西黄牛转录组差异转录本生物信息学分析一、引言近年来，生物信息学技术在研究基因组学和转录组学领域得到了广泛的应用。
本篇范文旨在通过对MSTN-/-鲁西黄牛的转录组差异转录本进行生物信息学分析，进一步了解其基因表达模式和生物学功能。
MSTN基因是一种重要的生长调控基因，在动物育种和改良中具有重要价值。
鲁西黄牛作为我国重要的肉牛品种，其基因表达和生物学特性的研究对于提高肉牛品质和养殖效益具有重要意义。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选取了MSTN-/-鲁西黄牛的肌肉组织作为实验材料，通过RNA提取、cDNA文库构建等步骤，获得转录组数据。
2.2 生物信息学分析方法（1）数据预处理：对原始测序数据进行质量控制，去除低质量和污染的序列。
（2）转录本组装：利用相关软件对clean reads进行组装，得到转录本序列。
（3）差异表达分析：通过比较MSTN-/-鲁西黄牛的转录组数据，找出差异表达的转录本。
（4）功能注释与富集分析：对差异表达的转录本进行功能注释和富集分析，明确其在生物学功能中的作用。
（5）蛋白质互作网络构建：根据转录本的互作关系，构建蛋白质互作网络，进一步分析其在生物体内的功能。
三、结果与分析3.1 转录组数据概况经过数据预处理和转录本组装，我们获得了大量的转录组数据。
通过比较MSTN-/-鲁西黄牛的转录组数据，我们发现存在大量的差异表达转录本。
3.2 差异表达转录本分析通过对差异表达转录本的分析，我们发现MSTN-/-鲁西黄牛在肌肉生长、代谢、免疫等方面存在显著的基因表达差异。
这些差异表达的基因可能参与了肌肉生长发育、能量代谢、免疫应答等生物学过程。
3.3 功能注释与富集分析对差异表达的转录本进行功能注释和富集分析，我们发现这些基因主要参与了肌肉发育、能量代谢、免疫应答等生物学过程。
其中，一些基因在MSTN-/-鲁西黄牛中表现出显著的富集现象，可能具有重要功能。
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为脂 肪细 胞 、 成 骨 细胞 、 软 骨 细胞 、 神 经 细 胞 等 不 同 ｍａ 公司 ， Ｄ ｅ ｓ ｍｉ ｎ （ 鼠抗 牛 ， １：１ ０ ０ ） 抗体 、 Ｍｙ ｏ Ｄ（ 鼠
摘要
为研 究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性 ， 取 ３ ０ ￣５ ０日龄鲁 西黄牛胚胎 四肢骨骼肌 ， 分离培
养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞 。结果显示 ， 试验成功地分 离了鲁西黄 牛胚胎 骨骼肌卫 星细胞 ， 原代 培养并传
代至 １ ６代 ， 免 疫 细 胞 化学 染 色 检 测 卫 星 细胞 表 面特 异 性 标 志 Ｄｅ ｓ ｍｉ ｎ 、 Ｍｙ ｏ Ｄ呈阳性表达， Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ检 测 Ｄ ｅ ｓ ｍｉ ｎ 、 Ｍ 、 Ｍｙ ｆ ５ 、 ｐ ａ ｘ ７呈阳性 表达 ； 绘制生长 曲线 ， 结 果说 明细胞具 有较 强增 殖能力 ； 应用流式 细胞仪对 细 胞进行周期分析 ， 结果显示 Ｓ期细胞所 占比例为 ８ ． ９ ４ ； 骨骼 肌卫星细胞 向成肌细胞诱 导 １ ０ ｄ后 ， 免疫 细胞化 学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋 白呈 阳性表达 ； 骨骼肌卫 星细胞 向脂肪 细胞诱导 ７ ｄ后 ， 油红 （ ） 染 色 呈阳性 ， Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ检测脂肪细胞特异性标志 ｐ ｐ ａ ｒ ７ 、 Ｌ ＰＬ呈 阳性表 达 。结果表 明试验成 功建立 了鲁西 黄牛胚胎 骨骼肌卫星细胞的体外扩增培养体系 ， 且该骨骼肌卫 星细胞有发育形成肌管 和脂肪细胞 的多项分化潜能 。 关键词 鲁西黄牛胚胎 ； 骨骼肌卫星 细胞 ；体外扩增 ； 培养体 系；增殖能力 ； 分化
