HBV X基因突变促进肝癌发生的生物学机制
乙肝病毒感染相关肝癌的分子发病机制
乙肝病毒感染相关肝癌的分子发病机制摘要] 乙肝病毒感染相关肝癌是我国最常见的肝癌类型，全国每年有30多万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的60%左右。
在我国，由于乙肝病毒感染人数较多，慢性乙肝病毒感染宿主基因，最终导致细胞癌变及肿瘤的发生。
通常对于乙肝病毒感染相关肝癌的预防是接种乙肝疫苗和抗HBV治疗，但在治疗方面方法有限。
目前乙肝病毒导致肝细胞癌变的分子机制仍存在较大争议。
因此，若能从分子机制入手阐明乙肝病毒感染相关肝癌的致病机理，可为肝癌的防治提供新的策略。
【关键词】乙型肝炎病毒；肝细胞癌；HBX蛋白；分子机制肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率很高，全国每年有30多万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的60%左右[1]。
中国是肝癌高发地区，乙肝病毒感染相关肝癌是我国最常见的肝癌类型[2]。
HBV是一类DNA病毒，其主要攻击肝细胞产生假小叶形成肝硬化，最终可导致肝癌发生。
世界卫生组织（WHO）相关数据表明HBV感染与肝癌相密切相关度达80%，而乙肝病毒携带者（HBsAg阳性）患肝癌的风险比HBsAg阴性者高25~50倍[3]。
目前研究已经证实HBV感染肝癌发生过程中发挥重要作用，但HBV导致肝细胞癌变的分子机制仍存在较大争议。
本研究对乙肝病毒感染相关肝癌的分子发病机制做出综述。
1乙肝病毒DNA整合乙肝病毒是一种嗜肝细胞病毒，其特点是将自身病毒DNA整合入被感染的肝细胞基因组中，导致突变产生[4]。
研究发现，80%~90%的乙肝病毒感染相关肝癌患者的癌细胞基因组中发现有乙肝病毒DNA。
整合后的宿主基因由于缺少基因片段为导致无法正常调节细胞周期，影响增殖、凋亡等[5]。
研究发现，重排的乙肝病毒DNA序列中含有4个开放阅读框S、C、P、X基因，这些启动子和增强子整合进入宿主基因后，主要两个方面作用：一是导致生长因子基因表达失控，如S基因主要编码HBsAg，可使体内视黄酸受体β基因的表达失调；二是直接激活了原癌基因，如X基因编码HBX蛋白，可整合到C-myc、N-ras基因序列引起激活表达[6]。
肝癌的基因突变与易感因素的关系
肝癌的基因突变与易感因素的关系肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内居高不下。
肝癌的发展过程是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中基因突变和易感因素在其发病机制中起着重要作用。
一、基因突变与肝癌的关系肝癌的发展过程中，基因突变是一个关键环节。
基因突变是指细胞基因组DNA序列发生变化，导致基因功能异常。
在肝癌中，常见的基因突变包括肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。
1. 肿瘤抑制基因的失活肿瘤抑制基因是一类能够抑制肿瘤发生和发展的基因。
在肝癌中，常见的肿瘤抑制基因包括TP53、PTEN和CDKN2A等。
这些基因的突变会导致细胞的DNA 修复和细胞周期调控功能失调，从而促进肝癌的发展。
2. 癌基因的激活癌基因是一类能够促进肿瘤发生和发展的基因。
在肝癌中，常见的癌基因包括RAS、MYC和CTNNB1等。
这些基因的突变会导致细胞的增殖、分化和凋亡等功能异常，从而促进肝癌的发展。
二、易感因素与肝癌的关系除了基因突变外，一些易感因素也与肝癌的发生密切相关。
1. 病毒感染乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是肝癌的主要致病因素。
这两种病毒的感染会导致慢性肝炎和肝硬化，进而增加肝癌的发生风险。
2. 酒精滥用长期酗酒会导致肝细胞损伤和肝硬化，增加肝癌的发生风险。
酒精通过干扰DNA修复和细胞周期调控等机制，促进肝癌的发展。
3. 饮食因素高脂饮食、高糖饮食和缺乏蔬菜水果摄入等不良饮食习惯与肝癌的发生相关。
这些饮食因素会导致肥胖、代谢综合征和非酒精性脂肪肝等疾病，进而增加肝癌的风险。
4. 环境因素某些化学物质、重金属和农药等环境污染物与肝癌的发生相关。
这些物质通过干扰DNA修复和细胞功能等机制，增加肝癌的风险。
总结：肝癌的发生是一个复杂的过程，其中基因突变和易感因素在其发病机制中起着重要作用。
基因突变导致肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活，从而促进肝癌的发展。
而病毒感染、酒精滥用、不良饮食习惯和环境因素等易感因素也会增加肝癌的发生风险。
生物钟基因 Timeless 在 HBV 相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒 X 蛋白的关系
