pGEX-His使用说明
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
第六章抗体的表达
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也 主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达
PGX-操作手册-C
PGX型接触角型表面张力仪操作手册版本：3.4目录1.打开仪器包装2.技术要求3.安装PGX操作软件4. 校正和确认4.1 校正板和2个钢球：4.2 校正板带1个钢球：4.3 确认步骤5.装配PGX仪器5.1准备标本5.2 特殊标本5.3泵分配器6.杂项6.1样品制备6.2建立一个测试6.3设备储存6.4运输7.测试模式7.1静态模式的应用7.2静态模式的自动测试7.3动态模式滴落应用7.4动态模式中的自动测试7.5检测前进/后退接触角8.报道9. 袖珍接触角方案9.1图像控制面板9.2主程序9.3静态模式9.4 动态模式9.5 在静态/动态模式手动测试9.6 前进模式9.7 超低接触角9.8 查看模式9.9 表面张力9.10 表面“自由”能（SFE）9.11 选择屏幕9.12 加强模式9.13 基线测定9.14 相机增益和阈值9.15 视野限制9.16 使用其它测试液体来确定“表面自由能”9.17 用户界面的翻译9.18 系统参数（选择菜单）10．消耗品11 故障排除附录：A.1 推荐液滴尺寸大小：A.2 检测动态模式下的液滴：B.1 经验性问题：C.1 表面能量换算表：D.1 更换泵管D.2 调整泵容量：D.3 低于0.5 μl的小液滴：重要提示(关于相机芯片ST672 and ST676)：PGX型仪器所用的原始相机芯片ST672通过透明导线的USB接口转换来实现。
后来该芯片被ST676所替代，被换成黑色USB导线。
ST676能提供ST672所没有的一些功能。
PG 系列的软件能支持这两个芯片，它能自动在您的仪器里识别。
两者的不同之处可通过相关文件来描述；1.打开仪器包装：仪器箱子里面有以下组成部分：仪器主机1个；英文操作手册1本；CD软件1个；微量注射器1个；校正板1个；玻璃瓶1个；2.技术要求：PGX操作软件可在以下Windows环境下使用：Windows98，Windows2000，Windows XP，Windows ME；图1.2 PGX配件包请注意：PGX仪器不能在Windows NT下安装，因为Windows NT操作系统不支持USB接口应用；3.安装PGX操作软件：该CD软件被放在仪器主机的下面；请注意：即使Windows建议，也不允许从网络中下载任何相机的驱动程序，因为这样的话仪器运行不具有可靠性；请注意：只有在软件安装完毕后，才允许将PGX仪器主机上USB接口插在电脑上；否则，Windows将选择别的驱动器，其结果不可预测；a)往电脑中插入CD来安装操作软件，可根据界面的提示操作。
X4使用说明
Impulse X4 系列便携式复合气体检测仪操作说明书！重要提示：！在首次使用仪器以前请认真阅读本手册，您将会掌握仪器正确的使用方法和了解仪器的功能，包括操作，维护，功能设置等内容。
！为了使操作者更安全，请按照手册中的要求，定期对仪器进行标定。
！如果在使用过程中，遇到的故障或问题在本手册中没有提到，请直接联系制造商Zellweger Analytics，或联系当地的代理商/服务商。
！警告和注意：·更换任何元器件都有可能损坏仪器的本质安全结构。
·如果需要使用存储卡，请选用Zellweger Analytics 提供的存储卡（订货号2566-0435），使用其它的存储卡有可能损坏仪器的本质安全结构。
·在允许的储存期之后激活检测器，有可能影响仪器的使用性能和保质期。
·应使用许可的5号干电池，如劲量电池，不要使用质量低下的干电池，以免影响仪器的本质安全性能。
·在更换电池时，应同时更换2节型号相同的新电池。
·在电池欠压提示后，应尽快更换新电池，以免旧电池漏液损坏仪器。
·在低温环境下，电池的寿命会缩短。
·更换电池时，应该在安全环境下进行。
·当更换任何一个传感器的情况下，都需要对仪器进行标定。
·在每天使用以前，应完成仪器的自检过程。
·定期的对仪器用标气进行测试，检查声、光、振动报警是否正常。
·标定时应选用厂家或国家认证合格企业提供的标准气体。
·标定时应在良好通风的环境下进行，以避免污染。
·不要在仪器电量不足的情况下标定。
·不要在富氧的环境下使用本仪器。
·可燃气体传感器的灵敏度会受到高浓度硫化物，卤素化合物，含硅化合物，以及含铅气体或蒸汽的影响，也叫“中毒”，应避免在以上的环境中使用仪器，如果必须使用，则使用完后应对仪器进行检测和标定，以免影响以后的使用。
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常用载体与引物查询表
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重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)
三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。
（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心15 min，收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。
质粒图谱大全
转载一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKSL4440pCAMBIA-1301pGD926三.PET系列表达载体ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystem33b ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystems ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpressionProkaryoticExpression ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETVectorDNA ProteinPurificationPurificationSystemsStrepTactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体-pPICZalphaA pGAPZαApBI121pEGFP-N1 pEGFP-C1pPIC9K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体;一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点;原核生物DNA分子中只有一个复制起始点;而真核生物DNA分子有多个复制起始位点;抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp ,Kan多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms终止信号加polyA信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置,了解质粒的类型原核/真核/穿梭质粒第二步：再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记;1Ampr水解β－内酰胺环,解除氨苄的毒性;2tetr可以阻止四环素进入细胞;3camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性;4neorkanr氨基糖苷磷酸转移酶使G418长那霉素衍生物失活5hygr使潮霉素β失活;第三步：看多克隆位点MCS;它具有多个限制酶的单一切点;便于外源基因的插入;如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选;决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因;第四步：再看外源DNA插入片段大小;质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段;一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低;第五步：是否含有表达系统元件,即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号;这是用来区别克隆载体与表达载体;克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体;选用那种载体,还是要以实验目的为准绳;启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA 分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录;增强子/沉默子－为真核基因组包括真核病毒基因组中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序;其作用与增强子所在的位置或方向无关;即在所调控基因上游或下游均可发挥作用;/沉默子－负增强子,负调控序列;核糖体结合位点/起始密码/SD序列Rbs/AGU/SDs：mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG起始密码和SD序列;转录终止顺序终止子/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down－stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成polyA加尾信号;结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down－stream有一段GT或T 富丰区,这2部分共同构成polyA加尾信号;回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识虽然课本上都有写1. 什么是载体即要把一个有用的基因目的基因——研究或应用基因通过基因工程手段送到生物细胞受体细胞,需要运载工具交通工具携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体vector;.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类―――按功能分成：1克隆载体都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增;它是用来克隆和扩增DNA片段基因的载体;所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨行载体2表达载体具有克隆载体的基本元件ori,Ampr,Mcs等还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体;―――按进入受体细胞类型分：1原核载体2真核载体3穿梭载体sbuttlevector指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间..穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增;3. 基因工程载体的3个特点：一都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样;二都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活;三都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来;4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点;如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体;载体选择主要考虑下述3点：1构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体;2.载体的类型：1克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小大选大,小选小;如<10kb选质粒;2表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭,哺乳类细胞表达载体;3对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考;3载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位;选用质粒最常用做载体的4点要求：①选分子量小的质粒,即小载体1－→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多也有大载体；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个;③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地；④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr试一试;无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。