高密度培养
第二章 流加发酵与高密度培养
微生物的高细胞密度培养
概述
发酵研究和工业的一个主要目标是使 体积生产率（g/L•h）最大化，即在 给定体积中和一定时间内获得尽可能 多的产品数量。 高细胞密度培养是高生产效率的要求。 历史上，高细胞密度培养首先建立在 酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇 和菌体。
概述
后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生 产各种类型产品。 甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸 的高效生产。 如今，微生物的高细胞密 度培养的范畴已包括细菌、 古细菌和真核生物（酵母）。
温度的影响
把培养温度从 37 ℃降到 26 －30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。 降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题
二氧化碳和放热的影响
HCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。 高CO2分压（>0.3atm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。
放热也是高细胞密度培养的一个问题。
热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。
这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。
HCDC遇到的问题
HCDC中各种微生物的最大细胞密度
微生物 细菌 Methylobacterium extorquens Escherichia coli DCW（g/l） 233 190 180 148 145 184 184 157 141 100 132 114 268 208 235 100
概述
Bacillus subtilis Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599 Streptomyces laurentii Lactococcus lactis Pseudomonas putida BM01 古细菌 Marinococcus M52 Sulfolobus hibatae 真核 Candida brassicae Saccharomyces serevisiae Pichia pastoris
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
第二章-流加发酵与高密度培养
流加发酵
所 谓 流 加 发 酵 ， 即 补 料 分 批 发 酵 (Fedbatch fermentation)，有时又称半连续培 养或半连续发酵，是指在分批发酵过程 中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方法
分批、连续、流加操作方式的比较
分批发酵 连续发酵
流加发酵
优点 1.一般投资较小 2.易转产、生产灵活 3.分批操作中某一阶段可获得高的 转化率 4.发酵周期短，菌种退化率小 1.可实现有规律的机械、自动化 2.操作人员少 3.反应器体积小、非生产时间少
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的
几点假设如下： (a) 发酵罐内为理想混合； (b) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常 数； (d) 菌体生长遵循Monod方程。
对底物葡萄糖进行衡算，则：
d(VS ) dt
FS0
(
Yx / s
ms ) VX
F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓 度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)， ms 为细 胞比维 持系数 (g/g/h) ， X为菌体 浓度 (g/L)，V为培养液体积(L)，μ为菌体比生长速 率(h-1)。
1. 流加发酵类型
流加发酵的分类
类别
流加方式
无反馈控 制
反馈控制
恒流量流加、变流量流加和间歇流加
直接控制流加、间接控制流加 定值控制流加、程序控制流加、最优控制流 加
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加 葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油 脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
高密度培养裂壶藻的方法
高密度培养裂壶藻的方法
1.准备培养基：将适量的碳源（如糖、淀粉等）、氮源（如硝酸盐、磷酸盐等）、微量元素（如钙、镁、锌等）混合溶解，加入适量的硫酸钠，调节pH值至7.0，加入适量的抗生素，搅拌均匀，即可得到培养基。
2.接种：将裂壶藻细胞悬浮液加入培养基中，搅拌均匀，放入培养箱，控制温度为25℃，光照强度为100μmol/m2/s，湿度为80%，接种后24小时即可观察到细胞的增殖。
3.培养：每隔24小时，将培养基更换一次，以保持培养基的新鲜，控制细胞的增殖，使细胞达到高密度。
4.收获：当细胞达到高密度时，可以将细胞收集，用离心机将细胞分离，然后用适当的消毒剂处理，即可得到高密度培养的裂壶藻细胞。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。
单位：细胞干重/升（DCW/L）。
凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。
定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。
用途[1]各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。
发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。
但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。
谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。
迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。
第二章-流加发酵与高密度培养
4.对 发 酵 过 程 可 实 现 优 化 控 制 5.因 经 常 灭 菌 会 降 低 仪 器 使 用 寿 命
（1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d(XV) XV
dt
d(dStV )XVSFF d(PV) XV
dt
dV F dt
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值 (最大值)原理等
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个 问题
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
4. 合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
温度的影响
把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题
流加控制策略
Streptomyces laurentii Lactococcus lactis
Pseudomonas putida BM01 古细菌
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
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高密度培养
应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。
基本信息
中文名高密度培养
发展基础基因工程菌生产多肽类药物
应用领域生物制药
代表人生长激素
技术介绍
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。
例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。
具体方法
（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。
（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。
（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。
（4）防止有害代谢产物的生成。
高密度培养过程中培养基成份及作用：
根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。
一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。
有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。
当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。
在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。
然而。
半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。
碳源
Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。
还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。
除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。
培养基中的碳源浓度相当重要。
如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。
使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。
葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较小，而葡萄糖所产生的副产物较多。
用甘露
糖作碳源时，不产生乙酸，但比生长率和呼吸强度较小。
对tac启动子的表达系统，使用乳糖作碳源较有利，乳糖同时起诱导作用，葡萄糖对lac启动子有抑制作用，原因有：(1)降低胞内cAMP水平，(2)诱导物排外作用。
采用流加措施，控制培养液中葡萄糖浓度在低水平，可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。
氮源
氮源的作用主要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源主要是一些含氮有机物的水解产物，含有丰富的氨基酸、小肽和其他营养物，其中的氨基酸和其它一些小分子有机物可被工程菌直接利用，而不需要再从糖代谢的中间代谢产物合成了，因而对工程菌的生长和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培养中被广泛使用，但有机氮一般价格较高，而且，工程菌对有机氮源中各成分的利用是不均衡的，因而过量使用会使某些成分发生积累，产生抑制作用或影响后续纯化工作。
常用的有机氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆等。
无机氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、铵盐等。
无机氮源的优点是价格低廉且成分确定，易于按需补加。
其中氨水在工程菌培养过程中还可同时起到调节pH的作用。
无机盐和维生素
工程菌培养基中所需的无机盐主要为磷酸盐、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的盐类，其作用是提供菌体生长所需的各种元素，同时还有维持渗透压和控制pH的作用。
大多数工程菌都能合成所需的各种维生素，可以在不含有维生素的培养基中生长，但在培养基中含适量的维生素往往对菌体的生长是有利的，而有些工程菌的宿主菌为维生素营养缺陷型，这些菌的培养基中必需含相应的维生素。
酵母提取物、玉米浆等有机氮源中含有丰富的无机盐和维生素，因而当培养基中含有较高浓度的上述成分，且菌密度较低时，除加入20-100mmol/L的磷酸盐用于维持pH和渗透压外，不需另外补加无机盐和维生素。
但当培养基中不含有机氮源或培养的菌密度较高时，则应考虑补加无机盐和维生素。
对一个合适的发酵培养基，上述各成分的量应以满足或略多于菌体生长和产物合成所需为度，不宜过多加入，以免产生抑制效应和浪费原料，另外各成分的配比也很重要，以利于菌体均衡利用各成分。
表1.1为基本培养基中一些主要营养元素的得率系数，表1.2为一些营养成分产生抑制效应的浓度。
但对每个工程菌，其发酵培养基最终应通过实验筛选。
任何发酵培养基的优化是一个高强度劳动的过程，需要实验大量的营养化合物种类及其浓度。
工程菌高密度培养基设计原理如下：（1）使用基本培养基以便精确设计营养成分之间的定量关系，同时避免任何不利于细菌生长的营养限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻断细菌对数生长期间抑制性代谢产物的合成；（3）依据细菌细胞的元素组成确定培养基各成分的精确配比。
培养基中的碳氮比（C/N）是相当重要的，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌体则会生长缓慢，产率下降。
即使碳氮比合适，浓度的大小也会影响菌体的生长。