文献标识码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０ — ２ ４ ２ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ — ０ ０ ９ ０ — ０ ７ 中 图 分 类 号 Ｓ ８ ２ ３
骨骼肌 卫星细胞 （ ｓ ｋ ｅ ｌ ｅ ｔ ａ ｌ ｍｕ ｓ ｃ ｌ ｅ ｓ ａ ｔ ｅ ｌ ｌ ｉ ｔ ｅ 离 培养 及分 化潜 能 的研 究 尚未 见 报道 ， 本 试 验 采 用 ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ） ， 称肌 肉干细胞 （ ｍｕ ｓ ｃ ｌ ｅ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ） ， 最 早 由 联 合酶 消化 法和 差速贴 壁法 成功 分离 得到鲁 西 黄牛 Ｍａ ｕ ｒ ｏ等 ＿ １ ］ 在蛙 骨骼 肌 中发 现 。多 年 的研 究 表 明 ， 的骨骼 肌卫 星细 胞 ， 并 证 实该 细 胞 具 有发 育 形 成 肌 骨骼 肌卫 星细胞 是位 于肌 细胞 膜和 基膜 之 间的一种 管 和脂 肪细 胞 的多项分 化潜 能 。 经特 化 的 、 具有 增殖 和多 项分 化能 力 的生 肌 干细胞 ， 是组 织工 程理想 的种 子 细胞 。对成 年 的哺乳 动物 而 骼肌 卫 星细胞一 般 处 于 静息 状 态 ， 当骨 骼 肌 受 到 负
将３ ０ ￣５ ０ ｄ的鲁 西 黄牛胚 胎 常规 消 毒后 ， 取 其
骼肌 卫 星细 胞＿ ｌ ６ 。 ， 但 对 牛 的骨 骼 肌 卫 星 细胞 的分 四肢 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ 洗涤 ３ 次， 剔 除四肢上 的皮肤 、 血管 、
收 稿 日期 ：２ ０ １ ２ 一 ｌ １ 一 Ｏ ４
基金项 目：转基 因生物新品种培育科技重大专项 （ ２ ０ １ １ Ｚ Ｘ０ ８ ０ ０ ９ — ０ ０ ３ — ０ ０ ６ 、 ２ ０ １ １ Ｚ Ｘ０ ８ ０ １ ２ — ０ ０ ２ — ０ ６ ） 、 基本科研业务 项 目（ ２ ０ １ ２ ｚ １ 肌 卫星 细胞 分 离 培 养 及 生 物 学 特 性
边艳超 牧 仁Ｌ 李 向臣。 李云章 关伟军
１ ． 内 蒙古 农 业 大 学 兽 医 学院 ， 呼 和 浩特 ０ １ ０ ０ １ ８ ；
２ ． 中国农 业科 学院北京畜牧 兽 医研 究所 ， 北京 １ ０ ０ １ ９ ３
胚层 的细 胞 ， 这 种可 塑性 吸引 了众 多研究 者 的 目光 。 抗牛 ， １：１ ０ ０ ） 抗 体、 ｆ ａ ｓ ｔ ｓ ｋ ｅ ｌ ｅ ｔ ａ ｌ ｍｙ ｏ ｓ ｉ ｎ （ 鼠抗 牛 ， 骨骼 肌卫 星细胞 在 骨骼肌 早期 生长 发育 以及再 生 中 １：１ ０ ０ ） 抗体 购 自美 国 Ａｂ ｃ ａ ｍ 公 司， Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 试 剂
第３ ２ 卷 第 ２ 期
２ ０ １ ３ 年 ３月
华
中
农
业
大
学
学
报
Ｖｏ Ｉ ＿ ３ ２ Ｎｏ ． ２
Ｍａ ｒ ．２ ０ １ ３。 ９ Ｏ ～９ ６
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
１ 材 料 与 方 法
３ ０ ￣５ ０ ｄ的鲁 西 黄牛胚 胎 。 ＤＭＥ Ｍ／ Ｆ １ ２ 、 Ｆ Ｂ Ｓ购 自美 国 Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ（ ） 公司 ， 工型
言， 卫 星 细胞 是肌 肉损 伤 修 复 或再 生 的 中介 ［ ２ ］ 。骨 １ ． １ 试 验材 料 重、 外 伤 等外界 刺 激后 ， 卫 星 细胞 被 迅 速 激 活 ， 便 具 １ ． ２ 主 要试 剂 有了增 殖分 化 、 融 合 成肌 管 、 再 形 成 肌 细 胞 的 能
发挥 重要 作用 ， 因此 在 骨 组 织 创 伤修 复 和 组 织 工程 盒 购 自 Ｔａ Ｋａ Ｒａ 公司。
等 临床应 用 中具 有 广泛 的应用 前景 ［ ５ ］ 。 １ ． ３ 牛 骨骼 肌卫 星细胞 分离 培养
目前 ， 学者 们 已成功 地分 离 出人 、 鼠、 猪、 鸡等骨