酶工程实验大纲
酶工程教学大纲
标题：酶工程教学大纲引言：酶工程是将酶的特性与工程原理相结合，应用于生物技术和工业生产中的一门学科。
它涉及酶的分离纯化、活性检测、酶动力学研究和酶反应工程等内容。
鉴于酶工程在现代生物技术和工业领域的广泛应用，培养具备相关专业知识和技能的人才显得尤为重要。
一、课程目的本课程旨在使学生了解酶的基本原理、方法和应用，培养其掌握酶的分离纯化、活性检测和酶反应工程的能力，并能将其应用于生物技术和工业生产中。
二、教学内容1. 酶的基本原理- 酶的定义与分类- 酶的结构与功能- 酶的催化机理2. 酶的分离纯化- 细胞破碎与酶的释放- 酶的分离与纯化方法- 酶的纯化评价指标3. 酶的活性检测方法- 酶活性的测定原理- 酶活性检测的常用方法- 酶抑制剂的筛选与应用4. 酶动力学研究- Michaelis-Menten方程与酶动力学参数- 受抑制和受激动的酶反应- 酶动力学实验与数据处理5. 酶反应工程- 酶反应的工程原理- 酶反应的优化方法- 酶反应的规模化与工业应用三、教学方法本课程将采用多种教学方法相结合，包括理论讲解、案例分析、实验操作、小组讨论等。
理论讲解部分将通过授课和教材阅读进行，案例分析和小组讨论将有助于学生理解酶工程在实际应用中的问题和解决方法。
实验操作将培养学生的实践能力和团队合作精神。
四、教学评估教学评估将以平时作业、实验报告、期中考试和期末考试等方式进行。
平时作业和实验报告将考察学生对课堂理论的掌握程度以及实际操作能力，期中考试和期末考试将全面评估学生对课程内容的理解与掌握。
五、教材参考1. 《酶工程导论》刘旭著，高等教育出版社2. 《现代酶学原理与技术》张三著，科学出版社3. 《酶工程实验指导》李四著，化学工业出版社结语：通过本课程的学习，学生将掌握酶工程领域的基本知识与技能，为今后从事相关研究和工作奠定基础。
同时，使学生对生物技术和工业生产中酶的应用有更深入的了解，并培养其创新思维和解决实际问题的能力。
酶工程实验doc
酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程实验1-2
六、实验作业
1、为什么诱导前需要进行菌种活化？ 2、原核表达基因工程菌的诱导过程。 3、原核表达包涵体形成机制。 4、减少包涵体形成的策略。 5、原核表达后为什么要进行细胞破碎，细胞破碎的 方法及其原理。 6、什么是His-tag和GST-tag？有何作用。
谢 谢 ！ 再 见 ！
三、实验材料与试剂
大肠杆菌pET30a-kerA和pET32a-manA，NaCl ，酵母浸出物，蛋白胨，IPTG等。
四、实验仪器设备
细菌培养箱、细菌振荡培养箱、高压灭菌锅
、电子天平，电炉，量筒等。
五、实验步骤
1、大肠杆菌pET30a-kerA和pET32a-manA的活化 1）、手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5公分） 烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10公分，等待至 接种环完全冷却，将接种环前端轻触甘油保菌液（含大肠杆菌 pET30a-kerA 和 pET32a-manA ），由培养基边缘向中央轻轻 横划紧接的并行线，直到涵盖1/3 培养基为止（І区）。 2）、灼伤接种环，待冷却后，旋转培养基自 І 区涂布的边 缘再横划数条线到未接种的区域（ІІ区）。 3）、重复2的动作完成ІІІ区和ІV区。
二、实验原理
2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一， 就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成 两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。 常用的有温度诱导和药物诱导。 本实验采用异丙基硫代 -β-D- 半乳糖昔 （IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同， 因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而 定。
试验一 原核表达原理及试验前准备
一、实验目的与要求
1、掌握原核表达原理。 2、掌握原核表达的试验前准备工作。
生物大实验2(酶工程实验)
实验一酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
《酶工程与发酵工程》实验课教学大纲
《酶工程与发酵工程》实验课教学大纲课程名称: 酶工程与发酵工程课程编号: 0321013课程性质: 非独立设课课程属性专业课学时学分: 总学时60 总学分3 实验学时20应开实验学期: 三年级第六学期适用专业: 生物工程、生物技术先修课程: 微生物学、分子生物学、生物化学大纲主撰人: 尹清强大纲审核人: 张金钟张玉龙一、实验课程简介《发酵工程》是生物工程的主要组成部分, 是利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业化产品。
通过本课程的学习, 要求学生掌握发酵用微生物的选育、保藏、发酵代谢和发酵工艺的调控, 发酵终产物的提纯及应用。
了解发酵设备的功能及实际操作等基本理论与技术, 了解典型代谢物的生产工艺及产品制备进程。
《酶工程》也是生物工程的组成部分, 是酶生产与应用的技术过程。
其主要任务是通过人工操作, 获得人们所需的酶, 并通过各种方法使酶发挥其催化功能。
通过本课程的学习, 要求学生掌握酶的生产、纯化、分子修饰、固定化和应用的基本理论、基本技术及其最新发展趋势。