生物钟基因 Timeless 在 HBV 相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒 X 蛋白的关系彭桦;何前进;金涛;李常海【摘要】Objective To investigate the expression of circadian clock gene Timeless in hepatitis B virus ( HBV)-relat-ed hepatocellular carcinoma (HCC) and its correlation with hepatitis B virus x protein (HBx).Methods Immunohisto-chemistry was employed to detect the expression of Timeless in 60 cases of HCC tissues and adjacent normal tissues.Then we analyzed the relationship between the expression of Timeless and clinic pathological features in HCC patients.Meanwhile, both pcDNA3.1-HBx and pcDNA3.1 were transfected into LO2 and HepG2 cell lines, respectively.Real-time PCR and West-ern blotting were used to detect the expression of Timeless mRNA and protein.Results The protein expression levels of Timeless in HCC tissues and adjacent normal tissues were60.0%(36/60) and 38.3%(23/60), respectively;and signifi-cant differences were found (P<0.05).The expression of Timeless in HCC tissues was associated with vascular invasion (P<0.05), was not related with sex, age, level of serum AFP (all P>0.05).HepG2 and LO2 cell lines transfected with pcD-NA3.1-HBx plasmids demonstrated higher protein and mRNA expression levels of Timeless as compared with those transfected with pcDNA3.1 plasmids (all P<0.05).Conclusion High expression of Timeless may be related to the occurrence and progression of HBV-related HCC, and HBx may be one of the reasons that causes the high expression ofTimeless.%目的：探讨生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌中的表达及其与乙肝病毒X蛋白（ HBx）的关系。
肝癌的微生物与肿瘤关系研究
肝癌的微生物与肿瘤关系研究肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，在全球范围内都具有较高的发病率和死亡率。
多年来，人们对于肝癌的病因和发展机制进行了深入的研究，发现微生物在肝癌的发生和发展过程中起着重要的作用。
本文将探讨肝癌的微生物与肿瘤关系的研究现状和进展。
一、肝癌与乙型肝炎病毒(HBV)的关系乙型肝炎病毒是肝癌最主要的病因之一，已经成为世界范围内肝癌的重要因素之一。
乙肝病毒感染可导致肝细胞发生炎症和坏死，进而引起肝纤维化和肝硬化。
长期的肝炎病毒感染会导致DNA损伤和基因突变，促进肝癌的发展。
此外，乙肝病毒的HBx蛋白在癌细胞的增殖、凋亡和转移等多个方面起到重要的调控作用，进一步促进肝癌的发生和发展。
二、肝癌与丙型肝炎病毒(HCV)的关系丙型肝炎病毒同样是导致肝癌的重要因素之一。
丙肝病毒感染会导致肝细胞发生慢性炎症和纤维化，最终发展为肝硬化和肝癌。
大量的研究表明，HCV感染可引起肝细胞内炎性反应、细胞凋亡以及抗病毒应答的改变，进而导致细胞的恶性转化和肝癌的发展。
三、肝癌与微生物组的关系除了乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，其他微生物组成的群落也与肝癌发展密切相关。
肝组织中的微生物组与肝癌的发展和预后存在关联，通过种群分析和组学研究发现，肝癌患者的肝组织中存在明显的微生物组变化。
具体而言，晚期肝癌患者肝内微生物群落丰富度较低，而肺炎链球菌、肺炎草状链球菌等细菌的相对丰度明显增加。
这些微生物的改变可能与肝癌的恶化和预后不良相关。
四、微生物的干预治疗肝癌的前景针对肝癌微生物组的研究为肝癌的干预治疗提供了新的思路。
通过调节肝组织中的微生物组成和群落结构，可以干预肝癌的发展进程。
目前的研究表明，特定的微生物组可能与肝癌的预后和治疗反应相关，因此可能通过微生物组的干预来改善肝癌的治疗效果。
例如，通过肠道菌群干预，可以调节肝内菌群的结构和功能，从而影响肝癌的发展和治疗效果。
总结：肝癌的微生物与肿瘤关系的研究已经取得了一定的进展，从乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒到肝组织中的微生物群落，都与肝癌的发展和预后密切相关。
肝癌发生机制的研究进展
c-met受体及其配体对肝损伤后肝细胞再生至关重要。它 的作用如下：1.影响肿瘤抑制因子胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，IGF)2R的等位损失。2.导致致癌的配体 IGF2的过表达。3.使IGF结合蛋白IGFBP2和IGFBP3管制解除。 Wnt/β-Catenin通路对HCC至关重要，大约一半的肝癌会发生 Wnt信号通路的激活[3]。
参考文献：
[1] 尹建东，郭启勇，王晓明，等.基于DICOM标准的集 中打印系统的研制[J].中国医学影像学杂志，2010，18(6)： 521-524.
