微生物发酵生产十二碳、十三碳和十五碳二元酸
十二碳二元酸发酵研究
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刘树臣等： 十二碳二元酸发酵研究
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结果和讨论
菌体浓度对产酸的影响 从微生物发酵产物生成动力学角度分析， 产物生成速度与菌体浓度变化速率以及菌体浓度呈正比
例变化， 然而， 当菌体浓度过高时可能由于供氧不足等因素导致菌体产酸能力下降。为此， 本文考察了 菌体浓度对产酸的影响， 六批发酵结果表明： 菌体浓度 （ !" ） 在 #$%&’()* + ,’%-.()* 之间的平均产酸量为 而 !" 在 #0%-0()* + #.%#.()* 时的平均产酸量为 #00%’()*， 较前者平均产酸量增长了 .%’1 ， 这 #/.%’()*， 说明低菌浓发酵时单位质量菌体的产酸能力或比产酸速率 （ 23 ） 有所提高， 可能与保持一定的供氧水平 有关。为此， 本文分析了在发酵过程中的 !" 与溶解氧 （ 45） 、 结果见表 #。当培养基中 !3 和 23 的关系， 培养 7.8 达到最大值， 而以 6!#- 为诱导烃时培养 /&8 达到最大 含有诱导烃 6!#, 时菌体生长较为缓慢，
十二碳二元酸发酵研究
刘树臣 李淑兰 金 平 方向晨
（抚顺石油化工研究院 抚顺 %%>$$%）
关键词： !"#$%$" &’()%*"+%, ，十二碳二元酸，发酵 中图分类号： ?@%A 文献标识码： B 文章编号： $$$%3#"$1（"$$"） $#3$C!@3$>
长链二元酸 （ (’9<3,8459 =5,4/.’DE(5, 4,5=， 是指 F%$ 以上的脂肪族二元羧酸。它们是一类重要的精 *FB） 细化工原料， 广泛用于大环麝香、 工程塑料、 耐寒增塑剂、 尼龙纤维、 热熔胶以及液晶的合成， 也是医药和 农药合成的原料。其中十二碳二元酸 （*FB%"） 市场需求量较大， 主要用于合成高级工程塑料尼龙 %"%"、 服装用尼龙热熔胶和高级涂料等， 目前由化学法和发酵法生产。由于发酵法其原料来源容易、 生产条件
长链二元酸的生物合成
长链二元酸发酵
种子罐培养
石油发酵生产长链二元酸的过程中，一般采用二 级种子罐培养。 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体， 培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条 件从有利于长茵考虑。 为了发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子 ANK
长二元酸生产状况
长链二元酸生物合成
长链二元酸的合成工艺主要包括：
（1）菌种培养
（2）摇瓶种子 （3）种子罐培养
（4）发酵罐培养
长链二元酸生物合成原理
目前主要通过热带假丝酵母代谢烷烃来 产生长链二元酸。
长链二元酸生产选育
菌种选育
1、自然界筛选得到的热带假丝酵母野生菌株产酸水平 低，而且都是10个碳以下的短链混合二元酸，进过多 次诱变筛选等手段选育而得，可以氧化癸烷到十八烷 的正烷烃生成相应链长的长链二元酸。 2、培育出既有高活力ω-氧化又具有低活力β-氧化的优 良菌株。
长链二元酸提取
发酵液预处理：
加入破乳剂（尿素），杀死菌体，使发酵液分层:烷烃 层、乳化层、清夜层和菌体沉降层。静置除去残油；利用 离心或膜过滤法分离菌体、二元酸清液及发酵残余的底物。