二、实验教学目的和基本要求实验教学以学生在实验室实践为主,•发挥学生的主体作用, 教师只做必要的实验原理和注意事项的讲解,并注意引导学生拓展所学的内容。
通过实验课加强学生们对理论知识的认识, 把学到的理论知识融会贯通, 最终达到掌握基本实验技能并培养学生创新能力的目的。
具体要求如下:1. 遵守实验室规则, 爱护实验仪器设备。
2. 实验前要充分预习实验指导, 做好实验记录, 认真完成实验报告。
3．实验操作要细心谨慎, 严格遵守操作规则, 注意安全。
4．实验完毕, 注意关闭灯、电、火、窗等三、实验项目名称与学时分配四、实验方式及基本要求实验方式以小组为单位进行, 使每一个学生都能亲自动手和参与其中。
现场参观和示范性实验, 按班级为单位进行。
培养学生动手能力和理论联系实际的独立思考、综合分析能力。
各实验按不同的实验目的和要求进行, 每个学生在完成每个实验后, 要认真撰写实验报告。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
酶工程教学大纲
《酶工程》课程教学大纲总学时数：30一、课程的地位、性质和任务酶工程（enzyme engneering）是生物技术专业的主干必修课，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术，在生物技术人才培养中处于至关重要的地位。
它涉及细胞工程、基因工程、发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的分子工程。
学生通过酶工程的学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。
二、课程教学的基本要求学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术、酶的分离纯化、固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用，进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。
本课程理论课30学时，于本科三年级第二学期开设。
讲授方式：1．讲授2．利用CAI课件三、各章主要内容、学时分配及教学要求第一章绪论 2学时【单元目标】1．了解酶工程的研究意义；2．掌握酶工程的概念及研究内容。
【授课内容】一．酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史（二）酶工程研究简史二. 酶工程简介1.酶工程2.组成3.分类第二章微生物发酵产酶 4学时【单元目标】1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制2.了解产酶微生物的分离和选育方法3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription) （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 1．翻译2．翻译过程即蛋白质的合成过程二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论（二）酶合成调节的类型1.诱导 (induction)2.阻遏 (repression)（三）酶合成的调节机制三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种2.基因工程育种（二）条件控制第二节酶发酵动力学一、细胞生长动力学（Monod方程）二、产酶动力学(一) 酶生物合成的模式1.生长偶联型2.部分生长偶联型3.非生长偶联型(二) 产酶动力学第三节微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离和选育二、微生物发酵产酶方法1.固体培养2.液体培养3.固定化细胞三、微生物酶的类型1.胞外酶2.胞内酶第三章动、植物细胞培养产酶2学时一、动植物细胞与微生物细胞主要特性差异二、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点、提取法缺点2.培养基特点3.培养方法4.培养条件的影响与控制5.植物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点2.培养基3.培养方法4.培养条件的影响与控制第四章酶的提取与分离纯化 12学时【单元目标】1．掌握酶分离纯化的常用方法及其原理2．掌握几种常用的电泳方法及操作步骤2．了解酶的纯化方案的设计【授课内容】第一节酶的分离4学时一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化(二)发酵液的固液分离二、细胞破碎（一）细胞壁组成（二）细胞破碎的方法（三）细胞破碎确认三、酶的提取(extraction)（一）理想提取液具备的条件、目标原则（二）提取方法四、离心分离（一）基本原理（二）离心机的种类（三）常用离心方法1．差速离心2．密度梯度离心3. 等密度梯度离心又称沉降平衡离心（四）应用五、沉淀分离（根据溶解度的不同）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) （四）有机聚合物沉淀法（五）选择性变性沉淀法六、萃取（extraction）分离（一）溶剂萃取法（二）双水相萃取技术（三）超临界流体萃取（四）反胶团萃取第二节酶的精制5学时一、膜分离技术（一）扩散膜分离（二）加压膜分离（三）电场膜分离二、层析法（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理2.