[2] 顾强，朱兆丰，李冠武，等.自助式自动取片机在优 化放射检查流程的价值[J].实用放射学杂志，2010，26(6)： 918-919.
关键词：肝癌；发生机制 原发性肝癌简称肝癌，指发生在肝内胆管细胞或者肝细 胞的癌症。其中，约有90%都是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发 病率居世界肿瘤发病率第六位。它包括HCC、胆管细胞癌及混 合型肝癌。本文总结近年来的研究成果，对肝癌的发病机制 进行综述。 一、肝癌的风险因素 肝癌的风险因素主要是乙肝病毒(hepatitis Bvirus, HBV)和丙肝病毒，其次有肝硬化、黄曲霉毒素、酗酒和吸烟 等。遗传因素可能会影响环境因素，导致罹患肝癌的风险增 加。目前，医学界发现HBVx基因型B可以促进肝癌细胞的迁移、 侵袭和黏附，在肝癌的发展阶段它有很强的致癌性[1]。 二、细胞分子水平上的发生机制 肿瘤细胞增殖过度和凋亡减少是肝癌发生的重要原因。 Nin1结合蛋白(Nin onebinding protein，NOB1)被研究证实在 肝癌中高表达。除了肝癌，NOB1的对癌细胞增殖的作用在胃 癌、肺癌中也相继被证实[2]。 有报道质基质金属蛋白酶 (Matrix metalloproteinases， MMP) 2、MMP9和肿瘤细胞的迁移和扩散有关。MMP2和MMP9属于 MMP家族，其活性与胞外基质的蛋白水解、细胞迁移的调控、生 长因子和细胞因子的处理以及血管生成因子的分离有关[2]。 三、信号通路与肝癌的发生 VEGF信号通路是HCC血管生成的基础。我们在7～10%的HCC 病例中发现了高水平的扩增。有研究表示VEGF与MMP9呈正相 关，可以通过刺激内皮细胞产生MMPs，来激活基质降解反应， 抑制胞内酪氨酸激酶，促进肿瘤血管生成。研究提示VEGF与 MMP9在肿瘤血管生成和侵袭转移过程中起协同作用[3]。
肝癌的病因与病理生理学机制
肝癌的病因与病理生理学机制肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发生与多种因素有关。
本文将探讨肝癌的病因和病理生理学机制，以加深对这一疾病的理解。
一、病因分析1. 慢性肝炎病毒感染慢性乙型肝炎病毒（HBV）和慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝癌最主要的病因。
这两种病毒可以导致肝细胞损伤和炎症反应，进而引发肝癌的发生。
2. 酒精滥用长期过量饮酒会导致肝脏损伤和肝纤维化，进而增加肝癌的风险。
酒精代谢产物乙醛可以引起DNA损伤和抑制DNA修复，使肝细胞易于发生突变，从而促进肝癌的发展。
3. 脂肪肝脂肪肝是一种常见的代谢性疾病，长期存在的脂肪沉积会引起肝细胞损伤和肝纤维化，增加肝癌的风险。
此外，脂肪组织产生的激素和细胞因子也可能参与肝癌的发生。
4. 遗传因素遗传因素在肝癌的发生中起着重要作用。
一些基因突变或多态性与肝癌的易感性相关，如肝癌相关基因TP53、CTNNB1等。
家族性肝癌的发生也与遗传因素密切相关。
5. 某些疾病和药物慢性肝病、肝硬化、疟疾等疾病可增加肝癌的风险。
此外，一些药物如抗癌药物、激素和免疫抑制剂等亦与肝癌相关。
二、病理生理学机制解析1. 基因突变和表观遗传调控肝癌细胞基因突变的累积是肝癌发生和发展的重要机制。
TP53和CTNNB1基因的突变在肝癌中较为常见，这些突变可导致肿瘤抑制基因失活、促癌基因激活以及细胞增殖和凋亡调控的失衡。
2. 慢性炎症和纤维化慢性肝炎病变引起的肝细胞损伤和炎症反应导致细胞的再生和纤维化，使细胞周期紊乱，从而有利于肿瘤的发生。
纤维化程度与肝癌的危险度正相关，纤维化进一步改变了肝癌细胞周围的微环境，为肝癌的发展提供了有利条件。
3. 胆汁酸胆汁酸在肝癌的发生中起到重要作用。
胆汁酸通过受体TGR5的激活，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，从而促进肝癌的发展。
4. 免疫调节异常肝癌发展过程中，免疫系统在肿瘤的识别和清除中起到重要作用。
免疫调节异常会使肿瘤细胞逃避免疫清除，促进肝癌的发生和进展。
基因突变与癌症遗传学研究
基因突变与癌症遗传学研究近年来，基因突变与癌症的关系越来越引起人们的关注。
许多科学家都投入了大量的时间和精力在这方面的研究中。
在这篇文章中，我们将探讨基因突变与癌症遗传学之间的关系，以及一些最近的研究成果。
一、基因突变是什么基因突变是指基因序列的改变。
这个改变可以发生在单个的核苷酸上，也可以是一组核苷酸。
相对于正常的DNA序列，基因突变会带来一些不同的表现，这种表现可以是单一的，也可以是复杂的。
基因突变可能是遗传的，也可能是后天的。
二、基因突变和癌症基因突变是癌症发展的关键因素之一。
癌症是一种由正常细胞异常生长形成的疾病。