二元酸精提：
（1）水相法 (2) 溶剂法 (3) 酯化法
长链二元酸提取
二元酸精提 (1)水相法
1)将长链二元酸粗产品加热熔融，然后加入吸附剂吸 附杂质，保温过滤出吸附剂后降温结晶得到精制长链二元 酸产品。 2)通过长链二元酸单盐结晶步骤有效地降低产品中蛋 白质和色素等杂质含量，并结合菌体分离、酸析结晶和干 燥等步骤，精制长链二元酸产品。
长链二元酸生物合成
作者：依一
长链二酸
长链二元酸是指含有10个以上碳原子的直链二羧酸HOOC-(CH2)nCOOH(n9～18)，是一类用途广泛和重要的精细化工原料，是合成 麝香-T、共聚酰胺热熔胶、尼龙工程塑料等特殊用品的主要原料。 长链二元酸在自然界是不存在的，目前生产这种产品的主要方法 有化学合成法和生物发酵法两种。目前，国外生产长链二元酸主 要利用化学合成法，但其合成条件苛刻（高温高压），而且化学 合成法生产长链二元酸目前只能生产到十二碳二元酸。从理论上 来说，二元酸中含有的碳原子越多，就意味着材料的柔韧性越好， 防腐蚀、抗紫外线的能力越强。 作为精细化工的重要原料，长链二元酸的生产技术目前只有美国、 德国、日本和中国掌握。我国是目前唯一应用微生物发酵技术实 现多种长碳链二元酸大规模工业化生产的国家。
十二碳二元酸发酵工艺的研究
十二碳二元酸发酵工艺的研究摘要：以10L小试罐为基础，探讨了发酵法生产十二碳二元酸过程中，接种量、温度、pH 值、搅拌速度、通风量、溶氧对发酵产酸的影响，通过优化发酵条件提高发酵产酸量，并在50m3发酵罐扩大培养验证，批次产酸量、发酵周期、烷烃转化率都得到有效提高。
关键词：发酵；十二碳二元酸；工艺条件十二碳二元酸（简称DCA12），是一类重要的精细化工原料，被广泛应用于制造高性能尼龙工程塑料、高档热熔胶、高温电解质、高级润滑油、高级油漆和高级涂料等。
由于长链二元酸在自然界中不单独存在，先后有化学法和生物发酵法两种方法制取，但化学法存在高温、高压、需防火防爆，存在工艺复杂、条件苛刻等不利因素，不具有生产价值，而生产条件温和、工艺简单、成本低的生物发酵法开始大规模应用[1-3]。
本研究从工艺角度出发，通过优化发酵工艺条件来提高DCA12产量和烷烃转化率，从而降低成本，提高装置经济效益。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种热带假丝酵母FD-2，由本单位菌种室提供。
1.1.2仪器与试剂仪器：磁力搅拌器、电子天平、数显恒温水浴锅、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、分光光度计、高速离心机、显微镜、超净工作台试剂：正十二碳烷烃、酵母膏、糖蜜、尿素、麦芽汁、MgSO4.7H2O、NaCl、 (NH4)2SO4（试剂均为分析纯AR）。
1.1.3培养基斜面培养基：麦芽汁（Brix10），琼脂（3.0%）；种子培养基：酵母膏9g，糖蜜8g，尿素3g， NaCl 3g，(NH4)2SO4 1g，pH自然；发酵培养基：MgSO4.7H2O 2g，NaCl 9g，酵母膏10g，糖蜜8g，尿素3g，(NH4)2SO4 5g，pH自然。
1.2培养方法菌种斜面培养：摇瓶1.3测定方法1.3.1菌体浓度（OD）的测定：将菌体浓度稀释40倍，在550nm下测定光密度值。
1.3.2十二碳二元酸提取与测定：采用酸碱沉淀法，取一定量发酵液用10mol/L NaOH溶液调节pH值至10，经热处理后倒入离心管离心去除菌体，用9mol/L盐酸调pH值至2，加热后过滤得滤饼，洗涤至中性，用98%乙醇溶解滤饼，以酚酞作为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