吸附剂3.洗脱剂4.应用（二）凝胶过滤层析)(gel filtration chromatography)1.基本原理2.凝胶的种类和性质3.操作4.应用（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1. 原理2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程3. 操作4. 应用- 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（hydrophobic interaction）1、原理2. 吸附剂3. 操作4. 应用（五）亲和层析(affinity chromatography)1. 原理2. 基质的选择3. 配体的选择4. 偶联（亲和吸附剂的制备）5. 操作及应用(六) 高效（压）液相层析（HPLC：high performance（pressure）liquid chromatography)1. 基本原理2. 分类3. 色谱仪组成第三节电泳一、电泳的基本理论1. 原理2. 电泳的分类3. 电泳常用设备二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1.原理2.分离效应三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 原理2. 操作四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )1. 原理2. 操作3. 应用第四节酶的浓缩、干燥与结晶2学时一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩(二)超滤浓缩(三)吸水剂(四)反复冻融浓缩(五)沉淀法二、酶的干燥三、酶的结晶（一）结晶的条件（二）结晶的方法第五节纯化方案的设计与评价１学时一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（二）纯化方法的排序二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（二）蛋白质浓度测定（三）提纯倍数与回收率第五章酶分子的化学修饰 2学时【单元目标】1．掌握酶活性中心的概念及共性2．了解酶化学修饰的目的及原理3．了解酶化学修饰的种类及应用【授课内容】第一节酶的活性中心一、活性中心的概念二、活性中心的共性三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法2.化学修饰法3.蛋白质工程第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因2.改变酶特性有两种主要的方法3.酶化学修饰的概念二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第四节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性二、修饰剂的选择三、反应条件的选择第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）1．定义2．修饰剂3．应用（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1．定义2．侧链基团修饰剂3．几种重要的修饰反应（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰第六章酶与细胞的固定化 2学时【单元目标】1．掌握固定化酶和固定化细胞的定义及特点2．了解固定化酶和固定化细胞的性质及应用【授课内容】第一节酶与细胞的固定化一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶 (immobilized enzyme)2.固定化细胞（immobilized cell）二、固定化方法（一）酶的固定化方法1.吸附法（adsorption）2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）3.交联法（crosslinking）4.包埋法(encapsulation)（二）各种固定化方法的优缺点比较（三）细胞的固定化方法1.固定化细胞的分类2.固定化方法（四）原生质体的固定化方法第二节固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质二、固定化细胞的性质三、固定化酶（细胞）的评价指标第三节固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1．氨基酰化酶（Aminoacylase）2．葡萄糖异构酶二、固定化酶在医学上的应用1．消血栓2. 人工肾三、在分析检测中的应用1. 酶传感器1）酶传感器的原理2）酶传感器的应用2. 酶联免疫测定第七章酶反应器 2学时【单元目标】1．了解酶反应器的几种类型2．了解酶反应器的设计原理及操作【授课内容】第一节酶反应器的特点与类型一、酶反应器的类型（一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ）（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR)（四）膜式反应器(Membrane Reactor)（五）鼓泡塔型反应器二、酶反应器的发展第二节酶反应器的设计与选择一、酶反应器的设计1.