它是由基因突变导致的，这些突变可能发生在单个细胞或染色体水平上。
每个人都有一些基因缺陷，但通常我们的正常细胞可以修复这些缺陷。
然而，当一些重要的基因发生了突变并且无法被修复时，它们可能会变成癌细胞，导致癌症的生长和扩散。
癌细胞可以通过正常细胞从血液或淋巴系统中发散，并在身体中的其他部位生长。
三、癌症遗传学癌症遗传学是一门研究人类癌症基因变异的分支学科，它向我们揭示了基因突变对癌症的形成和发展具有的关键作用。
严格来讲，大多数癌症并非遗传形的。
婴儿时期已开始发展的先天遗传突变和生活方式还有环境多个因素共同决定着癌症的形成。
然而，某些人群中癌症的罹患率要高于其他人群。
例如，家族中有癌症的人患癌症的风险比较高，这是因为他们可能携带着一些癌症易感基因的突变。
这些易感基因能够影响DNA修复或者细胞分裂周期等的生物学过程。
如果这些基因中的任何一个突变发生在一个个体身上，那么这个体内的细胞就有可能发展成癌细胞。
四、目前的研究进展最近的癌症遗传学研究显示，仅有100个基因中的突变就足以导致稳定的肿瘤形成。
这些稳定的肿瘤能够被识别，也可以在早期阶段被治疗。
这种新的认知为肿瘤治疗开发提供了更可靠的基础。
与此同时，新的基因诊断技术也正在不断发展。
这些技术包括基于DNA突变的基因检测和肿瘤测序技术等。
许多癌症研究人员使用这些技术来鉴定肿瘤中的基因变异，并寻求针对这些变异的治疗方法。
基因突变与癌症的发生机制
基因突变与癌症的发生机制当我们说起癌症时，我们不可避免地谈到基因突变。
基因突变是沉默危机，它可能会导致尚未开展的疾病，例如癌症，以各种不同的方式影响我们的健康。
然而，我们很少了解基因突变的过程和机制。
基因突变是指DNA序列发生的改变，这种改变可能导致基因的功能发生改变，或导致突变的细胞或组织表现出异常行为。
癌症细胞的大多数突变起源于正常细胞穿过生长和分裂周期的误差。
在正常细胞中，基因突变是通过许多机制控制的，从而保持系统的稳定性，但是，在某些条件下，这些机制具有失效的趋势。
如何引发这些故障，以及如何断定它们在哪些基因中不可避免地突变，这仍然是研究人员正尝试回答的问题之一。
癌症的原因是什么？癌症的发展不是单一的，而是在细胞生命的各个点和阶段的复杂互动中发生的。
癌症通常被认为是细胞在以下条件下不断增殖形成的肿瘤：1.未能成熟为相应的成熟细胞。
2.失去了正常细胞停止增殖的能力。
在细胞的某些成分中产生了突变。
这些变异产生了细胞的异常行为，使它们不再遵循其生长和分裂期限制。
这些条件可以被正常细胞中的许多机制修复，例如基因组稳定性机制，DNA修复机制和细胞凋亡机制。
如果它们失去了功能，细胞可能会演变成癌症细胞。
癌细胞的基因突变是如何形成的？细胞突变是由各种生物和非生物性质引起的，包括DNA的自然和工业化损伤和环境因素，例如辐射和化学物质。
然而，细胞保护机制能够纠正这些损伤，重建损坏的DNA序列。
然而，在大多数癌细胞中，基因突变被认为是由DNA修复机制中的失误引起的。
这些机制由复杂的基因组稳定性机制控制，包括通过DNA复制附近DNA损伤的基因表达。
这些损伤在每个细胞分裂周期中都必须被修复，否则细胞将失去其重要的组织功能。
显然，在这个过程中产生的一个突变会导致细胞失去其正常的生长和分裂机制。
此外，对于癌症来说，还存在其他因素影响细胞和组织，例如：1.细胞基因组内的共生病原体。
2.损毁与生产细胞有关的确定性基因。
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论著（基础研究）HBV X 基因突变促进肝癌发生的生物学机制张琪，唐慧娴，韩一芳，叶福强，王太武，吕恒，张锦海［摘要］目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X 基因(HBx)羧基末端四个突变位点C1653T 、T1753C 及A1762T/G1764A 致癌的生物学机制。
方法利用体外基因合成和定点突变构建野生型和复合突变型HBx 重组质粒，转染至人肝癌细胞HepG2筛选稳定表达细胞株。
通过绘制细胞生长曲线（CCK8法）、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell 侵袭实验比较转染空载体(Vector)、野生型HBx(WT)和突变型HBx(Combo)细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
结果细胞生长曲线结果显示WT 和Combo细胞的生长速率明显快于Vector （P <0.01），但WT 和Combo 之间差异无统计学意义（P >0.05）。
平板克隆形成实验结果提示Combo 细胞的克隆形成率显著高于WT （31.90%vs 16.00%，P <0.01），而WT 略高于Vector(12.46%，P <0.05）。