长链二元酸发酵生产菌种和技术
长链二元酸发酵生产菌种和技术
长链二元酸（DCAi）是一类重要的化工原料，可用于合成人工麝香类香料、尼龙、工程塑料、热熔胶、树脂、高级润滑油、耐寒增塑剂及液晶等物质，十二个碳以上的长链二元酸在自然界中不存在，目前微生物石油发酵法是目前长链二元酸制备方法中最具优势的方法。
十一碳二酸用于聚酰胺工程塑料，是尼龙1011、尼龙611的主要原料，还用于高档热熔胶、高档润滑剂；十二碳二酸主要用于聚酰胺高档工程塑料，是尼1212、尼龙612的主要原料，还可用于高级香料中间体、高档润滑剂、高档防锈剂、高档粉末涂料、热熔胶合成纤维以及其他聚合物和防腐剂；十三碳二酸用于合成香料；十四碳二酸在粉末涂料和香料行业中有其独特用途，而且还可开发新的聚合物产品；十五碳二酸主要用于香料行业和制药行业，可用于合成十五酮、环十五内酯和人造麝香，可以替代天然麝香配制各种名贵中成药，具有抗菌消炎，通经活血等疗效；十六碳二酸具有十二碳二酸的所有功能，也可用于粉末涂料和香料行业。
由于长链二元酸的下游产品的开发潜力广阔，国内长链二元酸的需求量将不断增加，其市场潜力极大。
各二元酸技术水平如下：。
长链二元酸篇
长链二元酸篇长链二元酸在自然界中不单独存在，其主要来源有３种：（１）植物油裂解制取该途径只能获得十三碳二元酸（ＤＣ１３）和十五碳二元酸（ＤＣ１５）。
从菜籽油中提取出甘油芥酸酯，然后用臭氧氧化裂解制取ＤＣ１３，纯度只有７０％；从蒜头果油中提取出脑神经酸，再经裂解可制取ＤＣ１５。
由于两者都受农田和气候等条件的限制，产量不大。
（２）化学合成法生产十二碳二元酸（ＤＣ１２）可以石油化工产品丁二烯为原料进行化学合成，但它需要高温高压和催化剂，又需防火防爆和防毒设备，条件苛刻、步骤多、收率低、成本高，环境污染严重，美国杜邦公司在化工合成ＤＣ１２时曾发生过爆炸。
而其他长链二元酸至今还没有经济可行的化学合成法来进行生产。
（３）生物合成法生产利用微生物特有的氧化能力，通过微生物细胞内酶的催化作用，在常温常压下，氧化石油副产物中各种正构烷烃［ＣＨ３－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３，ｎ＝９～１６］两端的２个甲基，一步加上４个氧原子，生成相应链长的各种长链二元酸。
此法不但开辟了长链二元酸的新来源，弥补了化学合成法的不足，而且条件温和，成本低，尤其不造成环境污染，具有化学合成法无可比拟的优越性，是一种绿色产业。
生物合成长链二元酸研究进展２０世纪７０年代微生物氧化正构烷烃生产长链二元酸开始进入应用研究阶段，产酸水平只达到６０～８０ｇ／Ｌ；８０年代开始小规模工业生产，产酸水平提高到１２０～１３０ｇ／Ｌ，日本首先建成２００ｔ／ａ的生产厂。
９０年代生物法制取长链二元酸的应用研究和开发取得突破性进展，多种长链二元酸完成中试和工业生产试验，发酵产酸水平突破１５０ｇ／Ｌ，达到２００ｇ／Ｌ，我国率先建起了千吨级规模的发酵工厂。
进入２１世纪以来，长链二元酸的开发研究又有了新进展，目前产酸水平已经达到２５０ｇ／Ｌ以上。
在长链二元酸的应用开发中，９０年代中期起，我国超过日本处于国际领先地位。
中国科学院微生物研究所先后完成了微生物发酵生产ＤＣ１５的２．５ｍ３发酵罐规模中试和微生物发酵生产ＤＣ１２的２０ｍ３发酵罐规模的工业生产试验研究，发酵产酸水平ＤＣ１５为１７０～１８０ｇ／Ｌ，而ＤＣ１２为１８０～２００ｇ／Ｌ。
长碳链二元酸概况