设计目的2.设计原理（依据）二、酶反应器的选择（一）酶的应用形式（二）底物的物理性质（三）反应操作要求（四）酶的稳定性（五）应用的可塑性及成本三、酶反应器的操作第八章酶的应用 4学时【单元目标】1．了解酶在医药方面的应用2．了解酶在食品方面的应用3．了解酶在化工方面的应用4. 了解酶在环境保护方面的应用5. 了解酶在生物技术领域的应用【授课内容】第一节酶在医药方面的应用第二节酶在食品方面的应用第三节酶在化工方面的应用第四节酶在环境保护方面的应用第五节酶在生物技术领域的应用四、使用教材与主要参考书目录1教材《酶工程》（第二版）作者：郭勇科学出版社 20042 主要参考书目郭勇现代生化技术，华南理工大学出版社， 1996郭勇酶的生产与应用，化学工业出版社个，2003罗贵民酶工程，化学工业出版社，2002张树政酶制剂工业，科学出版社，1984邹国林酶学，武汉大学出版社， 1997五、考核方法和成绩构成本课程为考试考核，包括两部分：期中及平时为30%，期末70%。
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湖北大学酶工程实验（0818800193）实验教学大纲（第2版）生命科学学院生化教研室2014年7月前言课程名称：酶工程实验实验学时：16学时适用专业：生物工程课程性质：必修一、实验课程简介酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
二、课程目的本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。
四、实验指导书及主要参考书1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。
2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月五、实验项目实验项目一览表（可选）实验类型：演示性、验证性、综合性、设计性、其它实验一双酶法制备淀粉糖（3课时）一、实验原理目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。
双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。
α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。
糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。
且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。
二、实验步骤1．液化：准确称取50g生粉，加150mL水（pH 6.0～6.4，HCl)配制成40％的淀粉浆，加入0.1gCaCl2，加入0.7gα-淀粉酶，在75℃温度下保温40min左右，使淀粉液化成糊精。
液化反应过程中用碘反应检测，至颜色变为黄棕色时，即为终点。
升温至100℃并保温10min。
2．糖化：将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.12g 糖化酶，将水浴槽温度升至60土2℃，保温糖化16h，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。
3．脱色：在淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌30min后，滤去活性炭，得无色透明糖液。
4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。
用3,5-二硝基水杨酸法测定。
三、实验结果：测定所得无色透明糖液中葡萄糖的浓度。
四、仪器和试剂1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。
2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。
1mol/L HCI、无水CaCl2、。
碘液、活性炭。
实验二、不同浓度果胶酶澄清苹果汁效果、对收得率的影响（4课时）实验类型：验证性实验目的：通过实验掌握酶在食品工业上的基本应用，果胶酶作用的基本原理和果汁生产的基本工艺与过程。
实验内容：1．制备苹果汁：将苹果洗净，切成小块，用榨汁机打碎成果汗匀浆。
加热苹果汁到100℃使酶钝化后，再冷却至50℃左右。
2．配制不同浓度的酶液：取5支10mL的刻度试管，依次编为2号~6号。
分别加入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL质量浓度为10g/L的果胶酶溶液，再分别加入苹果酸定容至10mL，依次配制质量浓度为2，4，6，8，10g/L的果胶酶溶液备用。
（实验老师已配好）3．降解苹果汗：取6个号烧杯，向1号烧杯加蒸馏水1mL，向2号~6号烧杯分别加入1mL质量浓度为2，4，6，8，10g/L的果胶酶溶液。
再向6只烧杯中均加入4mL蒸馏水，摇匀，然后都加入95mL经钝化的苹果汁，45℃水浴中恒温60min。
4．沉淀：向上述6只烧杯中均添加明胶约0.02g，硅溶胶约0.1mL，膨润土约0.20g，活性炭约0.05g处理，添加顺序为：明胶等主要起吸附、沉淀和过滤作用。
所用物品符合食品安全要求。
充分混匀后静置60min，使其充分沉淀后过滤。
过滤进先用纱布初滤，并挤干，所得初滤液再抽滤。