划痕实验结果显示Combo 细胞48h 迁移距离显著高于WT 细胞（P <0.01），而WT 细胞显著高于Vector 细胞（P <0.01）。
Transwell 侵袭实验结果显示Combo 细胞穿过小室的细胞数最多[（227.80±17.85）个]，其次为WT 细胞[（181.75±10.06）个]，Vector 细胞最少[（85.72±3.19）个]，三者两两比较差异均有统计学意义（P <0.05）。
结论野生型和突变型HBx 均可显著增强HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且突变型HBx 促进细胞恶性生物学行为的能力显著强于野生型HBx ，这为明确HBV 致癌机制提供了一定的依据。
［关键词］HBV X 基因；病毒突变；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭［中图分类号］R373.2［文献标志码］A［文章编号］1672⁃271X（2019）04⁃0337⁃06［DOI ］10.3969/j.issn.1672⁃271X.2019.04.001Biological mechanisms of HBV X gene mutations in promoting hepatocellular carcinomaZHANG Qi 1，TANG Hui⁃xian 2，HAN Yi⁃fang 1，YE Fu⁃qiang 1，WANG Tai⁃wu 1，LÜHeng 1，ZHANG Jin⁃hai 1（1.Center for Disease Control and Prevention of Eastern Theater Command ，Nanjing 210002，Jiangsu ，China ；2.School of Pharmacy ，China Pharmaceutical University ，Nanjing 211198，Jiangsu ，China ）［Abstract ］ObjectiveTo explore the biological functions of four mutations （C1653T ，T1753C ，and A1762T/G1764A ）locat⁃ing in the C⁃terminal region of hepatitis B virus （HBV ）X gene （HBx ）in hepatocarcinogenesis.MethodsRecombinant constructscontaining wild⁃type and compound mutations of HBx were constructed by gene synthesis and site⁃directed mutagenesis.Stable trans⁃fection was carried out in human hepatoma cell line K⁃8assay was used to draw the growth curves of the transfected cells.The proliferation ，migration ，and invasion abilities of cells transfected with empty vector （Vector ），wild⁃type HBx （WT ），and com⁃pound mutations of HBx （Combo ）were evaluated by colony formation assay ，wound healing assay ，and transwell method.ResultsCell growth curves revealed that the growth rates of WT and Combo cells were significantly higher than that of Vector cells （P <0.01），but there was no difference between WT and Combo cells （P >0.05）.The colony formation rate of Combo cells （31.90%）was signifi⁃cantly higher than that of WT cells （16.00%）（P <0.01），while it was slightly higher for WT cells when compared to Vector cells（12.46%）（P <0.05）.Wound healing assay showed that the migration distance of Combo cells in 