长链二元酸系列产品概况长碳链二元酸一般是指碳10以上的直链烷-α， ω-二羧酸。
我公司以石油副产品（正构烷烃）为原料，利用微生物发酵以不同碳链长度的正构烷烃生产相应不同碳链长度的二元酸，经过膜过滤、脱色、酸化、结晶等得到粗品二元酸，粗品二元酸加入溶剂(醋酸)溶解后，经脱色之后再进行结晶、离心、干燥、冷却、包装后得成品二元酸。
主要产品有：1、十一碳二元酸结构式:主要用于聚酰胺高档工程塑料。
该产品是尼龙1011、尼龙611的主要原料，还可作为高档热熔胶、高档润滑剂和合成麝香的重要原料。
2、十二碳二元酸：又称，1,12－十二烷二酸 、月桂二酸、十二烷二酸结构式：主要用于聚酰胺高档工程塑料，该产品是尼龙1212、尼龙612、高档润滑油、高档防锈剂、高级粉末涂料、热熔胶以及其它聚合物的主要原料。
3、十三碳二元酸结构式：主要用于制备高级香料及麝香T、热熔胶及其它黏合剂，该产品也是高档尼龙1313的主要原料。
4、十四碳二元酸结构式：它具有十二碳二元酸的所有功能，尤其在粉末涂料和香料行业中有其独特性能，还可以开发新的聚合物产品。
研发产品（酯类油）介绍酯类油的分子中都含有酯基官能团-ＣＯＯＲ＇。
根据分子中的酯基多少和位置，研发主要针对酯类油中的双酯进行。
常用的双酯是以二元羧酸一元醇反应制得的酯称为双酯，其化学结构通式为：1.酯类油的特性1)良好的粘温特性酯类油的粘温特性良好，粘度指数较高。
加长酯分子的主链，粘度增大，粘度指数增高。
主链长度相同时，带侧链的粘度较大，粘度指数较低；带芳基侧链的，粘度指数更低。
双酯中常用的癸二酸酯、壬二酸酯的粘度指数均在１５０以上。
2)低温性能好双酯中带支链醇的，通常具有较低的凝点，常用癸二酸酯和壬二酸酯的凝点均为－６０°Ｃ以下。
同一类型的酯，随着分子量的增加而低温粘度增加。
酯化不完全，部分羟基的存在，会使酯的低温低温粘度明显增加。
3)良好的高温性能润滑的闪点和蒸发度影响油品在使用中的油耗、使用寿命和使用安全性，与其分子组成有关。
十二碳二元酸(DDDA)的几种生产工艺
十二碳二元酸又名十二双酸，月桂二酸，是一种用途极为广泛的精细化工原料，是制造高级香料、高级尼龙工程塑料PA612及PA1212、高档热熔胶、金属切削液防锈剂、高温电解质、高级润滑油、高级油漆和涂料、耐寒增塑剂、医药和农药的重要原料、作为高级尼龙工程塑料，利用其抗拉耐磨的特性可改善各种轮胎的性能，能使目前轮胎的寿命提高5-10倍。
在金属切削液中作代替无机防锈剂使用，能够在低浓度、无毒和可生物降解等条件下达到有效的防锈效果。
用十二碳二元酸合成的二酯可用作喷气式飞机发动机的高级润滑油，目前我国这种高级润滑油全部依赖进口。
十二碳二元酸在自然界中不存在，当前生产工艺主要有化学合成法（国外一般采用该法）和生物发酵法（国内采用）两种。
丁二烯法：工业上的合成方法一般采用高温、高压、催化剂，例如，以丁二烯为原料法，其工艺复杂、条件苛刻、步骤多、收率低。
美国杜邦公司（现英威达）以丁二烯为原料，化工合成十二碳二元酸，曾在生产过程中发生爆炸。
生物发酵法：目前应用生物工程技术，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下发酵石油中的正十二烷，能生产出十二碳二元酸，但也存在设备投资大、同系物较多、蛋白质残留较重、后处理难度大等不足。
环己酮氧化法：以日本宇部兴产株式会社采用该法，即以环己酮为原料通过过氧化氢氧化制得。
该方法具有路线短、工艺简单、产品组分单一、产物十二碳二元酸纯度高等优点。
参考文献：陈勇.环己酮氧化制备十二碳二元酸[J].应用化工，2010,39（4）.