5．记录结果观察6个样品滤液的澄清度，用量筒测量澄清滤液（即苹果汁）的体积，将结果填入下表。
不同酶浓度下苹果汗收得率澄清效果苹果汗体积（mL）澄清苹果汁收得率（%）实验要求：总结不同果胶酶浓度下苹果汁的澄清效果，并观察使苹果汁获得最高收得率时所需的果胶酶浓度。
分析所出现的实验结果的原因，并回答相应的实验思考题。
实验三、实习参观细胞发酵罐细胞培养产酶（1课时）实验类型：演示性实验目的：了解产酶的细胞发酵罐的基本结构，掌握细胞发酵产酶时的工艺条件及进行相关调控的基本原理和方法。
实验内容：参观发酵罐及其配套的空压机、蒸汽机、发酵罐调控主机，了解各个设备的主要功能。
熟悉发酵罐的运行的基本操作，对pH、溶氧、温度、搅拌速度等重要参数动手进行设定、调节。
掌握发酵罐的基本结构，内部组成、有关的通气、通水等管道走线的构造、规律等。
主要设备器材：江苏大学产自动控制发酵罐及配套蒸汽机、空压机。
实验要求：了解发酵罐的基本结构，有关的通气、通水等管道走线的构造、规律，掌握有关发酵罐运行时有关参数的设定、检测及调节的方法，对利用细胞发酵罐进行细胞培养用以产酶的流程有大致的了解。
实验四、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及测定（3课时）实验类型：综合性实验目的：掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力、Km值测定的基本原理和基本操作。
实验内容：1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。
（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。
（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。
纱布过滤，滤液在4℃，3500r/min下离心8~10min，倾出上清液，计量体积。
取1mL酶液保存，供测酶活力用。
2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9。
置4℃10分钟。
（2）4℃3500r/min离心10min，沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为脲酶粗品。
称重，计算酶收得率。
3．脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物，吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活力大小。
实验要求：提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算：1）提取制备脲酶的收得率：样品重酶液总体积测酶活留取液体体积酶干重酶干重酶收得率%100 /(%)⨯+=2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数实验五、尼龙固定化木瓜蛋白酶（5课时）实验类型：综合性实验目的：通过实验掌握酶固定化的基本原理，学习酶固定的基本方法和了解固定化酶在实际中的应用及固定化酶活力回收率及相对活力的测定。
实验内容：1．固定化酶的制备（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。
取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。
（2）将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性。
（3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。
（4）取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5~1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
（5）从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
2．酶活力测定（1）溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL 终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位（U）（以下同）。
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
实验要求：使用交联法用尼龙固定木瓜蛋白酶，计算测定尼龙固定的木瓜蛋白酶的活力及固定效率。
结果计算：活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力×100%；相对活力=固定化酶总活力数/溶液酶总活力数—残留酶活力数。
实验六、酶工程的设计实验与考查（3课时）实验类型：设计性实验目的：学生根据酶工程课程所学知识和前几个实验所掌握的内容，自己查找资料，设计一个酶的相关实验。
让学生自己动手动脑，进行设计性或创新性实验，锻炼学生的综合、创新能力。
实验内容：学生在实验室现有的条件和合理的经费预算下，根据酶工程理论课所学的知识和范围，自己设计实验内容与过程。
实验要求：根据所学课程知识，设计出与酶工程相关的合理、可行的实验方案，列出详细的实验步骤，配置实验相关的试剂，独立进行实验操作，记录实验过程及结果数据，并分析出现所得实验结果的原因，讨论所设计的实验相应的完善方案。