48h was significantly higher than WTcells （P <0.01），while it was significantly higher in WT cellsthan that in Vector cells （P <0.01）.Similarly ，transwell assay turned out that the most number of invasive cells was observed in Combo cells （227.80±17.85），followed by WT cells （181.75±10.06），and then Vector cells （85.72±3.19），and the differenc⁃es between the three groups were all significant （P <0.05）.基金项目：江苏省自然科学基金(BK20150094)作者单位：210002南京，东部战区疾病预防控制中心（张琪、韩一芳、叶福强、王太武、吕恒、张锦海）；211198南京，中国药科大学药学院（唐慧娴）通信作者：张锦海，E -mail ：ahoi@Conclusion Wild⁃type and mutated HBx can both significantly enhance the proliferation，migration，and invasion ability of HepG2 cells，and the mutational HBx can further strengthen malignant biological behavior than wile⁃type HBx，which provided evidence for the mechanism of HBV⁃induced hepatocarcinogenesis.［Key words］hepatitis B virus X gene；viral mutation；cell proliferation；cell migration；cell invasion0引言肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，在我国约80%～90%的肝细胞癌是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染导致的［1］。
HBV X基因（核苷酸位点1374～1838）编码的HBx蛋白是病毒分泌的包含154个氨基酸的一个多功能调节蛋白，和肝细胞的恶性转化密切相关［2⁃3］。
流行病学研究发现，HBx区突变可显著增加肝癌的发生风险［4⁃6］，体外功能研究提示HBx可能通过多位点联合突变的形式促使细胞发生恶性转化［7⁃8］，然而对于哪些位点突变才是促进肝癌发生过程中的关键突变尚未明确。
C1653T（H94Y）、T1753C（I127T）及A1762T/G1764A（K130M/V131I）是位于HBx基因羧基末端和核心启动子（basal core promoter，BCP）区重叠区域的四个突变，多个研究已证实这些突变位点与HCC的发生发展具有密切的联系，是HCC发展的独立危险因素，可作为联合检测肝癌的指标［9⁃10］，然而这四个突变位点致癌的生物学机制尚不清楚。
因此，本研究通过体外构建包含C1653T、T1753C及A1762T/G1764A四个突变位点的真核表达载体来探究HBx区联合突变对肝癌细胞恶性生物学行为的影响，探索HBV突变的致癌机制。
1材料与方法1.1实验材料pcDNA3.1/myc⁃His（⁃）B载体、Lipo⁃fectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。
快速定点突变试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司。
DMEM培养基、胎牛血清、青霉素⁃链霉素双抗购自美国Gibco公司。
96孔板、6孔板和Transwell 小室购自美国康宁公司。
结晶紫染色液、Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂、姬姆萨快速染色试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
1.2方法1.2.1质粒构建体外合成C2型HBV的HBx基因野生型序列，并通过XhoI及KpnI酶切位点克隆至真核表达载体pcDNA3.1/myc⁃His（⁃）B，通过测序验证重组质粒的正确性。
设计C1653T、T1753C及A1762T/G1764A的定点突变引物，见表1，利用快速定点突变试剂盒对野生型重组质粒分别进行定点突变，构建包含4个突变位点的突变型重组质粒，测序验证其正确性。