资料编辑：baidu搜“高化学株式会社广州事务所”何生。
一种发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法[发明专利]
![一种发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/df59336084868762cbaed50c.png)
专利名称：一种发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：徐敏,郝英利,杨晨,李乃强,刘修才
申请号：CN201810734139.7
申请日：20180706
公开号：CN110684809A
公开日：
20200114
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及十二碳二元酸产品及其制备方法，特别涉及发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法。
一种发酵法生产的十二碳二元酸产品，其中十碳二元酸杂质含量低于300ppm。
该十二碳二元酸产品的发酵生产方法，包括发酵过程，所述发酵过程包括发酵转化期，其中，在所述发酵转化期加入葡萄糖、葡萄糖溶液、蔗糖和蔗糖溶液中的一种或多种。
所披露的十二碳二元酸产品通过微生物发酵法制得，通过披露的制备方法，可得到纯度更高、杂质含量尤其是十碳二元酸杂质含量更低的十二碳二元酸产品。
高纯度、低十碳二元酸杂质含量的十二碳二元酸产品满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求，所得的聚合物产品性能更加优异。
申请人：上海凯赛生物技术股份有限公司,CIBT美国公司
地址：201203 上海市自由贸易试验区蔡伦路1690号5幢4楼
国籍：CN
代理机构：北京律智知识产权代理有限公司
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成果名称：微生物发酵生产十二碳、十三碳和十五碳二元酸
目的用途：十个碳以上的长链二元酸是一类用途广泛和重要的精细化工产品，是化工上合成一系列高档产品的重要原材料。
十二碳二元酸（ＤＣｌ２）是化工上合成高性能尼龙工程塑料尼龙１２１２，高档服装用尼龙热熔胶和高级涂料及油漆等的重要原材料。
十三碳二元酸（ＤＣＩ３）是化工上合成麝香Ｔ和尼龙工程塑料尼龙１３１３等的重要原料。
十五碳二元酸（ＤＣＩ５）是化工上合成高级麝香香料一环ｔ五酮和麝香酮（即３．甲基．环１一五酮）等的重要原材料。
麝香酮是天然麝香中具有生理活性的主要有效成分之一，可以替代天然麝香配制中成药，我国有３００多种中成药需要麝香配伍。
这些长链二元酸自然界中不存在，化工方法难以合成，而微生物发酵生产，开辟了长链二元酸的新来源，为用途广泛的高性能尼龙工程塑料，高档尼龙热熔胶，高级香料和粉末涂料的产业化生产提供物美价廉的丰富原材利。
我们通过二’Ｆ多年的努力，做了大量的诱变筛选上作，不断创新，不断提高，尤其通过国家“八五”和“九五”利技攻关，培育出三株商产卣株，建立了高效简便的工艺条件，使微生物发酵生产ＤＣｌ２、ＤＣ．３和ＤＣｌ５三种二元酸达到工业化生产程度，技术成熟，发酵产酸水平达到１８０～２００２几，产品质量好，符合应用单位要求，经专家鉴定，总体技术水平为国际领先。
获三项国家发明专利，获多项国家奖和科学院发明奖。
市场价格：ＤＣｌ２为６～６５万元／吨，ＤＣｌ３为７～８万元／吨，ＤＣｌ５为１５一１６万元／吨。
产品成本：ＤＣｌ２和ＤＣｌ３为３～３５万元／吨，ＤＣｌ５为６～７万元／Ⅱ屯。
转让费：面议
单位：中国科学院微生物研究所
地址：北京市海淀区中关村北一条１３号
联系人：陈远童
传真号：０１０－－－８２６２６２０８电话：０１０－－６２５５４３８７
邮编：１０００８０。